Abstract

Enhancer de homólogo zeste 2 (EZH2), a metiltransferase histona do Polycomb repressiva complexa 2 catalisador histona H3 lisina 27 tri-metilação (H3K27me3), é frequentemente sobre-regulada em cancros humanos. Neste estudo, identificamos o supressor de tumor eliminados no câncer de fígado 1 (DLC1) como um alvo de repressão por H3K27me3 EZH2 mediada. DLC1 é uma proteína de activação de GTPase para as proteínas da família Rho. Inactivação de resultados DLC1 em Rho sinalização hiper-activado /ROCK e está implicada na reorganização do citoesqueleto de actina para promover a metástase do câncer. Por ensaio de imunoprecipitação da cromatina, demonstramos que H3K27me3 foi significativamente enriquecido na região do promotor do DLC1 de uma linha celular HCC-nonexpressing DLC1, MHCC97L. Esgotamento de EZH2 em MHCC97L por shRNA redução do nível H3K27me3 pelo promotor DLC1 e induziu gene DLC1 re-expressão. Por outro lado, a sobreexpressão transitória da GFP-EZH2 em células Huh7 que expressam DLC1 reduzido nível de ARNm DLC1 com um enriquecimento concomitante de EZH2 no promotor DLC1. Uma relação inversa entre EZH2 e expressão DLC1 foi observada no fígado, pulmão, mama, próstata, e tecidos de cancro do ovário. O tratamento de células cancerosas com o inibidor molecular pequeno EZH2, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), restaurada DLC1 expressão em diferentes linhas celulares de cancro, o que indica que EZH2 mediada H3K27me3 regulação epigenética de DLC1 era um mecanismo comum em cancros humanos. Importante, descobrimos que o tratamento DZNep inibiu a migração celular HCC através da ruptura da rede de citoesqueleto de actina, sugerindo o potencial terapêutico da DZNep na segmentação metástase do câncer. Tomados em conjunto, nosso estudo tem lançar uma visão mecanicista em EZH2-H3K27me3 repressão epigenética de DLC1 e defendeu o papel pró-metastático significativo de EZH2 via reprimir tumor e metástase supressores

Citation:. Au SL-K, Wong CC- L, Lee JM-F, Wong CM, Ng IO-L (2013) EZH2-Mediated H3K27me3 está envolvido na repressão epigenética de excluídos no cancro do fígado 1 em cancros humanos. PLoS ONE 8 (6): e68226. doi: 10.1371 /journal.pone.0068226

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de março de 2013; Aceito: 28 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Au et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiada pela The University of Hong Kong Programa SeedFunding de Pesquisa básica (200811159061 e 201011159045 para CMW), Bolsas de Investigação Fundo de Hong Kong Conselho Geral de Investigação (HKU 782411M a CMW) e Hong Kong Bolsas de Investigação Fund Research Collaborative Conselho (HKU 1 /06C e HKU 7 /CRG /09 a IN). IN é Loke Professor Yew em Patologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declaram que o co-autor Chun-Ming Wong é um Conselho Editorial PLOS ONE membro e isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Todos os outros autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Introdução

A desregulamentação de proteínas reguladoras a montante epigenéticas promove alterações epigenéticas e contribuiu para silenciamento aberrante de genes supressores de tumor em cancros humanos [1]. Enhancer de homólogo de zeste 2 (EZH2), a subunidade catalítica de Polycomb repressiva Complexo 2 (PRC2), é um dos reguladores epigenética mais frequentemente regulados positivamente em cancros humanos diferentes [2-5]. EZH2 é uma metiltransferase histona que catalisa especificamente histona H3 lisina 27 tri-metilação (H3K27me3), que por sua vez actua como uma modificação da histona repressivo epigeneticamente para controlar a transcrição do gene [6,7]. -Regulação de EZH2 desempenha um papel fundamental na progressão maligna e foi implicado em metástase de câncer [2]. funções EZH2 como um oncogene em diferentes cancros humanos, principalmente através de silenciamento epigenético de genes tumorais e supressores de metástase, incluindo [8] E-caderina, RUNX3 [9], Slit2 [10], DAB2IP [11], e KLF2 [12]. Recentemente, também têm relatado que a EZH2 epigeneticamente inactiva a expressão de múltiplos microARNs supressores de tumores e metástases (miARNs), tais como o miR-125b e miR-139 no carcinoma hepatocelular humano (HCC), assim promove HCC tumorigenicidade e metástase [13]. Identificando novos alvos que são silenciados por EZH2 irá revelar melhor o papel moleculares de EZH2 em metástase de câncer que serão benéficas para o desenvolvimento de quimioterapias dirigidas EZH2.

DLC1 foi identificado como um

bona fide

do gene supressor do tumor em uma região cromossómica recorrentemente suprimido pelo cromossoma 8p21 em HCC [14]. DLC1 é uma proteína Rho GTPase-activating (RhoGAP) localizada nas adesões focais [15,16], e é específico para controlar a actividade de RhoA, B, C e CDC42 [17,18]. A atividade RhoGAP de DLC1 regula negativamente a estas proteínas Rho, estimulando sua atividade hidrolítica GTP intrínseco, portanto, converte-los a partir do estado ligado a GTP activo para o estado ligada a GDP inactiva. A cascata de sinalização Rho permite um controlo adequado de diversos processos biológicos, tais como a proliferação de células [19] e a movimentação das células [20], em células normais. Durante o desenvolvimento de malignidade, o DLC1 /Rho via é de particular importância devido à sua regulamentação sobre o citoesqueleto de actina relacionada à metástase do câncer. Temos demonstrado que a perda de DLC1 no HCC activado RhoA, que posteriormente ativou seu efetoras jusante Rho-quinase (ROCHA) para remodelar a rede de citoesqueleto de actina para a migração e invasão celular [21,22]. Outros diversificada tumorais funções supressoras de DLC1 incluem a mediação da apoptose 3-dependente da caspase no modelo de carcinoma hepatocelular [23], a inibição da angiogénese dependente de VEGF no modelo de cancro da próstata [24], e supressão de clonogenicidade em vários tipos de cancros [25]. A sub-regulação de DLC1 é geralmente mostrado em uma ampla gama de malignidades humanas [26] e a sua perda de expressão é classicamente associada com deleção cromossómica ou hipermetilação do ADN do promotor (Yuan et ai, 1998; Nunes et al 2000; Wong et al 2003; Kim et ai 2003). No presente estudo, forneceu a primeira evidência de que DLC1 é um novo alvo de repressão por H3K27me3 EZH2 mediada. Nós mostrou ainda inativação de EZH2 por 3 Deazaneplanocin A (DZNep) que DLC1 expressa-re e notavelmente abolida reorganização do citoesqueleto e migração celular inibida em células cancerosas. Coletivamente, nossas descobertas sugerem que o silenciamento epigenético de DLC1 está envolvido na função pró-metastático de EZH2 em cancros humanos.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

SMMC-7721 a linha de células (Shanghai Institute of Cell Biology) e linha de células Huh 7 (Japanese Câncer Research Banco) foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) -high glicose. linha MHCC97L celular (presente do Prof. Z.Y. Tang, da Universidade de Fudan, Xangai) [27] e a linha celular MIHA (Shanghai Institute of Cell Biology) foram mantidas em DMEM alta concentração de glicose suplementado com piruvato de sódio. linhagem de células HeLa (American Type Culture Collection) foi mantida em DMEM de baixa glicose. CNE2 (American Type Culture Collection) e HCT116 (presente do Prof. B. Vogelstein, da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, Baltimore, MD) [28] linhas de células foram mantidas em Roswell Park Memorial Institute 1640. Todos meio foi suplementado com 10% de soro bovino fetal e 100 unidades /ml de penicilina e de estreptomicina.

modificação de bissulfito e de análise de metilação

modificação Bissulfito de ADN genómico extraído a partir de linhas de células foi realizada utilizando ADN EZ metilação-direto Kit (Zymo Research, Orange, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados para a amplificação do promotor DLC1 após a modificação com bissulfito são: 5′-GTTTTTAGTTAGGATATGGT-3 ‘(directo) e 5′-ACTTCTTTCTACACATCAAACAC-3′ (inverso) para BS-1 região; e 5’-TAGAGTTATTAAGAAAAAGAAGGGA-3 ‘(directo) e 5′-AAAACTAAAATATTTCCCCCAC-3’ (inverso) da região BS-2. produto de PCR foi clonado no vector de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) e sequenciação de clones individuais foi realizada por sequenciação de Sanger.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio

ensaio chip foi realizada utilizando kit EZ chip (Millipore, Billerica, MA, EUA) como previamente descrito [13]. anticorpo contra ChIP grau H3K9me3 (ab8898; Abcam, Cambridge, MA, EUA), H3K27me3 (07-449; Millipore, Billerica, MA, EUA) e EZH2 (# 3147; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) foram utilizados no ensaio. IgG de coelho (Millipore, Billerica, MA, EUA) ou IgG de ratinho (Millipore, Billerica, MA, EUA) foi utilizado como controlo negativo no ensaio. Os iniciadores que abrangem a -394nt -325nt a montante do local de início da transcrição DLC1 foram usadas: 5′-CACCTC CGCCAAGTAAATGC-3 ‘(directo) e 5′-CCGAAAAGTCGCCAACTATTG-3’ (inverso). Quantificação da região ligada ao anticorpo foi feito por qPCR realizada com ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA).

In vitro

tratamento drogas epigenéticas

DZNep (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA) foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA). 5-aza-dC (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi dissolvido em ácido acético a 50%. TSA (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi dissolvido em etanol. O solvente dos produtos químicos foi utilizada como simulada no tratamento correspondente. Para o tratamento DZNep, DZNep (1? M ou 10 uM) foi adicionado ao meio de cultura durante 48 ou 72 horas. Para 5-aza-dC tratamento, 5-aza-dC (10 uM) foi reabastecido diariamente durante 72 horas. Para o tratamento de TSA, TSA (0,25 ug /mL), apenas foi adicionado às células, nas últimas 24 horas da experiência.

A migração celular ensaio

Antes da célula de ensaio de migração, 2×10

5 MHCC97L células foram tratadas com 1 uM DZNep durante 48 horas. células Mock e DZNep-tratados (1×10

5) as células foram semeadas na câmara superior do tamanho de poros 8um Transwell insere (Millipore, Billerica, MA, EUA). A câmara inferior continha meio condicionado recolhido a partir de células não tratadas para atrair MHCC97L migração das células durante 18 horas. células migradas foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. Três pontos de vista independentes da membrana Transwell foram fotografados e número de células migradas foi contado.

imunofluorescência (IF) microscopia eletrônica de microscopia e de varredura (MEV)

Antes de IF de imagem, 2×10

5 MHCC97L células foram tratadas com 1 uM DZNep durante 48 horas. Após o tratamento, as células simuladas e DZNep-tratados (1×10

5) as células foram tripsinizadas e semeadas em lamelas em meio de cultura DZNep-livre por 24 horas. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS e permeabilizadas com 0,2% de Triton-X-100. adesões focais foram coradas com anticorpo anti-paxilina (05-417; Millipore, Billerica, MA, EUA). F-actina foi visualizado por coloração com faloidina conjugada com FITC (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (Calbiochem, San Diego, CA, EUA). Se as imagens foram visualizadas e capturadas usando uma Leica Q550CW microscópio de fluorescência (Leica, Wetzler, Alemanha). Para SEM, as células simuladas e DZNep-tratados foram fixadas com 1% de tetróxido de ósmio e 2,5% de glutaraldeído, seguido de desidratação gradual de etanol. Após o passo de seca ponto crítico, as lâminas foram montadas em pasta de prata. As imagens foram digitalizadas e capturado sob × 2.000 ampliação usando um Hitachi S-4800 FEG Microscópio Electrónico de Varrimento.

A análise estatística

Os dados não-paramétricos e dados paramétricos contínuas foram analisadas pelo teste de Mann Whiteny U e

t

teste, respectivamente, utilizando o GraphPad Prism versão 5.00 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA). Os testes foram considerados significativos quando o

P

valor foi menor que 0,05.

Resultados

nível H3K27me3 é diferencialmente enriquecido no promotor DLC1 em hepatócitos normais imortalizadas e linhas de células de carcinoma hepatocelular

Para entender o papel da desregulação epigenética e DLC1 inactivação no HCC, que começou com a análise de metilação do promotor DLC1 por sequenciação bisulfide na linha de células de hepatócitos normais imortalizado MIHA e duas linhas de células de carcinoma hepatocelular SMMC-7721 e MHCC97L. promotor DLC1 estava completamente não metilada em MIHA, heterogénea e parcialmente metilado em MHCC97L, e completamente metilados no SMMC-7721 (Figura 1A). O estado de metilação de DLC1 em MIHA e SMMC-7721 correlaciona bem com o seu nível de transcrição DLC1. Mas em MHCC97L, do qual o promotor DLC1 foi apenas parcialmente metilado, o silenciamento completa de DLC1 sugerido que outros regulamentos epigenética pode estar envolvida (Figura 1B). Nós, portanto, a hipótese de que aberrantes de metilação da histona pode contribuir para silenciamento DLC1 em MHCC97L. imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio foi realizado para avaliar o enriquecimento de modificações transcricionais repressores, histonas e H3K9me3 H3K27me3, sobre o promotor DLC1 (Figura 1C). Mostrámos que H3K9me3 H3K27me3 e não foram detectáveis ​​em MIHA e isto era consistente com o estado transcricionalmente activo do gene DLC1 nesta linha celular. Em contraste, tanto o enriquecimento de transcrição repressivo H3K27me3 e H3K9me3 foi detectado no promotor DLC1 de células MHCC97L SMMC-7721 e. Curiosamente, foi H3K27me3 mais abundantemente enriquecido em MHCC97L, em comparação com SMMC-7721. Esta observação indica que, para além da metilação do DNA parcial, H3K27me3 também participou no silenciamento epigenético para inativar completamente transcricionalmente o gene DLC1 em MHCC97L.

metilação do DNA Promotor e modificação da histona de DLC1 em linhas de células de carcinoma hepatocelular.

(a) diagrama esquemático mostrando ilha CpG localizado na DLC1 lócus. estado de metilação de DNA de 45 dinucleótidos CpG (BS-1 região incluiu 35 CpG dinulceotides e região BS-2 incluiu 10 dinucleótidos CpG) foram submetidos à análise de seqüenciamento bissulfito. MIHA mostrou unmethylation completa, MHCC97L mostrou metilação parcial e SMMC-7721 mostrou metilação completa. Abrir círculo representa dinucleótidos CpG não metiladas e círculo fechado representa dinucleótidos CpG metilados. Cada coluna representa um único clone a ser sequenciado. (B) RT-PCR (painel superior) e qRT-PCR (painel inferior) mostra a expressão de ARNm detectável em DLC1 MIHA, mas não em MHCC97L e SMMC-7721 células. (C) cromatina imunoprecipitação (CHIP) ensaio acoplado com a análise qPCR (qChIP) revelou o enriquecimento relativo de H3K9me3 e H3K27me3 na região promotora DLC1 em MIHA, MHCC97L e células SMMC-7721. Dobra de enriquecimento do ensaio ChIP foi calculada com referência ao controle de IgG após normalizada com o DNA de entrada. Os dados são representados como média ± SEM de três experiências independentes.

Supressão de EZH2 induzida reexpressão DLC1 em diferentes linhas celulares de cancro humano

Para fornecer mais evidências de que EZH2 mediada H3K27me3 regula diretamente DLC1, investigamos se a expressão DLC1 poderia ser restaurada sobre o knockdown de EZH2. linhas de células de carcinoma hepatocelular expressam de forma estável o controle não-alvo (NTC) ou EZH2 segmentação shRNA (shEZH2) foram estabelecidos em nosso estudo anterior [13]. Após a knockdown estável de EZH2, DLC1 foi transcricionalmente induzido na MHCC97L (Figura 2A). Perda de H3K27me3 no promotor DLC1 foi observada em células MHCC97L shEZH2 (Figura 2B), indicando que EZH2 mediada H3K27me3 contribui para a supressão de DLC1 em MHCC97L. Em células Huh7 que expressam DLC1, a sobreexpressão transitória de GFP-EZH2 transcricionalmente reprimida DLC1 e um enriquecimento concomitante de EZH2 foi detectado no promotor DLC1 (Figura 2C e D suplementar Figura S1). Em linha com o modelo de knockdown EZH2, que mostrou ainda que o tratamento de 3-Deazaneplanocin A (DZNep), um inibidor de molécula pequena EZH2 [29,30], reduziu significativamente o nível de EZH2 proteína e nível H3K27me3 e induziu DLC1 re-expressão em MHCC97L células (Figura 2E). Mais importante, descobrimos que EZH2 mediada silenciamento DLC1 epigenética não se restringia ao HCC. Re-expressão de DLC1 mediante tratamento DZNep também foi observada em diferentes linhas celulares de cancro, incluindo a linha de células de carcinoma nasofaríngeo CNE2, colo-rectal HCT116 linha celular de carcinoma e linha celular de adenocarcinoma cervical HeLa (Figura 2F). Os resultados acima indicam que o silenciamento epigenético de DLC1 por H3K27me3 EZH2 mediada é um mecanismo comum compartilhada por diferentes cancros humanos.

H3K27me3 estava envolvido na repressão epigenética de DLC1 no HCC e vários outros cancros humanos. Mediada por EZH2

(a) DLC1 foi transcrição induzida após knockdown estável de EZH2 em células MHCC97L. análise (B) qChIP confirmou o esgotamento de enriquecimento H3K27me3 on promotor DLC1 sobre EZH2 knockdown em células MHCC97L. Os dados estão representados como a média ± SEM de três experiências independentes. (C) DLC1 foi transcricionalmente reprimida em células Huh7, após sobre-expressão transitória da GFP-EZH2. análise (D) qChIP revelou um enriquecimento concomitante de EZH2 em lócus promotor DLC1 sobre GFP-EZH2 superexpressão em células Huh7. Os dados estão representados como a média ± SEM de três experiências independentes. (E) EZH2 e expressão H3K27me3 foi reduzida após tratamento DZNep 1 uM durante 48 horas em células MHCC97L (painel esquerdo). DMSO foi usado como tratamento simulado. Pan-H3 e α-tubulina foram carregar o controle da imunotransferência. tratamento DZNep transcricionalmente induzido na expressão DLC1 MHCC97L como indicado por análise de qPCR (painel da direita). (F) Outras células cancerosas humanas, incluindo a linha de células de carcinoma nasofaríngeo CNE2, o colo-rectal HCT116 linha celular de carcinoma e a linha celular de adenocarcinoma cervical HeLa foram examinados quanto à DLC1 re-expressão por tratamento DZNep. O tratamento de células com 10 � DZNep reativada expressão DLC1.

P

-Valores obtido a partir de

t

-teste.

níveis de expressão de EZH2 e DLC1 são inversamente correlacionadas em tecidos de câncer humanos

Para fornecer relevância clínica dos nossos

in vitro

observações, examinamos a expressão do mRNA DLC1 em 25 pareado amostras HCC primárias e correlacionaram o nível de expressão com os nossos dados de expressão de mRNA EZH2 anteriores [31]. Nesta coorte de amostras, EZH2 foi significativamente regulada positivamente, enquanto DLC1 foi significativamente regulada negativamente nos tecidos tumorais do que os tecidos não tumorais (Figura 3A). Curiosamente, foi observada uma correlação inversa significativa entre EZH2 e DLC1 num subconjunto de amostras de carcinoma hepatocelular, em que o promotor DLC1 não foi silenciado por metilação de ADN [17] (Figura 3B). Também ampliamos nossa análise a outros cancros humanos, recuperando os dados de pulmão [32], de mama [33], próstata [34] expressão gênica por microarrays, e ovarianos [35] cânceres de Oncomine (www.oncomine.org) (Figura 3C ). Consistente com os resultados de HCC humana, DLC1 concomitante diminuição da regulação e EZH2-regulação foi observada nestes tumores malignos, sugerindo as implicações de EZH2-regulação em silenciar a expressão DLC1 em diferentes cancros humanos.

correlação inversa entre EZH2 e expressões DLC1 em cancros humanos.

amostras (a) Vinte cinco pares de HCC foram examinados para a expressão EZH2 e DLC1 mRNA por qPCR. EZH2 foi significativamente regulada para cima no tumorais (T) do que fragmentos de CCH tecidos não tumorais (NT) (painel esquerdo). Na mesma coorte de exemplo, DLC1 foi significativamente regulada para baixo no carcinoma hepatocelular, em comparação com tecidos NT (painel da direita).

P valores

de Wilcoxon combinado de teste de par. Observou-se (B) uma correlação inversa entre EZH2 e expressão DLC1 num subconjunto de amostras de HCC sem metilação do promotor DLC1. O nível de expressão de EZH2 e DLC1 em amostras-HCC emparelhados foi representada por ΔΔCt (T

(HPRT Ct -Gene de interesse Ct) -NT

(HPRT Ct – gene de interesse Ct)). A análise de regressão linear foi realizada usando GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, EUA). (C) EZH2 regulação positiva (painel da esquerda) e a regulação negativa DLC1 concomitante (painel da direita) foi consistentemente observada nos tecidos tumorais de diferentes cancros, incluindo pulmonar [32], da mama [33], da próstata [34] e cancros do ovário [35]. dados de expressão e

P valores de DLC1 e EZH2 em vários tipos de câncer

foi obtido a partir do banco de dados microarray Oncomine. bares flutuantes foram mostradas para ilustrar o máximo de unidades de expressão normalizados mínimo, mediana e (T) tecidos não tumorais (NT) e tumorais.

DLC1 é sinergicamente silenciado por H3K27me3 apenas quando seu DNA promotor é parcialmente metilado

uma vez que vários mecanismos repressivos epigenéticos estão intimamente ligadas ao estabelecer um ambiente de cromatina menos permissiva para reprimir a transcrição de genes [36,37], procurou-se demonstrar o efeito combinado de diferentes mecanismos epigenéticos no controle da expressão DLC1. MHCC97L e células SMMC-7721 foram tratadas com DZNep em conjunto com 5-aza-2’desoxicitidina (5-aza-dC) e tricostatina A (TSA), que são também inibidores da metilação do DNA e acetilação de histona caracterizados, respectivamente. Embora o tratamento de DZNep, 5-aza-dC e TSA elevada individualmente expressão DLC1, o tratamento combinado de três drogas sinergicamente restaurado expressão DLC1 MHCC97L em células (Figura 4A). No entanto, a co-tratamento em células SMMC-7721 não mostrou mais aumento na expressão DLC1, em comparação com sozinho 5-aza-dC (Figura 4B), o que implica que a metilação do DNA era um mecanismo epigenético predominante para silenciar DLC1 nesta linha celular.

expressão DLC1 foi sinergicamente restaurada sobre DZNep, 5-aza-dC células e tratamento TSA em MHCC97L mas não SMMC-7721.

(a) tratamento medicamentoso epigenética combinacional em células MHCC97L com 10 mM 5-aza-dC, 0,25 ug /mL de TSA e 10 uM DZNep induzida a DLC1 re-expressão mais robusta do que qualquer tratamento simples ou dupla drogas epigenética. DZNep e tratamento com 5-Aza-dC foram realizadas durante 72 horas. TSA foi adicionado a células quer sozinho ou com outros medicamentos durante as últimas 24 horas do tratamento. Os dados estão representados como a média ± SEM de três experiências independentes. células (B) Adição de DZNep em SMMC-7721 não induziu mais DLC1 re-expressão quando em comparação com 5-aza-dC e TSA duplo tratamento. Os dados são representados como média ± SEM de três experiências independentes.

DZNep tratamento interrompe citoesqueleto de actina de inibir a migração celular HCC

DLC1 /Rho /via ROCHA é crucial para a regulação remodelação do citoesqueleto adequada e motilidade celular. Nossos resultados sugerem que procedentes EZH2 está envolvida na supressão DLC1, que, portanto, ainda testado se o tratamento DZNep poderia suprimir

in vitro

HCC migração. DZNep tratamento em 1 uM durante 48 horas, que mostrou um efeito mínimo citotóxico (Recurso Figura S2), efetivamente inibiu a migração celular em células MHCC97L como demonstrado pelo ensaio de migração Transwell (Figura 5A). DZNep células tratadas também mostraram supressão do citoesqueleto de actina rede apropriada quando examinado sob microscópio electrónico de varrimento (Figura 5B) e imunofluorescência (Figura 5C). Estas alterações morfológicas celulares induzidas por tratamento com DZNep altamente se assemelhavam aos do colapso do citoesqueleto celular induzida por DLC1 e encolhimento da célula [21], o que implica que DZNep podem inibir a migração de células através de interferir DLC1 via /ROCK e substancial causado desorganização do citoesqueleto de actina.

tratamento de DZNep inibiu a migração celular HCC através da ruptura do citoesqueleto de actina.

(A) tratamento DZNep efetivamente abolida celular MHCC97L capacidade migratória. Antes do ensaio de migração de células, as células foram tratadas com 1 uM DZNep durante 48 horas. células Mock e DZNep tratados então sujeito a ensaio de migração celular usando aparelhos Transwell. Imagens representativas de três experimentos independentes foram mostrados.

P

-Valores obtido a partir de

t

-teste. tratamento (B) DZNep formação de filopódios (setas vermelhas) e lamellipodia (setas azuis) suprimida como ilustrado por microscopia eletrônica de varredura. Imagens (2000x) foram capturados usando um Hitachi S-4800 FEG Microscópio Eletrônico de Varredura. tratamento (C) DZNep auditivos do citoesqueleto de actina e provocou encolhimento celular em células MHCC97L. de fibras de stress foi corada com faloidina conjugada com FITC e adesões focais foram coradas com anticorpo anti-paxilina. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. células pseudo-tratados mostraram pacotes organizados de fibras de stress e paxilina bem preso. células tratadas com DZNep encolheu e perdeu rede apropriada citoesqueleto de actina. Imagens (aumento de 100x) foram capturados por um microscópio de fluorescência Leica Q550CW (Leica, Wetzler, Alemanha).

Discussão

Um importante papel pró-metastático de EZH2 em câncer é através epigenética silenciamento de genes supressores de tumores e metástases [8-12]. H3K27me3 é a melhor caracterizada mediada por EZH2 modificação da histona no sistema de mamífero epigenética. No presente estudo, nós fornecemos evidências de que EZH2 mediada H3K27me3 está envolvido na repressão epigenética de DLC1 durante o desenvolvimento do HCC. Curiosamente, a partir de vários dados do genoma publicados de grupo Polycomb mapeamento de genes alvo (PCG) em células-tronco embrionárias humanas (HES), também notamos que DLC1 é um gene candidato PCG-regulamentada em estágio inicial de desenvolvimento (Figura Suplementar S3). Em células embrionárias humanas, o promotor DLC1 é ocupada por SUZ12, que está associada com EZH2 para formar o PRC2 na mediação H3K27me3 e repressão de transcrição [38]. Além disso, o promotor DLC1 também é marcado com H3K27me3 [39] e H3K4me3 [40], que constitui a assinatura da cromatina bivalente de alvos PCG [41]. Esta assinatura cromatina bivalente, envolvendo a H3K27me3-silenciamento e H3K4me3-ativando modificações de histonas, permite que genes de importância do desenvolvimento e genes necessários à manutenção stemness a ser preparada em um estado pronto a transcrever até diferenciação [41,42]. DLC1 é essencial para o desenvolvimento embrionário [43] e, possivelmente, tem um papel na especificação de linhagem [44]. camundongos knockout DLC1 é embrionário letal [43]. No entanto, DLC1 ubiquamente é transcrito em tecidos adultos [14], o que implica que efeito silenciador PCG foi aliviada em células somáticas diferenciadas. Após a oncogénese, é possível que DLC1 recupera a sua marcação PCG embrionário como um resultado de EZH2 sobre-regulação. Ao nível molecular, foi demonstrado que DLC1 foi co-regulada por H3K27me3 EZH2-mediada, e a metilação do DNA em células de desacetilao da histona HCC. No entanto, a co-regulação entre os três mecanismos epigenética de DLC1 foi observada apenas quando o seu promotor foi parcialmente metilado (tal como em células MHCC97L). Uma vez que o promotor DLC1 foi densamente metilado (tal como em células SMMC-7721), H3K27me3 estava ausente e metilação de ADN foi o mecanismo chave repressivas com participação modesta de desacetilação da histona. Esta observação pode refletir o crosstalk de EZH2 silenciamento e metilação de DNA em um estágio anterior da repressão epigenética de genes supressores de tumor antes da eventual substituição de H3K27me3 silenciamento pela maquinaria de metilação do DNA estável [45,46]. Na verdade, nossos achados que DLC1 é um alvo PCG-regulada e sua posterior silenciamento epigenético durante a progressão da malignidade também estão em linha com o modelo proposto recentemente em PCG marcação de genes em células-tronco embrionárias estão predispostos a

de novo

câncer específica metilação do DNA [45,46].

segmentação farmacológico de proteínas epigenéticas desregulados surge como uma abordagem atraente na terapia do câncer [47,48]. DZNep foi mostrado para erradicar as células HCC-iniciando tumorais em ratinhos nus implantados com carcinoma hepatocelular [49], induzir a apoptose em células de cancro da mama [29] e segmentar leucemia mielóide aguda humana no modelo de ratinhos quando utilizado em combinação com panobinostat [50]. No entanto, nunca foi avaliado o efeito metástase supressiva da DZNep. Nossas descobertas indicam que DZNep inibir a expressão de EZH2 e pode continuar a funcionar como um inibidor da metástase potente através da ruptura da organização do citoesqueleto de actina. A caracterização farmacológica detalhada de DZNep para suprimir o crescimento de tumores HCC e progressão in vivo ainda está garantido para investigar o potencial terapêutico da DZNep como regime de tratamento do câncer.

Nós já mostrou que EHZ2 promove HCC metástases em parte através da repressão epigenética de múltiplos miRNAs de metas de sinalização Rho /Rock [13]. Por exemplo, o miR-139 que tem como alvo rock2 [22] era frequentemente regulados negativamente em HCC humana por H3K27me3 EZH2 mediada por [13]. Neste estudo, nós, adicionalmente, demonstrou que DLC1, o regulador chave a montante da via Rho /ROCK, também é silenciada por EZH2. No total, nossas descobertas desvendar uma regulação apertada e várias camadas de sinalização DLC1 /Rho /ROCK por EZH2, que pode apoiar um evento impulsionado crítica epigenética na promoção da metástase do câncer.

Informações de Apoio

Figura S1.

superexpressão transitória da GFP-EZH2, como confirmado por immunoblotting (Panal esquerdo) e qPCR (Panal direita), aumentado os níveis de EZH2 e H3K27me3 em células Huh-7. O anticorpo anti-EZH2 (# 3147, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) detectados tanto o endógena e proteína de fusão GFP-EZH2 no imunoblot. Proteínas e RNA foram colhidas de seis dias após a transfecção

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068226.s001

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Figura S2.

células tratadas com 1 uM MHCC97L DZNep durante 48 horas, foram examinadas quanto à sua viabilidade por coloração com azul de tripano antes do ensaio de migração celular. células tratadas Mock e DZNep foram igualmente viável

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068226.s002

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Figura S3.

publicamente disponíveis do banco de dados ChIP-sequenciação e chip-on-chip foi analisada para fornecer pistas de estatuto DLC1 cromatina em células estaminais embrionárias humanas. lócus DLC1 foi encontrada a ser marcado por H3K27me3 (Zhao et al., 2007) e H3K4me3 (Pan et al., 2007), em estudos independentes. Além disso, o promotor DLC1 também foi encontrado para ser vinculado por SUZ12, que é um componente essencial dos Polycomb repressivas Complexo 2.

doi (Lee et al., 2006): 10.1371 /journal.pone.0068226.s003

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