Abstract

células-tronco cancerosas contribuir para os fenótipos malignas de uma variedade de cancros, mas marcadores para identificar câncer de hipofaringe humana (HPC) as células estaminais permanecem pouco compreendidos. Aqui, nós relatamos que o CD271

+ população classificados do HPCs xenotransplantadas possui uma capacidade de iniciação tumor reforçada em ratos imunodeficientes. Tumores gerados a partir do CD271

+ células continha tanto CD271

+ e CD271

– células, indicando que a população poderia sofrer diferenciação. As análises imuno-histológica de tumores revelou que a CD271

+ células localizadas a um nicho perivascular perto CD34

+ vasculatura, para frentes invasivos, e para a camada basal. De acordo com estas características, um marcador stemness,

Nanog

, e

metaloproteinases de matriz (MMP)

, que estão implicados na invasão câncer, foram significativamente up-regulamentada no CD271

+ em comparação com o CD271

– população de células. Além disso, usando amostras de HPC primários, demonstramos que a alta expressão de CD271 foi correlacionada com um prognóstico pobre para os pacientes. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que CD271 é um novo marcador para HPC células-tronco semelhantes e para o prognóstico HPC

Citation:. Imai T, Tamai K, Oizumi S, Oyama K, Yamaguchi K, Sato I, et ai. (2013) CD271 Define um celular-Like Stem População em hipofaringe. PLoS ONE 8 (4): e62002. doi: 10.1371 /journal.pone.0062002

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de dezembro de 2012; Aceito: 17 de março de 2013; Publicação: 23 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Imai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por números JSPS KAKENHI subvenção 24300326, 21791589, 24592613, JST crista, e subvenções-in-Aid do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar, ea fundação Takeda Medical, a fundação Ichiro Kanehara. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, com cerca de 500.000 novos casos e um número estimado de 300.000 mortes reportados a cada ano. Este termo inclui vários cancros independentes, tais como oral, nasofaringe, orofaringe, hipofaringe e cancros [1]. hipofaringe (HPC), um tumor maligno da hipofaringe, é responsável por aproximadamente 10% de todas as HNSCCs. Estudos epidemiológicos indicam que o tabaco eo consumo de álcool contribuem para a sua carcinogênese [2]. Infelizmente, cerca de 80% dos casos de HPC são avançados no momento do diagnóstico, isto é, os pacientes estão em fase III ou IV [3], assim que o tratamento é difícil. A cirurgia radical, tais como o total de resultados laryngopharyngoesophagectomy na perda da voz, e quimioradioterapia concomitante muitas vezes provoca efeitos colaterais potencialmente fatais. Atrasada regionais metástases em linfonodos, metástases à distância, e adicionais neoplasias primárias ocorrem frequentemente durante o curso da doença [3]. A taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes HPC há [4], o que sugere uma forte necessidade de estratégias de tratamento inovadoras.

As evidências acumuladas dos últimos anos apoia a célula-tronco do câncer (ou iniciar celular) mais de 30% teoria [5], [6]. Neste cenário fascinante, cancros são compostas de uma hierarquia de populações de células heterogéneas, e são iniciadas a partir de uma sub-população limitada de células com propriedades semelhantes a células estaminais. Com a sua actividade auto-renovação e capacidade de iniciação do tumor, as células-tronco cancerosas (CSCs) ou câncer de iniciar células (CICs) gerar células-tronco não-cancerosas como uma população ‘Offspring’. A resistência a quimioterapia e a radioterapia é outra característica de CCC. Assim, CSCs podem ser responsáveis ​​por falhas no tratamento de quimioterapia e radioterapia, e os resultados clínicos pobres. Com o objetivo de desenvolver novas terapias CSC-alvo, os pesquisadores têm procurado identificar e caracterizar marcadores de superfície celular para CSCs.

Em HNSCC, CD44

+ células foram identificadas como CSCs. Quando as amostras cancerosas clínicos são xenoenxerto em ratinhos imunodeficientes, CD44

+ células, mas não CD44

– células iniciar tumores, e os tumores resultantes gerar uma hierarquia de populações de células heterogéneas [7]. No entanto, um estudo recente mostrou que CD44

– células formam esferas, possuem capacidade de iniciação do tumor, e são resistente à quimioterapia, como CD44

+ células [8]. Assim, o CSCs podem ser dinâmico e heterogêneo em vários microambientes [9], eo CD44

+ células podem não representar CSCs CECP puros. Além disso, a própria HNSCC é heterogénea, representando vários tipos de cancro, tal como descrito acima. Por conseguinte, por objectivo a investigação para cada tipo de cancro pode levar à identificação de marcadores adicionais CSC.

CD271 é uma proteína transmembranar que pertence à superfamília do receptor do factor de necrose tumoral. É também um receptor do factor de crescimento do nervo (NGFR), e interage com as neurotrofinas, tais como NGF, factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT3) e neurotrofina-4 (NT4), com baixa afinidade [10 ]. Estudos anteriores sugerem que as células-tronco de tecidos de oral [11], laringe [12], e esofágica [13] epitélio escamoso expressar CD271. CD271 também está associada com o CSCs de melanoma maligno [14], [15] e carcinoma epidermóide de esôfago [16].

No presente estudo, demonstramos que a CD271

+ população de células de HPC possui capacidade de iniciar tumor

in vivo

, e tem várias características CSC-like.

Materiais e Métodos

tumor Implantação

Depois de obter o consentimento informado, amostras de tumor frescas foram obtidas no Cancer Center Miyagi (MCC), transportadas para o laboratório em PBS arrefecido (-), e sujeito a mais análises. Todas as amostras de tumor foram anónimos de acordo com o MCC Institutional Review Board. NOD /SCID /IL-2RγC

nula (NOG) ratos comprados do Instituto Central de Animais Experimentais Japão foram anestesiados com pentobarbital. Uma vez que os ratinhos tinham adormecido, incisões na pele foram feitas, e pequenos pedaços de tumor de cerca de 50 mm de espécimes

3 foram implantados sob a pele do flanco em ambos os lados. a formação de tumores foi monitorizado semanalmente, e o volume do tumor foi calculado pela fórmula: 1/2 × intervalo vertical × intervalo horizontal x altura. Quando os tumores originais nos ratos NOG xenotransplantadas atingiu mais de 10 mm de diâmetro, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram divididos em amostras de digestão de uma única célula, a formação de esfera, a fixação em formalina para histologia, ou passagem em série em murganhos. O cuidado com os animais e os protocolos experimentais foram realizados em estrita conformidade com os procedimentos e diretrizes estabelecidos pelos painéis administrativos do MCC para cuidados com animais de laboratório. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Preparação de uma única célula suspensões de Tecido Tumoral espécimes

Sob condições assépticas, os tumores foram cortados em pequenos fragmentos, e finamente picada com um bisturi estéril. Depois de ter sido lavada com PBS (-), o tecido tumoral foi embebida numa solução contendo PBS (-), 1 mg /ml DNase1 (Roche), e 1 mg /ml de colagenase /Dispase (Roche), e incubou-se a 37 ° C durante 2 ou 3 horas, até que tivesse ocorrido a digestão completa. As células foram passadas através de uma malha de nylon de 40 um, e lavou-se 3 vezes com PBS (-). Após centrifugação, o conjunto de células isoladas foi dividida, e as células foram usadas para análise FACS ou cultura esfera. Para a cultura de esfera, as células foram suspensas em livre de soro de DMEM /F12 suplementado com B27 (Invitrogen), factor de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF: 20 ng /ul: Peprotech), e factor de crescimento de fibroblastos básico humano (bFGF: 20 ng /. l: Peprotech) em pratos ultra-baixa cultura anexo (Corning)

Fluxo de Análise de Citometria e separação de células

células únicas dissociadas foram suspensas em PBS (-) com 3% de FBS. As células foram coradas com anticorpos anti-humanas específicas EpCAM (1:10, conjugado com FITC, Miltenyi Biotec), anticorpos CD271 anti-humano (1:10, a APC-conjugado, Miltenyi Biotec), anticorpos CD44 anti-humano (1: 10, anticorpos CD133 anti-humano de APC-conjugado, Becton Dickinson), (1:10, anticorpos de controlo de isotipo k-APC conjugada, Miltenyi Biotec), e rato anti-IgG1, (1:20, e APC conjugada com FITC, BioLegend e Becton Dickinson, respectivamente). 7-AAD foi usada para excluir as células mortas (Sigma, 1 ug /ml). As células coradas foram analisadas quer com uma FACSCanto ™ II (Becton Dickinson) ou com um classificados ™ II FACSAria (Becton Dickinson), em conformidade com o protocolo do fabricante.

em tempo real transcrição reversa (RT) -PCR

O RNA total foi purificada a partir de células individuais ordenados ou amostras de tecido usando um kit de isolamento Mirvana ™ miRNA (Ambion), e transcritos usando um Kit PrimScript II cDNA Synthesis (Takara Bio). Em tempo real de RT-PCR foi realizada utilizando Brilhante III ultra-rápida QPCR SYBR Green Master Mix (Agilent Technologies).

GAPDH foi usada como um gene de referência endógena. As sequências dos iniciadores utilizados para o tempo real de RT-PCR estão listadas na Tabela S1.

A imuno-histoquímica (IHC)

incluídos em parafina, fixados em formalina, as secções de tecido 3-um foram desparafinizadas em xileno , e re-hidratadas por meio de etanol para água destilada. recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada por microondas secções numa solução de recuperação de pH 9,0 alvo (Dako). A peroxidase endógena foi bloqueada com 0.3% H

2O

2. As secções foram incubadas com anticorpos primários para CD271 humano (1:4000, BD Biosciences) durante 20 min, ou a CD34 (Nichirei Biosciences) ou Ki-67 (1:10, Santa Cruz Biotechnology), durante 60 min, a 37 ° C . Os cortes corados para CD271 foram incubadas durante 15 min com LIGANTE rato (Dako), em seguida, anticorpos secundários e cromogénio DAB (Envision Kit ™ FLEX, DAKO) foram aplicados como descrito no protocolo do fabricante. Para as secções coradas para CD34 ou Ki-67, simples mancha AP (H) (Nichirei Biosciences) foi aplicado como anticorpo secundário, e a mancha foi visualizado com nova fucsina Substrato (Nichirei Biosciences). Para a dupla marcação de CD34 ou Ki-67, com CD271, CD34 ou o Ki-67 de coloração foi realizada em primeiro lugar, seguido pelo que, para CD271, tal como descrito acima.

In vivo

Tumorigênese ensaio

tumores dissociadas foram classificadas com base na EpCAM e CD271 expressão humana, como EpCAM

+ CD271

+ células ou EpCAM

+ CD271

– células. As células separadas foram suspensos em 200 ul de Matrigel matriz (BD Biosciences) a 4 ° C, em seguida injectada subcutaneamente nos flancos de ratos NOG com uma seringa de 1 ml. Cada rato recebeu CD271 células

+ no lado direito, e CD271

– células na esquerda. a formação de tumores foi monitorizado por inspecção e palpação semanal.

In vivo

Quimioterapia Ensaio

A cisplatina (CDDP), um fármaco anti-cancro classificado como um reagente de platina, foi administrado intravenosamente ou intraperitonealmente a 5 ou 7,5 mg /kg. Uma semana mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram extraídos. Os tumores foram divididos e quer fixado com formol para IHC, ou dissociadas em células isoladas e submetidas a análise FACS.

Estatísticas

Foram realizadas as análises de sobrevida específica de doença e sobrevida livre de recidiva com os métodos de Kaplan-Meier, eo teste de log rank foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos. O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar dois grupos ( “fortes” versus expressão CD271 “moderado a fraco”) em tumores ressecados de 28 casos de HPC, eo teste do qui-quadrado foi utilizado para comparar os mesmos dois grupos no IHC estudo de 83 casos de HPC. Os valores médios de

expressão Nanog

entre os dois grupos foram analisados ​​com o teste t de Student. O nível de significância foi estabelecido em

p

. 0,05

Ética

O Conselho de Administração do MCC Institutional Review aprovou este protocolo do estudo e consentimento informado por escrito foi obtido a partir cada sujeito. O protocolo de experiências com animais foi aprovado pelo Comité de MCC animal Cuidado e Uso (Permit Number: MCC-AE-2011-8).

Resultados

Os tumores HPC Incluir uma subpopulação de CD271

+ células

Para investigar iniciação do tumor e as células-tronco do câncer, frescos amostras de tumores primários obtidos de pacientes submetidos a cirurgia de HPC foram implantados sob a pele de ratos NOG 8-10 semanas de idade. Três amostras de HPC humanos independentes, com características clínicas semelhantes foram usados ​​para estabelecer linhas de xenotransplante primários (HPCM1-3) (Tabela S2). A histologia de cada xenoenxerto foi consistente com a sua primeira amostra (Figura S1).

Para caracterizar as linhagens tumorais xenotransplantadas série, foi analisada a expressão do marcador da superfície celular. Cada tumor foi extraído a partir do hospedeiro e preparado como uma suspensão de célula única. Porque EpCAM é relatado para ser um marcador de células tumorais para o diagnóstico HNSCC [17], as células-EpCAM positiva humanos foram estritamente fechado para eliminar células derivados do hospedeiro, e analisadas por citometria de fluxo. Entre os marcadores CSC testadas, as células foram negativas para CD133, e 3,4% das células tumorais foram positivas para CD44 (dados não mostrados). Inesperadamente, observou-se uma CD271

+ subpopulação entre as três linhas de HPC testados (Figura 1A). Em experiências repetidas, a CD271

+ população representada 2,99-20,1% das células em HPCM1. Similar CD271

populações + foram claramente presente nas outras duas linhas: 2,90-9,54% para HPCM2 e 19,1% para HPCM3. Em seguida, analisou-se secções embebidas em parafina de tumores derivados das linhas de HPC xenotransplantadas de CD271 por IHC (Figura 1B). Dentro dos carcinomas de células escamosas típicas formadas pelas três linhas, CD271

+ células foram principalmente presente na camada basal do tumor, quase restrita para a zona periférica do ninho do tumor, e escassas na porção central (Figura 1B) . Sob alta ampliação, foram observadas

+ células CD271 ao lado do estroma (figura 1B-d). Estes

células CD271 + exibiu fenótipos morfologicamente imaturos, enquanto que a CD271

– as células na zona central do ninho tumor tinha mais maduro, achatada, e formas queratinizadas (Figura 1B-e). Para caracterizar ainda mais a localização de CD271

+ células dentro do HPC, nós manchado citoqueratinas (CKs) em cortes seriados (Figura S2). CK5 /6 tende a localizar a camadas basais e proliferam compartimentos suprabasais, eo CD271

+ células foram localizados dentro da região CK5 /6-positivo. O CD271

+ células também foram moderadamente positivo para CK8, que marca células indiferenciadas SCC. Estes resultados sugerem que a CD271

+ população é incluída na porção da camada basal de área /6-positiva a CK5, e parcialmente se sobrepõe com as células indiferenciadas Ck8-positiva.

(A) células derivadas três linhas de HPC xenotransplantadas foram coradas para CD271 e analisadas por FACS. tecidos (B) Tumor dissecados a partir de ratinhos transplantados com as três linhas de HPC foram analisadas quanto à expressão CD271 por IHQ. Imunopositividade aparece castanho (a, b, e c). Imagens de alta ampliação estão ligadas a suas respectivas áreas encaixotados por setas. Barra de escala: 100? m. linha vermelha indica a fronteira do tumor e estroma (d). linha vermelha indica a fronteira de um CD271

+ grupo de células e CD271

– células e setas vermelhas e azuis mostram CD271

+ células e CD271

– células, respectivamente (e). (C) Os resultados representativos de IHQ para CD271 em amostras clínicas. mucosa normal (a), carcinoma

in situ

. (B). As setas indicam uma frente invasiva, e de expressão fortemente positiva CD271 (c, d). (D) IHC para CD34 com substrato nova fucsina (a), e coloração dupla para CD34 (nova fucsina) e CD271 (DAB) (b-e). CD34 imunopositividade aparece vermelho. Inserções mostram imagens de alta ampliação das áreas em caixa. setas vermelhas indicam microvasos CD34 positivas, e pontas de seta indicam marrom CD271

+ células. células de HPCM1, e expressão de CD271 elevada na análise de FACS (E) Esfera de formação. Barra de escala: 25 ^ m. (F) IHC para a dupla marcação de Ki-67 (nova fucsina) e CD271 (DAB). Ki-67 imunopositividade aparece vermelho no núcleo. setas vermelhas indicam células Ki-67-positivas. Barra de escala:. 100 mm

Nós também examinaram a expressão CD271 dentro espécimes HPC clinicamente dissecados. Em primeiro lugar, constatou-se que CD271

+ células estavam presentes na camada basal da mucosa mais hipofaringe normal (Figura 1C-A). Da mesma forma, em um carcinoma

in situ

(

CIS

) espécime, CD271

+ células foram restritas à camada basal e estavam ausentes das camadas superiores mais diferenciados (Figura 1C- b). Tipicamente, a maioria das células cancerosas localizadas na frente invasiva foram CD271

+ (Figura 1C-c, d). Nós também examinou se CD271

+ células foram localizados perto da vasculatura dentro dos tumores. Descobrimos que CD34

+ células endoteliais microvasculares (vermelho na Figura 1D) foram localizados no CD271

+ áreas celulares e imagens ampliadas mostrou que alguns CD34

+ e CD271

+ células estavam perto cada outras, ou em contacto directo (Figura 1D-a, b). É de notar, na maior parte dos espécimes, o CD271

+ células formaram aglomerados densos que foram rodeadas por estroma, que continham células CD34

+ microvasos (Figura 1D-c, d, e). Juntos, estes dados indicaram que CD271

+ células estão presentes na frente invasiva e na região perivascular do tumors.It é bem conhecido que as células de vários cancros, incluindo carcinoma epidermóide, que as esferas se formam em condições de cultura de suspensão incluem CSCs [18 ]. Por isso, nós examinamos se a cultura esfera-formação poderia afetar a expressão CD271. esferas dissociadas células cancerosas gerados que sobreviveram durante 12 dias, e as células individuais preparados a partir destas esferas foram sujeitas a análise de CD271 (Figura 1E). CD271 foi expressa em 46,5% destas células, em contraste com o tumor de células HPCM1 original, em que 2,99-20,1% das células eram CD271

+. Este resultado sugeriu que

in vitro

esfera formação causado o enriquecimento de CD271

+ células.

Nós também examinou se a CD271

+ células são uma população em proliferação. experimentos -staining duplos com Ki-67 e mostraram que a CD271 CD271

+ células principalmente residido na camada basal, enquanto que as células Ki-67-positivas localizadas principalmente para as camadas suprabasais relativamente diferenciadas (Figura 1F). Estes resultados sugerem que a CD271

+ células não estão a proliferar activamente

in vivo

.

CD271

+ As células são Oncogenia e diferenciar

in vivo

a seguir, examinou o

in vivo

tumorigenicidade do CD271

+ células das três linhas de HPC. Trinta a 100.000 CD271

+ ou CD271

– células foram injectadas subcutaneamente em cada lado do mesmo rato para evitar quaisquer diferenças ambientais /hospedeiras (Figura 2A). A precisão da classificação foi confirmada por análise de FACS (Figura 2B). Os resultados xenotransplante estão resumidos na Tabela 1. Em HPCM1, o CD271

+ células iniciados tumores a uma taxa extremamente alta, mesmo quando menos de 300 células (mas pelo menos 30 células) foram injectados. Trinta CD271

– células gerado um tumor em apenas uma das seis vacinas, eo tumor que se formou foi muito menor do que aquelas iniciadas pelo CD271

+ células (Figura 2C). Da mesma forma, para HPCM2, todos os tumores que se formaram, com exceção de um, surgiu a partir de CD271

+ células. Embora o CD271

– células em tumores HPCM3 gerados, eles mostraram uma latência mais longo e menor freqüência do que aqueles que se desenvolveu a partir de CD271

+ células. Estes dados indicam que a CD271

+ células possuíam maior tumorigenicidade do que o CD271

-. Células

in vivo

(A) tumores representativos em ratos em que o número indicado de As células foram transplantadas. setas vermelhas indicam CD271 locais

+ injeção de células (lado direito), e setas azuis indicam CD271

– locais de injecção de células (lado esquerdo). Círculos e círculos tracejadas indicam locais de transplante, resultando em sucesso eo fracasso de formação de tumores, respectivamente. (B) A citometria de fluxo análise das células classificadas (96.8~99.5% CD271

+ ou CD271

– células). (C) Trinta CD271

+ células (lado direito) e CD271

– células (lado esquerdo) foram transplantadas para um rato, e os tumores gerados foram ressecados. O crescimento do tumor foi traçada usando o valor médio. (D) A citometria de fluxo de análise da expressão de CD271 de células tumorais resultantes da injecção de CD271

+ células. secções de tumor foram coradas com hematoxilina e eosina (H E). Barra de escala:. 100 mm

Morfologicamente, o CD271

+ células formaram tumores que se assemelhavam a original histologicamente, com características típicas SCC: morfologia celular como basal na zona periférica , e as células diferenciadas na porção central do ninho de tumor (Figura 2D). Os tumores gerados também foram examinados para a expressão de CD271 por citometria de fluxo. Os tumores resultantes da CD271

+ células continha tanto CD271

+ e CD271

– células (Figura 2D). Assim, o CD271

+ população tem potencial para gerar uma hierarquia de CD271-expressão e células, bem como a capacidade de iniciar o cancro que não expressam.

Gene Expression perfil de CD271

+ células revela algumas características de stemness e invasão

a seguir, perguntou se o CD271

+ população tinha características associadas com células malignas em termos de stemness e invasão /metástase. Em primeiro lugar, a expressão de genes relacionados a células-tronco pluripotentes,

Nanog

,

Sox2

, e

Oct-4

foi examinada. A análise em tempo real de RT-PCR indicaram que o

Nanog

expressão foi significativamente mais elevada no CD271

+ células de três linhas de HPC em que a CD271

– células (Figura 3A). IHC de cortes seriados mostraram a inclusão de CD271

+ células da camada basal Nanog-positivo (Figura S3A). No entanto, a expressão de

Sox2

e

Oct-4

mostrou nenhuma tendência consistente (Figura S4). Em seguida, a expressão de três genes relacionados com a invasão do tipo de secreção,

MMP1

,

MMP2

, e

MMP10

foi examinada (Figura 3B). CD271

+ células das três linhas de HPC mostrou uma elevação acentuada no

MMP1

, que variou 2,3-7,3 vezes em comparação com o CD271

– células. Da mesma forma,

MMP2

aumentou 3,6-4 vezes nos

células CD271 +. Proeminente

MMP10

sobre-regulação foi visto no CD271

+ população de HPCM3, a um nível que foi mais de 40 vezes maior do que no CD271

– células. Em seguida, realizada a coloração IHC série de MMP1, MMP2, e MMP10, e descobriu que a CD271

+ células foram positivas para estas MMPs (Figura S3B). Os níveis de mRNA para

MMP9, MMP11 e MMP14 (MT1-MMP)

variada entre as linhas celulares, com duas linhas dos três exibindo aumento expressões de cada MMPs (Figura S5). Considerando a localização de CD271

+ células em frentes invasivos, estes resultados sugerem que a CD271

+ células estão armados com MMPs que permitem a invasão de tecidos por quebrar a matriz extracelular.

Nanog

expressão (a) e

MMP1

,

MMP2

, e

MMP10

expressão (B) na CD271

+ e CD271

– células derivadas a partir das três linhas de HPC foram analisados ​​por em tempo real de RT-PCR. Os níveis de transcrição foram normalizados para os de

GAPDH

, e a mudança vezes no nível de expressão de MMP em CD271

+ células contra CD271

– células foi calculada para cada amostra. Os valores são a média ± SD de experiências em triplicado.

CD271

+ As células são resistente à quimioterapia

in vivo

Para determinar se a CD271

+ população é resistente à quimioterapia, foi analisado o efeito da CDDP em células. O nosso

In vitro

análise inicial falha, devido à dificuldade de manutenção de cultura de tecidos, quer em condições normais de cultura de tecido com soro ou sob condições esfera de cultura isento de soro (dados não mostrados). Por isso, foi utilizado um

in vivo

modelo de avaliação. Os ratinhos portadores de tumores derivados de HPCM1 foram tratados com CDDP, e no dia 7, os tumores foram ressecados, seccionados e examinados por IHQ para CD271 (Figura 4A). O achatada e queratinizado CD271

– células na zona central do tumor estavam no processo de morte, o que sugere que a quimioterapia tinha causado necrose massiva nestas células (Figura 4A). Em contraste, como foi mais evidente na camada basal, CD271

+ células sobreviveram e foram cercado por estroma. Para verificar que os CD271

+ células eram refractários à CDDP, uma suspensão de uma só célula preparadas a partir de um tumor tratado com CDDP foi analisada por FACS (Figura 4B). Após a administração de CDDP, o CD271

+ população aumentou de 16,3% para 35,2%, o que sugere que a CD271

+ células eram resistentes a CDDP. A resistência a múltiplas drogas das CSCs é atribuída a uma expressão elevada de transportadores de ligação a ATP [19], por exemplo, ABCC2 contribui para o efluxo de CDDP e docetaxel, e ABCB5 ABCG2 e contribuem para o efluxo de 5-FU. Por isso, comparou a expressão desses três transportadores de ligação a ATP no CD271

+ e CD271

– células de HPCM1 (Figura 4C). A expressão de

ABCC2

,

ABCB5

, e

ABCG2

na CD271

+ células foi cerca de 2,5 vezes, 4,8 vezes e 2,4 vezes maior do que no CD271

– células, respectivamente. Em conjunto, estes resultados indicaram que a CD271

+ células são resistente à quimioterapia.

(A) HPCM1- ratinhos transplantados foram tratados com 7,5 mg /kg de CDDP durante uma semana, em seguida, os tumores gerados foram analisados ​​por IHC para CD271. áreas em caixas estão ligadas a suas respectivas imagens de alta ampliação por setas horizontais. Barra de escala: 100? m. analisa (B) por FACS em células CD271 HPCM1 derivadas de ratinhos com ou sem tratamento com CDDP. (C) A expressão de

ABCC2

,

ABCB5

, e

ABCG2

em CD271

+ e CD271

– células analisadas em tempo real por RT-PCR . níveis de transcritos foram normalizados para os da

GAPDH

, e o aumento de vezes de cada nível de expressão de genes em CD271

+ células contra CD271

– células são mostrados. Os valores são a média ± SD de experiências em triplicado.

CD271 Expressão em HPC amostras clínicas está correlacionada com um prognóstico pobre

Para investigar se a expressão CD271 foi associada a quaisquer fatores prognósticos para primário pacientes HPC, 83 espécimes clínicos obtidos a partir de cirurgia ou biopsia foram examinados por CD271. Para esta avaliação, porque o CD271

+ células foram heterogênea localizada dentro de cada tumor, foi utilizado um sistema de classificação que classificou cada caso tanto como “forte”, se tivesse mais de 50% CD271

+ células em todo o tumor, ou “moderada a fraca”, se tivesse menos de 50%. Todas as lâminas foram avaliadas independentemente por dois pesquisadores (I. S. e K. M.) sem qualquer conhecimento prévio de informações clínicas de cada paciente. Por IHC coloração das amostras de tecido HPC com um anticorpo anti-CD271, 36 dos 83 casos foram classificados como forte, e 47 foram moderada a fraca (Figura 5A). As características clínicas e patológicas de 83 pacientes estão resumidos na Tabela S3. O grau de CD271 foram analisados ​​estatisticamente com respeito ao t-estádio clínico, N-fase, e o estágio da doença. As percentagens de cancros em estado avançado T (T3 ou mais) e fase avançada N (N2 ou mais) foram significativamente maiores no grupo de forte CD271 que no moderada a fraca grupo (47,2% vs 23,4%:

p = 0,023

, e 69,4% vs 40,4%:

p

= 0,009, respectivamente). Da mesma forma, os casos de doença avançada (estágio III e IV) foram mais frequentes no grupo forte CD271 do que no grupo moderado a fraco (80,6% vs 55,3%:

p

= 0,016). Em seguida, a taxa de sobrevivência específica da doença foi comparado com métodos de Kaplan-Meier. A taxa de sobrevivência de três anos foi significativamente menor no grupo CD271 forte em comparação com o grupo de moderada a fraco CD271 (54,3% vs 83,2%:

P

= 0,043) (Figura 5B). Estes dados indicam que a expressão histológica de CD271 está associada a resultados clínicos pobres.

(A) Os resultados representativos de IHC análises para CD271 em amostras clínicas obtidas de 83 pacientes HPC por cirurgia ou biópsia. Imunopositividade aparece marrom. As amostras com as células positivas mais do que 50% em todo o tumor foram classificados como “forte” (em cima), e menos do que 50%, como “moderada a fraca” (parte inferior). (B) Análise de Kaplan-Meier para a sobrevida específica da doença (3 anos) dos “fortes” e grupos “moderados a fracos”. * Estatisticamente significativo.

Nós ainda determinar se o

CD271

expressão de genes em amostras clínicas foi associado com o prognóstico dos pacientes. Para esta análise, 28 casos de HPC que foram completamente ressecados, avaliada tanto cirurgicamente e histologicamente, foram examinados para a expressão

CD271

. Imediatamente após a ressecção, cada amostra foi separada em tumores e mucosa hipofaringe normal. Os RNAs totais purificados a partir destes respectivos tecidos, foram submetidos a

CD271

quantificação de ARNm. Porque mucosa normal também expressa CD271 (Figura 1C), foi utilizado um “índice de CD271-expressão,” o valor de

CD271

no tumor versus a em mucosa normal, como o nível de CD271. Durante o período médio de 20 meses de acompanhamento, 11 dos 28 casos recaída. Todas as recidivas ocorreu dentro de 18 meses, ea sobrevida livre de recidiva em 18 meses foi analisada utilizando métodos de Kaplan-Meier (Figura 6A). Usando um valor de corte para o índice de 1,5 CD271-expressão, o

CD271

-High expressadores recaída significativamente mais frequentemente do que os

CD271

-Baixa casos (41,1% vs 80,0% relapse- sobrevida livre, respectivamente:

p

= 0,035). As características demográficas e clínicas destes pacientes são mostradas na Tabela S4. Para a classificação da doença clínica, pT3 ou mais foi significativamente mais frequente nos casos CD271-alta (CD271 de alta 15/17, CD271 de baixa 5/11;

p

= 0,022). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a expressão CD271 está associada a resultados clínicos pobres em termos de prognóstico e recaída.

(A) análise de Kaplan-Meier para a sobrevida livre de recidiva de acordo com o

CD271

nível de ARNm, em tecidos de tumor derivado de 28 pacientes de HPC por cirurgia. Em tempo real de RT-PCR foram conduzidas, normalizadas para a expressão de

GAPDH

, e a dobra-mudança na

foi calculada CD271

níveis de expressão no tumor contra mucosa normal. O valor de corte para o

CD271

-expression índice foi de 1,5. * Estatisticamente significativo. (B)

Nanog

expressão foi examinada por em tempo real de RT-PCR. do valor de corte para o

Nanog

índice de expressão foi de 1,5. * Estatisticamente significativo. círculos fechados, CD271 alta;