Abstract

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito anti-tumoral e potenciais mecanismos de i.p. hipertermia em combinação com α-galactosilceramida (α-GalCer) para o tratamento de cancro do ovário. Neste estudo, os modelos de tumor imuno-competentes foram estabelecidos utilizando linhas celulares de cancro do ovário murino e tratou-se com i.p. hipertermia combinando α-GalCer. Th1 /Th2 perfis de expressão de citocinas no soro, a citotoxicidade das células NK e actividades fagocíticas de células dendríticas (DC) foram ensaiados. Foram também analisadas no número de células T CD8

+ /IFN-γ

células T citotóxicas específicas de tumor +, bem como o crescimento de tumor com base em depleção de linfócitos sub-população. O efeito terapêutico sobre os tumores de ovário foi monitorizada por um sistema de imagem luminescente não-invasiva. Intra-peritoneal hipertermia induzida significativa expressão de citocinas pró-inflamatórias, e a resposta sustentada de NK e DC induzida por tratamento α-GalCer. O tratamento combinado aumentou a resposta imune de linfócitos T citotóxicos (CTL) em modelos de ratinho de cancro do ovário dois. Esta nova modalidade de tratamento de combinação de hipertermia e glycolipid proporciona um anti-tumor resposta imunológica acentuada e melhor sobrevida. Em conclusão, hipertermia intra-peritoneal aumentou a actividade de secreção de citoquina pró-inflamatória fagocítica e de DCs estimuladas por α-GalCer. A subsequente resposta imune CTL induzida por α-GalCer foi reforçada através da combinação com i.p. hipertermia. Tanto a imunidade inata e adaptativa estavam envolvidos e resultou num efeito terapêutico superior no tratamento do cancro do ovário

citação:. Wu C-C, Chuang Y-T, Hsu Y-T, Huang J-T, Wu T-C, Hung C-F, et al. (2013) Intra-peritoneal Hipertermia Combinando α-galactosylceramide no tratamento do cancro do ovário. PLoS ONE 8 (7): e69336. doi: 10.1371 /journal.pone.0069336

editor: Moriya Tsuji, Centro de Pesquisa de Aids Aaron Diamond com a Universidade Rockefeller, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de fevereiro de 2013; Aceito: 07 de junho de 2013; Publicação: 23 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa de Taiwan do Conselho Nacional de Ciência (NSC 98-2314-B-195-008-MY3). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de contas cancro do ovário para apenas 3% de todos os tumores malignos em mulheres, é a malignidade ginecológica mais letal em todo o mundo [1]. Devido à ausência de sintomas específicos ou sinais e falta de modalidades de rastreamento confiáveis ​​no início da doença, o cancro do ovário é mais diagnosticado em fase avançada [2] – [4]. Atualmente, o tratamento inicial padrão para o câncer epitelial de ovário consiste em cirurgia cytoreductive máxima seguida de quimioterapia adjuvante com regime de combinação de platina-taxano. Embora as taxas de resposta são cerca de 70-80%, a maioria destes pacientes, eventualmente recaída. Apesar do aumento do número de fármacos quimioterapêuticos disponíveis para doença recorrente, o curso do cancro do ovário é geralmente caracterizada por períodos repetidos de remissão e recidiva, e na maioria dos casos, a doença irá eventualmente desenvolver resistência a todos os agentes quimioterapêuticos e tornar-se incurável [5]. Com base no comportamento biológico e espalhando padrão de células de cancro do ovário, vários i.p. modalidades de tratamento têm sido defendidas para conseguir melhor controle da doença [6]. Entre eles, i.p. cancro do ovário hipertermia, especialmente quando combinado com quimioterapia, tem sido mostrado para melhorar a eficácia terapêutica para qualquer optimamente ou sub-optimamente debulked [7], [8]. Tem sido relatado que a alta temperatura poderia induzir citotoxicidade directa térmica e também trazer “quimio-sensibilização térmico” [9]. Acredita-se geralmente que os resultados de sensibilização de aumento da perfusão do tecido e penetração no tecido dos agentes citotóxicos. Embora os mecanismos básicos de hipertermia foram geralmente bem aceite, a aplicação de hipertermia terapêutica em conjugação com quimioterapia para os pacientes é muito mais complexo [10]. quimioterapia hipertérmica (42-43 ° C) tem sido conhecida por estar associada com uma maior citotoxicidade para as células cancerosas. No entanto, existem algumas desvantagens que limitam a sua utilização no tratamento do cancro do ovário, tais como potencial de má cicatrização da anastomose do intestino, risco de contaminação metabolitos quimioterapêuticos para o pessoal cirúrgico através de fluidos corporais ou por inalação de agentes quimioterápicos que evaporam [11]. Além disso, ele não pode ser aplicado repetidamente sem exploração da cavidade peritoneal.

em si tem demonstrado exercer uma série de efeitos celulares e moleculares, especialmente na indução de alterações imunológicas complexas no hospedeiro [12] A hipertermia, [ ,,,0],13]. Notavelmente, hipertermia é capaz de sobre-regular a expressão de proteína do choque térmico em células de tumor, e que estão associados com a apresentação de antigénio, apresentação transversal e imunidade anti-tumoral [14]. Todos estes dados fornecem o fundamento lógico em cima da melhoria dos efeitos anti-tumorais de hipertermia por combinação com agentes imunomoduladores.

glicolípido, tais como α-galactosilceramida (KRN7000, α-GalCer, um glicoesfingolipídio) demonstrou inibir o crescimento do tumor e prolongar a sobrevivência de alguns modelos de tumor de rato, através da activação de respostas imune inata e adaptativa [15], [16]. Vários ensaios clínicos também documentaram a sua segurança e efeitos biológicos em pacientes com tumores sólidos através da entrega parenteral [17], [18]. Este composto em si não é um agente citotóxico, mas podem ser apresentados às células NKT por CD1d [19], [20]. α-GalCer -activated células NKT foram relatados para segregar grandes quantidades de citocinas, incluindo IFN-γ e IL-4, e activando assim outras células efectoras, tais como células NK, células T, células B, macrófagos e DC [16]. A administração de α-GalCer em animais pode também induzir a produção de outras citocinas, tais como IL-2, IL-6, IL-12, e GM-CSF, que também pode reforçar o sistema imune [21].

a hipótese de que a hipertermia não só é citotóxico mas também capaz de revelar a imunogenicidade de células tumorais, direccionar a resposta imunitária através da microambiente para ambas as vias de Th1 /Th2. Propusemos que a adição de α-GalCer pode induzir a activação das células NKT, bem como a maturação de DC. A seguir ao tratamento com α-GalCer, uma cascata de citoquinas forte é subsequentemente induzida, aumentando, assim, a conversa cruzada entre as respostas imunitárias anti-tumor inata e adaptativa.

Neste estudo, foram utilizados diferentes células de cancro do ovário murino quanto modelos para testar nossas hipóteses e investigar o efeito anti-tumor e os mecanismos subjacentes de ip hipertermia combinada com α-GalCer no tratamento de câncer de ovário.

Materiais e Métodos

Mouse e linha celular

camundongos C57BL /6 e BC3F1 (C57BL /6 × C3H F1 ratinhos) foram adquiridos a BioLASCO, Taiwan. Os animais foram atendidos em condições específicas livres de patógenos. O rato do ovário linha celular de cancro MOSEC-Luc (C57BL /6 origem e expressão manipulada de luciferase de pirilampo), ID8-Luc (derivado de MOSEC-Luc com VEGF sobre-expressão), e HM-1 (origem BC3F1) foram cultivadas em RPMI 1640 (Gibco) suplementado com FBS a 10% (industrial Biológica, Israel), 100 U /mL de penicilina (Gibco) e 100 pg /ml de estreptomicina (Gibco) numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2/95% de ar a 37 ° C.

Declaração de Ética

Todos os experimentos seguido as orientações no que diz respeito ao bem-estar animal experimental e foram permitido pela IUAUC de Mackay Memorial Hospital (MMH-aS-97030).

intra-peritoneal hipertermia e tratamento α-GalCer

Para executar ip hipertermia, laparotomia exploratória foi realizada após os ratos foram anestesiados com Zoletil (VIRBAC, França) e Rompun (Bayer Vital GmbH, Leverkusen) em primeiro lugar. A cavidade peritoneal de cada rato foi constantemente cheio com 45 ° C 1 x PBS. PBS aquecida foi reabastecido para substituir PBS arrefecido pela frequência de 20~30 seg /ciclo para um total de 10 minutos. No grupo de tratamento combinado, 2 ug de α-GalCer (Enzo ciência de vida, EUA) foi adicionado para dentro da cavidade peritoneal, imediatamente após a conclusão da hipertermia. A cavidade peritoneal foi também aberto durante 10 minutos no grupo de ratos de controlo. Os ratinhos foram mantidos quentes sob luzes do aquecedor até que se recuperaram da anestesia.

Detecção Multiplex de citocinas

O sangue venoso colhidas a partir da cauda de cada ratinho foi incubado a 37 ° C durante 30 minutos e depois centrifugada a 1500 × g durante 10 min. O soro de sobrenadante foram transferidos para outro tubo limpo e guardado a -20 ° C antes da análise. A concentração de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, INF-α, e TNF-α no soro de cada ratinho foi detectada por BD Citometria grânulo kit Array (BD Bioscience), tal como descrito pelo fabricante.

Isolamento de células primárias e NK /NKT celular Detecção

Para isolar as células brancas do sangue (WBC), o sangue periférico, foi recolhido a partir da veia da cauda de ratinhos. Os glóbulos vermelhos do sangue foram removidos por lise ACK tampão (Invitrogen) e os glóbulos brancos foram então ressuspensas em meio RPMI 1640 antes da análise. Para isolar as células dentro da cavidade peritoneal, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 eutanásia. As células no interior da cavidade peritoneal foram recolhidos por lavagem peritoneal com 3% de BSA em PBS frio 1 ×. As células recuperadas do lavado foram lavadas e ressuspensas em meio RPMI 1640. As células foram então coradas por FITC-anti-CD3 e anticorpo PE-anti-NK1.1 como descrito fabrico (eBioscience). As populações de células NK e NKT foram detectados por citometria de fluxo. (Calibur, BD Bioscience). Os resultados foram analisados ​​por FACS software expresso.

Detecção de Câncer celular apoptose

Um milhão de células ID8-luc foram injetados intraperitonealmente em cada um /6 rato C57BL no grupo experimental. Três dias mais tarde, i.p. hipertermia foi administrado em ratos portadores de tumores, como descrito anteriormente. Nenhuma intervenção foi realizada no grupo de ratinhos de controlo, excepto a abertura /fecho da cavidade peritoneal. Um dia mais tarde, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 eutanásia. As células no interior da cavidade peritoneal foram lavadas e coradas com anexina V-APC e iodeto de propídio (PI, BD Bioscience), e, em seguida, submetido a análise por citometria de fluxo.

A citotoxicidade de células peritoneais de Efeitos

vinte milhares de células ID8-luc foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo como células alvo. Essas placas foram seladas com parafina e colocar na superfície do líquido de 42 ° C banho de água e incubou-se durante 20 min. As células lavadas (a partir de grupo de controlo ou grupo tratado com α-GalCer de ratinhos) como células efectoras foram então adicionadas à célula ID8-Luc que contém o bem com efectores /alvo (E /T) de 5:01 e proporção 10:01 , e cultivadas a 37 ° C durante a noite. Após a adição de luciferina (calibre), a quantidade de células ID8-luc sobreviveram foi apresentada como a intensidade de quimioluminiscência detectado pelo sistema de imagiologia IVIS. (Xenogen).

dendríticas celular fagocitose Ensaio

in vitro

Dois microgramas de α-GalCer foram i.p. injectado em ratinhos C57BL /6 e deixada durante a noite. Os ratos com e sem tratamento α-GalCer foram sacrificados e os baços foram transferidas para meio RPMI 1640. Os esplenócitos foram isolados dos baços por esmagamento no filtro celular de 100 um em disco de 6 cm contém 5 ml de meio RPMI1640. As células em suspensão foram lavadas e os glóbulos vermelhos foram removidos por lise ACK (Invitrogen). As DCs em esses esplenócitos foram purificados por anti-CD11c esferas magnéticas (MACS, Alemanha). Para o ensaio de fagocitose, células ID8-luc foram coradas com 25? M de CFSE (Sigma) e, em seguida, foram objecto de um tratamento de calor, como descrito anteriormente. DCs purificada a partir de grupo de controlo ou α-GalCer-grupo tratado de ratinhos foram co-cultivados em seguida, com 1 × 10

5 quer de células ID8-luc CFSE-coradas aquecidos ou não-aquecida durante 6 h. DCs foram rotulagem através de coloração com anticorpo anti-APC-CD11c (eBioscience). A percentagem de DCs CFSE positivo foi analisada por citometria de fluxo com o gating de células positivas CD11c.

dendríticas celular fagocitose Ensaio

in vivo

Um milhão de CFSE manchada (25 uM) de células ID8-Luc foram IP injectado em ratinhos C57BL /6. No próximo dia, todos os ratinhos foram divididos em 4 grupos e dado i.p. hipertermia e /ou 2 ug de um-GalCer. Camundongos receberam laparotomia somente (sem tratamento da toxicodependência) foi definido como grupo de controle. Após 24 h, as células intra-peritoneais foram lavadas e coradas com PE-anti-rato-CD11b e CD11c APC anticorpos anti-ratinho (eBioscience). A percentagem de DCs CFSE positivo foi analisada por citometria de fluxo por gating de CD11b

+ /CD11c

+ células positivas.

Tumor específico CD8

+ T celular Immunoassay

Um milhão de células HM-1 foram ip injectado em ratinhos B6C3F1 e 3 × 10

5 de células ID8-luc foram injectados intraperitonealmente em ratinhos C57BL /6. Três dias mais tarde, anestesiaram-se e tratou-se i.p. os ratinhos com ou sem α-GalCer. Depois de uma ou três semanas, os ratinhos foram sacrificados para isolar os esplenócitos. Os esplenócitos (1 × 10

7) foram cultivadas com ou sem 1 × 10

5 das células cancerosas singenéticos (aqueles que haviam sido injectados na cavidade peritoneal dos ratos) com 1 jig de Golgi-ficha (BD Pharmingen ) em placas de 24 poços. No dia seguinte, as células foram coradas com anticorpo monoclonal de APC-conjugado de rato anti-ratinho CD8a (eBioscience) durante 20 minutos, e fixadas com o kit Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen), seguido por coloração com rato conjugado com FITC interferão anti-murganho -γ (eBioscience) como descrito fabrico. O número de células positivas de CD8 /interferão-y foi analisada por citometria de fluxo.

não-invasiva de medição no Crescimento do Tumor

Um milhão de células MOSEC-luc foram i.p. injectado em ratinhos C57BL /6. Depois de uma semana, por via i.p. hipertermia foi realizada com ou sem tratamento α-GalCer. O crescimento do tumor de células MOSEC-luc em camundongos foi detectada pelo sistema de imagens quimiluminescência não-invasiva (IVIS, Xenogen).

O esgotamento dos linfócitos Sub-populações

Um milhão de células MOSEC-luc foram i.p. injectado em ratinhos C57BL /6. Cinco dias mais tarde, os ratinhos foram divididos em 4 grupos e receberam por via i.p. injecção de 100 ug quer de anti-rato CD4 (clone GK1.5), anti-rato CD8 (clone TIB210) ou anticorpos de controlo IgG de rato (Millipore) com um intervalo de dois dias. Todos os ratos receberam i.p. hipertermia combinado com 2 ug de α-GalCer uma semana após a inoculação do tumor. O crescimento do tumor foi medido pelo sistema de imagiologia IVIS não-invasiva, como descrito anteriormente.

Estatísticas

Todos os resultados foram representados pela média ± SE (erro padrão) a partir de pelo menos duas experiências independentes. As comparações entre diferentes pontos de dados foi realizada por meio do teste ANOVA ou o teste t de Student. A sobrevivência foi representada por curva de Kaplan-Meier e comparados usando análise de longo-rank.

Resultados

Hipertermia intra-peritoneal reforçada a secreção de citocinas pró-inflamatória induzida pela α-GalCer

os principais efeitos anti-tumorais de α-GalCer são pensados ​​para ser através de modulação das cascatas a jusante imunitárias por estimulação da produção de citocinas Th1 /Th2 por células NKT. Excepto para a IL-5, i.p. hipertermia reforçada ainda mais a secreção desses seis citocinas inicialmente provocada por i.p. a-GalCer tratamento. Em primeiro lugar, examinou se a adição de i.p. hipertermia é capaz de influenciar a expressão destas citoquinas estimuladas por instalação α-GalCer. A Figura 1 mostra que a injecção i.p. hipertermia sozinhos não alterou os níveis de citocinas Th1 /Th2, enquanto que i.p. administração a-GalCer desencadeada a secreção de várias citocinas, que atingiu os níveis mais elevados em diferentes pontos de tempo. Os níveis de IL-2 (p = 0,0003, α-GalCer

relação

controlo), IL-4 (P = 0,0012, α-GalCer

relação

controlo), IL-6 (p 0,0001, α-GalCer

contra

controle), e tecido alfa fator de necrose (TNF-α) (p = 0,0007, α-GalCer

contra

controle) atingiu o pico em 6 horas, enquanto IL 5 e IL-13 atingiu o pico em 12 horas (p = 0,0013, α-GalCer

contra

de controle para IL-5; p 0,0001, α-GalCer

contra

de controle para IL-13) . Demorou até 24 horas para o IFN-γto atingir o seu nível de pico (p 0,0001, α-GalCer

contra

controle). Excepto IL-5, i.p. hipertermia melhorada ainda mais a secreção destas citocinas cinco inicialmente induzida por injecção i.p. α-GalCer tratamento (p = 0,0056, para a IL-2; p = 0,0041, para a IL-4; p 0,0001 para IL-6; P = 0,0058, para o IFN-γ e p = 0,018 para o TNF-α). Este modo de tratamento também aumentou a secreção de IL-13 (p 0,0001, hipertermia mais α-GalCer versus apenas α-GalCer) que atingiu o pico antes em 6 horas após o tratamento. Estes resultados indicaram que α-GalCer pode induzir uma resposta imune mais forte anti-tumor, principalmente através do aumento das citocinas Th1 /Th2 na expressão através da combinação com i.p. hipertermia.

C57BL /6 murganhos foram divididos em 4 grupos com 5 ratos para cada grupo e tratados com injecção i.p. hipertermia única a 43 ° C durante 10 min, por via i.p. adicionou-se 2 ug de α-GalCer, e combinando ambos. Os ratos do grupo de controle só foram realizados laparotomia exploradora para 10 min. soro de ratinho foi recolhido em 6, 12, e 24 h após o tratamento. IL-2, IL-4, IL-5, Interferão-γ, TNF-α, IL-6 e IL-13 As concentrações de soro foram detectados por kit CBA multiplex. Alguns níveis de citocinas foram aumentadas por α-GalCer e atingiu um máximo de 6 horas pós-tratamento (IL-2, p = 0,0003, α-GalCer por si só

relação

controlo), (IL-4, p = 0,0012, α -GalCer sozinho

relação

controlo), (IL-6, p 0,0001, α-GalCer

relação

controlo), (TNF-α, p = 0,0007, α-GalCer

contra

controle); Alguns atingiu um máximo de 12 horas após o tratamento (IL-5, p = 0,0013, α-GalCer

relação

controlo) (IL-13, p 0,0001, α-GalCer

relação

controlo); um pico às 24 h após o tratamento (INF-γ, p 0,0001, α-GalCer

relação

controlo). Excepto para a IL-5, os níveis de citocinas Th1 /Th2 foram maiores no grupo de tratamento combinado de ácido a-GalCer grupo sozinho (IL-2, p = 0,0056; IL-4, p = 0,0041; TNF-α, p = 0,018; INF -γ, p = 0,0058). O nível do pico de IL-13 foi atingido mais cedo no grupo de tratamento combinado e o seu nível era muito mais elevada do que a de isoladamente α-GalCer (p 0,0001). Estes resultados implicaram que o tratamento α-GalCer poderia desencadear resposta imune em direção rota Th1 /Th2 e hipertermia pode aumentar ainda mais este efeito. (# P 0,05; * p 0,01; ** p 0,001; *** p 0,0001).

α-GalCer Tratamento Expostos sinérgicos efeitos citotóxicos contra células aquecida cancro do ovário

Demonstrou-se que os principais efeitos anti-tumorais induzidas por α-GalCer é através da libertação de certas citocinas, as quais aumentam a actividade de células NK ou T. Para investigar se o tratamento α-GalCer tem um impacto sobre a actividade das células NK, que monitorizada a população de células NK em diferentes pontos de tempo após a injecção i.p. a-GalCer tratamento. No sangue periférico, a população de células NK não se alterou de forma significativa nas primeiras 24 horas. No entanto, a percentagem de células NK aumentou dramaticamente de 72 horas após o tratamento (Figura 2A; p 0,001, 72 hr

relação

outros pontos de tempo). No interior da cavidade peritoneal, a população de células NK aumentou em 3 horas após a administração α-GalCer, e adição de i.p. hipertermia não afectou os incrementos (Figura 2B).

(A) 2? g de α-GalCer foi ip injectada em 5 murganhos C57BL /6 e o ​​sangue da veia da cauda foi recolhido em 0,5, 1, 3, 6 , 24, e 72 h após o tratamento. A variação proporção de células NK no sangue periférico foi analisada por citometria de fluxo com coloração de CD3 fluorescente e anticorpo NK1.1. Os resultados demonstraram que α-GalCer recrutados significativamente a população de células NK de sangue periférico em 72 h após o tratamento. (P 0,001, 72 h,

relação

outros pontos de tempo) (B) C57BL /6 murganhos foram divididos em 4 grupos e tratados por hipertermia intraperitoneal a 43 ° C, 2 ug de α-GalCer, ou combinação. Os ratos do grupo de controlo foram apenas abriu seu abdômen durante 10 minutos. células intra-peritoneais foram colhidos por lavagem peritoneal de 3 horas após o tratamento. Variação nas proporções de células NK intra-peritoneal foi analisada por citometria de fluxo com coloração de CD3 fluorescente e anticorpo NK1.1. O i.p. resultados implicaram administração a-GalCer aumento da proporção de células NK locais dentro de algumas horas. Combinação de hipertermia não comprometer este efeito. (P = 0,0007, α-GalCer

contra

controle; p = 0,0009, α-GalCer

contra

hipertermia, sem diferença significativa entre α-GalCer sozinho e tratamento combinado) tumor ID8 (C) -bearing ratinhos C57BL /6 foram tratados com hipertermia intra-peritoneal, a 43 ° C durante 10 min. Um dia após o tratamento, as células intra-peritoneal foram lavadas e coradas com anexina V e PI. As células cancerígenas foram fechado e o índice apoptótico foi analisada por citometria de fluxo. A proporção de células cancerosas apoptóticos foi aumentada depois de hipertermia intra-peritoneal. (P = 0,0084, hipertermia

contra

controle) (D) 2 × 10

4 de células ID8-luc foram semeadas em placas de 96 poços botão redondo e aquecido em 42 ° C banho-maria por 20 minutos . Diferentes proporções de células lavadas intra-peritoneais de ratinhos injectados i.p com ou sem α-GalCer foram então adicionados ao poço como células efectoras e co-cultivadas durante a noite com células ID8-luc aquecido ou não aquecido como células alvo. Não aquecidas células ID8-luc co-cultivadas com células lavadas sem tratamento de α-GalCer foram utilizados como controle. A citotoxicidade representada pela intensidade da chemoluminence foi o detectado pelo sistema de imagem IVIS. Os resultados mostraram que a co-cultura de células de cancro aquecida com células de lavagem intra-peritoneais de ratinhos tratados com GalCer α induzidas maior citotoxicidade de células de cancro in vitro. (Em relação E /T = 5:01, p 0,0001, calor, mais α-GalCer

contra

controle; p = 0,0162, o calor mais α-GalCer

contra

calor; p = 0,0004 , calor, mais α-GalCer

contra

a-GalCer). (# P 0,05; ** p 0,001; *** P 0,0001).

hipertermia foi relatado para causar a morte das células cancerosas. Em camundongos portadores de tumor ID8, as células ID8 mais apoptóticos (IP) foi encontrado em ratos tratados por hipertermia do que nos ratos de controlo (Figura 2C; p = 0,0084, hipertermia

contra

controle)

o

ex vivo

co-cultura, verificou-se igualmente que as células ID8 aquecidas foram mais susceptíveis a células lavados peritoneais obtidas a partir de ratinhos tratados com α-GalCer (Figura 2D; p = 0,0004, aquecida

contra

células ID8 non-aquecido a E /T proporção 05:01). Estes resultados implicaram que a injecção i.p. administração de α-GalCer pode recrutar mais células NK, levando a uma maior morte de células cancerígenas, e hipertermia induz um efeito citotóxico adicional para células cancerosas.

Tratamento Combinando i.p. Hipertermia com α-GalCer gerou um efeito sinérgico na fagocíticas DCS ‘Activities

in vitro e in vivo

Uma das actividades anti-tumorais de células NKT envolve a ativação de DCs. A principal função de DCs na imunidade anti-tumoral é para engolir as células do tumor e antigénios tumorais presentes para as células efectoras relevantes, tais como as células T citotóxicas. Nós investigamos ainda mais os efeitos resultantes do tratamento α-GalCer com hipertermia em atividades fagocíticas de DCs. Com base na co-cultura de células cancerosas com DC isoladas a partir do baço, verificou-se que as células cancerosas aquecidas foram mais susceptíveis à fagocitose DCs ‘(Figura 3A; p = 0,005, hipertermia

relação

controlo). Além disso, DCs isoladas de ratos expostos atividades significativamente mais elevados de fagocitose α-GalCer-tratados (p = 0,0037, α-GalCer

contra

controle). Juntando, a co-cultura das células cancerosas aquecidos com DCs obtidas a partir de ratinhos tratados com α-GalCer demonstrou muito mais fagocitose (p = 0,0002, o tratamento combinado

relação

controlo; p = 0,0008, o tratamento combinado

contra

hipertermia; p = 0,005, o tratamento combinado

contra

α-GalCer). Estes resultados mostraram que o tratamento α-GalCer mais hipertermia que conduz a um efeito sinérgico sobre a fagocitose DCs ‘

in vitro.

Dado que o tratamento combinado foi administrado para combater as células intra-peritoneal, analisaram-se as actividades de fagocíticas intra DCs -peritoneal obtido através de lavado peritoneal. Através da contagem do número de CFSE manchada de CD11b

+ /CD11c

+ DCs, nota-se que α-GalCer aumentar as atividades fagocíticas de i.p. DCs (p = 0,0289, α-GalCer

contra

Control) e hipertermia além de α-GalCer reforçou ainda mais este efeito (p = .0.038, combinado

contra

α-GalCer sozinho). Estes resultados mostram claramente que o tratamento α-GalCer mais hipertermia também conduz a um efeito sinérgico sobre a fagocitose DCs ‘no interior da cavidade peritoneal.

(A) da estirpe C57BL /6 murganhos foram primeiro por via i.p. injectados com 2 ug de α-GalCer. Após 18 h, os ratinhos foram sacrificados e as DCs foram purificados a partir de baços de esferas magnéticas anti-CD11c. Para o ensaio de fagocitose de células dendríticas, as células foram primeiro ID8 coradas com CFSE e aqueceu-se em banho de água a 42 ° C durante 20 minutos. As DCs de α-GalCer estimulada (ou não-estimuladas) ratinhos foram co-cultivadas com células ID8 aquecidos ou não-aquecida durante 6 horas, à razão de 5:01. A proporção de DCs com actividade fagocitária foi representada como positiva na CFSE CD11c fechado células analisadas por citometria de fluxo que expressa. Os resultados mostraram que tanto o

in vitro

tratamento térmico nas células cancerosas e

in vivo

estimulação da DC por α-GalCer poderia aumentar a atividade fagocitária de DCs (p = 0,005, calor

contra

controle; p = 0,0037, α-GalCer

contra

controle). O efeito sinérgico surgiu no tratamento combinado (p = 0,0002, o tratamento combinado

contra

controle; p = 0,0008 tratamento combinado

contra

calor; p = 0,005, o tratamento combinado

contra

α-GalCer). (B) ratinhos C57BL /6 foram i.p. injetados com 1 × 10

6 células ID8 CFSE manchada. No dia seguinte, os ratos foram divididos em quatro grupos com tratamento por injecção i.p. hipertermia e /ou α-GalCer descrito como anteriormente. Um dia mais tarde, as células intra-peritoneal foram colhidas através de injecção i.p. lavagem ea proporção de CFSE positivo CD11b

+ /CD11c

+ células que indicam atividades fagocíticas de DCs foram analisadas por citometria de fluxo. Mostra-se que o tratamento α-GalCer poderia aumentar a fagocitose de CC

In vivo

(p = 0,0289, α-GalCer

relação

controlo). Este efeito foi reforçado pela hipertermia adicional (p = 0,038, o tratamento combinado

contra

α-GalCer). (# P 0,05; * p 0,01; ** p 0,001).

Combinação de Intra-peritoneal hipertermia e α-GalCer provocou um Tumor-Específica citotóxico CD8

+ celular T resposta imunológica

Uma vez que o tratamento α-GalCer pode melhorar as atividades fagocíticas de DCs e hipertermia pode fortalecer ainda mais este efeito, a próxima pergunta seria se combinação de ip hipertermia e tratamento α-GalCer poderia induzir uma resposta de células T citotóxicas específicas de tumor. Para avaliar a presença da resposta imune celular contra células cancerosas, duas células de cancro do ovário de rato diferentes, HM-1 e ID8-Luc, foram utilizados como modelos de tumores imuno-competente. Sete dias após o tratamento, o tratamento de ratinhos HM-1-rolamento com α-GalCer por si só simplesmente aumentar um pequeno número de específico de tumores CD8

+ T células dentro dos esplenócitos (p = 0,0033, α-GalCer por si só

contra

controle). No entanto, verificou-se um aumento significativo no número de CD8 específico de tumores

+ células T em HM-1 portadores de ratinhos tratados com injecção i.p. hipertermia além de α-GalCer (p 0,0001, o tratamento combinado

contra

controle; p 0,0001, o tratamento combinado

contra

hipertermia; p = 0,0026, o tratamento combinado

contra

α -GalCer sozinho, figura 4A). No modelo de ID8-Luc, tumor-CD8 específicas

+ T resposta imune celular poderiam ser detectadas no grupo tratado apenas com α-GalCer (p 0,0001, α-GalCer por si só

relação

controlo). No entanto, este efeito foi encontrada para ser mais significativa no grupo tratado com a terapia combinatória (p 0,0001, o tratamento combinado in

contra outros grupos). O aumento da resposta de CTL específicos de tumor foi diminuído por 21 dias após o tratamento (dados não mostram). Isto pode ser devido ao crescimento excessivo de células de tumor que conteve o anti-tumoral resposta imune induzida por um único tratamento em tempo. Teoricamente seria muito mais eficaz se a hipertermia pode ser realizada repetidamente, ou o crescimento do tumor pode, eventualmente, superar a resposta imunitária anti-tumoral neste modelo de tumor-rápida crescente. Estes resultados demonstraram que a injecção i.p. hipertermia pode aumentar ainda mais a-específica do tumor CD8

+ de células T de resposta imune induzida por tratamento α-GalCer citotóxico.

células (a) 1 × 10

6 de HM-1 foram injectadas ip em ratinhos B6C3F1 e (B) 3 × 10

5 de células ID8-luc foram IP injectado em ratinhos C57BL /6. Os ratinhos foram divididos em quatro grupos (controlo não tratado, única hipertermia, α-GalCer sozinho e combinado com o tratamento de hipertermia, mais α-GalCer) com cinco ratinhos por grupo e tratados tal como descrito acima. Após 7 dias, as células de baço foram isoladas e estimuladas durante a noite com células ou células ID8 HM-1. Os esplenócitos de cada grupo sem re-estimuladas com células ou células ID8 HM-1 foram cultivadas durante a noite também como controlo. A percentagem de cancro de CTL específica representada como CD8

+ /IFN-γ

+ foram detectados por citometria de fluxo por gating de 2 × 10

5 linfócitos. Mostra-se que, após o tratamento de 7 dias, i.p. tratamento de α-GalCer aumentou ligeiramente o número de tumor específico CTL (p = 0,0033, controle

contra

α-GalCer para HM-1; p 0,0001, α-GalCer

contra

de controle para ID8 ). Hipertermia além de α-GalCer exibiu efeito mais forte na activação de CTL (p = 0,0026, o tratamento combinado específica

contra

α-GalCer para HM-1; p 0,0001, o tratamento combinado

contra

α-GalCer para ID8). (* P 0,01; *** p 0,001).

Intra-peritoneal Hipertermia aprimorada os efeitos terapêuticos da α-GalCer

in vivo

é evidente que o IP hipertermia reforçada ambas as respostas imunitárias anti-tumor inata e adaptativa induzidas por tratamento α-GalCer. Nós validado se este tratamento de combinações poderia resultar em um melhor efeito terapêutico

in vivo

. Em MOSEC-Luc ratinhos C57BL /6 portadores de tumor, por via i.p. hipertermia mais α-GalCer exibiu forte inibição do crescimento do tumor (Figura 5A; p 0,05, o tratamento combinado

relação

α-GalCer por si só). E este tratamento também prolongou o tempo de sobrevivência de ratinhos portadores de tumor (Figura 5B; p = 0,0018, o tratamento combinado

relação

controlo).