Abstract

A transformação growth factor-β1 (TGF-β1) e -β2 estão correlacionadas com pior prognóstico no câncer gástrico (GC), que atuam tanto no tumor e células do sistema imunológico. No entanto, as suas expressões em pré-cancerosas e de tumores de células interacções com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) permanecem pouco claros. Os níveis da proteína de TGF-β1 e -β2 foram analisados ​​por imuno-histoquímica e correspondentes níveis de mRNA foram determinadas por reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa em 93 espécimes cirúrgicos e de biópsias. Os níveis séricos de TGF-β foi detectada por ensaios de imunoabsorção enzimática. linhas de células AGS e MKN45 foram direta ou indiretamente co-cultivadas com PBMC

in vitro

. TGF-β e moléculas Smad foram detectados após a co-culturas e os crescimentos de células de GC e PBMC foram avaliadas pelo ensaio de proliferação celular. Os resultados mostraram coloração positiva para o TGF-β1 foi detectada em 20% das amostras de controlo, 52,3% de pré-câncer, 59,1% de GC precoce e 66,7% de amostras de GC avançada, correlacionada com a progressão da lesão (χ

2 = 9,487,

P

= 0,002). Todos os tecidos foram positivos para o TGF-β2. Os níveis de ARNm de TGF-β1 foram aumentados em cancros avançados, enquanto o TGF-β2 aumentada anteriormente. Os níveis de ARNm de TGF-β1 foram mais elevados no tumor do que em peritumoral, que positivamente correlacionada com Smad2 e Smad7. Os níveis séricos de TGF-beta foram significativamente maiores em pacientes com cânceres precoces e avançados em relação aos controles (TGF-β1:50.08 ± 4,38 e 45,76 ± 5,00 vs. 27,78 ± 6,11 ng /mL; TGF-β2:133.61 ± 21,90 e 111,34 ± 15,76 vs. 59,41 ± 15,42 ng /mL, tanto

P Art 0,05). Os níveis de TGF-β1 ARNm e a secreção de citocina foram maiores nas células GC após co-cultura directa em comparação com a cultura indirecta. TGF-β1 foi diminuída e TGF-β2 foi aumentada em PBMC após co-culturas. Além disso, o TGF-β1 inibiu a viabilidade de PBMC mas não as células cancerosas. Colectivamente, a transformação neoplásica pode ser um evento precoce envolvendo o aumento de TGF-β1 no ambiente em geral e locais. produção de TGF-β1 é promovido pela interação direta entre células GC e PBMC, o que pode facilitar o desenvolvimento de câncer

Citation:. Ma GF, Miao Q, Zeng XQ, Luo TC, Ma LL, Liu YM, et al . (2013) fator transformador de crescimento β1 e -β2 no gástrico pré-câncer e câncer e papéis nas interações tumor de células com células mononucleares do sangue periférico

In Vitro

. PLoS ONE 8 (1): e54249. doi: 10.1371 /journal.pone.0054249

editor: Noriko Gotoh, Instituto de Ciências Médicas da Universidade de Tóquio, Japão

Recebido: 16 de Agosto de 2012; Aceito: 10 de dezembro de 2012; Publicação: 14 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Xinjiang Uygur Região Autónoma Ciência e Tecnologia Projeto de Apoio (No.200991127) (https://www.kjzj.gov.cn/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é um dos cancros humanos mais devastadores, com uma maior taxa de incidência ocorrendo na Ásia Oriental [1]. Transformando β do factor de crescimento (TGF-p) desempenha um papel importante na progressão do tumor maligno [2] – [4]. A família TGF-β inclui TGF-β1, TGF-β2, e TGF-β3, que exibem acções diferentes e que não se sobrepõem in vitro [5]. TGF-β1 e TGF-β2 mais contribuem para a progressão do cancro, actuando em ambas as células de tumor e células estromais [6], [7], e uma perda de sensibilidade à inibição do crescimento por TGF-β é pensado para ocorrer na maioria das células cancerosas. Enquanto isso, as células cancerosas ganhar uma vantagem por redução selectiva da actividade supressora de tumores de TGF-β e o aumento da sua actividade oncogénica [8], [9]. Estudos anteriores demonstraram que o TGF-β1 constitui um fator prognóstico independente correlacionados com o estágio do tumor e pior prognóstico [5], 10,11. No entanto, os estados de proteínas TGF-β e ARNm e o seu papel na transformação do pré-cancro gástrico (PC) para carcinoma permanecem obscuros.

TGF-β é uma citoquina imunossupressora forte produzido por células imunes e não imunes , incluindo células tumorais [12], [13]. TGF-β pode promover o crescimento tumoral através da indução de células epiteliais para sofrer a transição epitelial-mesenquimal [14]. A inibição da sinalização de TGF-β tem sido relatado para prevenir a progressão e metástase de certos tumores avançados [15], [16], enquanto o TGF-β1 foi mostrado para reduzir a resposta imune [17], [18] e estimulam a angiogénese [19 ] no microambiente tumoral. proteínas Smad, como efectores intracelulares de sinalização de TGF-β, são activadas por receptores e translocar para o núcleo para regular a transcrição [20]. No entanto, a Smad-dependência da sinalização TGF-β no PC gástrica e precoce do câncer ainda não é totalmente compreendido.

TGF-β desempenha um papel importante no microambiente do tumor, envolvendo não só as interações entre células imunes e não imunes , mas também alternância de alguma produção de citocinas. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são células imunes que segregam citocinas chave, e as suas interacções com as células cancerosas podem induzir ou suprimir respostas imunitárias específicas do cancro, incluindo a indução de apoptose e produção de citocinas, que contribuem principalmente para a progressão tumoral [12], [21 ], [22]. As interações entre células e PBMC cancerosas ocorrem de duas formas principais: através do contato direto célula-célula, e através de média indireta dependentes de citocina. Embora alguns estudos têm demonstrado que várias células tumorais pode gerar células T reguladoras CD4 + CD25 + a partir de células T ingénuas CD4 + periféricas através da secreção de TGF-β [23], [24], [25], outro demonstrou que os níveis da citoquinas do TNF-α, interleucina (IL) -1β, IFN-γ foram aumentadas durante a interacção entre as células e linfócitos [26] do cancro do cólon. No entanto, os dois métodos de contato não foram comparados nesses estudos, e o principal tipo de interação, assim, permanece desconhecida.

Neste estudo, foi avaliada a proteína e níveis de mRNA de TGF-β1, TGF-β2, e outras moléculas correlacionadas em espécimes cirúrgicos e endoscópicos de pacientes com pré-câncer e câncer, para analisar seus papéis na carcinogénese. Nós também células GC co-cultivadas com PBMC para determinar se eles interagiram por meio de célula para célula de contacto dependente direta ou meios dependentes de citocinas indiretos em um microambiente do tumor simulada.

Materiais e Métodos

Paciente amostras

Um total de 93 casos foram incluídos neste estudo, compreendendo 30 cirurgicamente ressecados amostras primárias GC, 43 neoplásica e amostras cancerosas obtidos a partir de dissecção endoscópica da submucosa (ESD), e 20 amostras de biópsia de controle de gástrica aparentemente normal mucosa em pacientes livres de doenças neoplásicas ou inflamatórias. Características dos pacientes foram analisados ​​como segue: 20 tecidos normais (12 homens e 8 mulheres, com idade = 45.20 ± 14,01 anos dizer, tocou 28-63 anos), 21 de PC, incluindo, principalmente, baixo grau ou neoplasia intraepitelial de alto grau (15 do sexo masculino , 6 do sexo feminino, com idade = 65,86 ± 7,81 anos, intervalo 57-79 anos), 22 no início GC (EGC) definido como tumor superficial invadindo não mais do que submucosa (14 homens, 7 mulheres significa, média de idade = 63.50 ± 13,82 anos, faixa 41-81 anos), e 30 GC avançado (AGC) (21 do sexo masculino, 9 fêmeas, com idade média = 59,48 ± 10,75 anos, variação 30-70 anos). Todos os pacientes foram confirmadas por exame patológico. tipo histológico foi avaliada de acordo com a classificação da Organização Mundial da Saúde [27]. Os grupos estudados foram demograficamente comparável ao do grupo controle (

P Art 0,05).

Declaração de Ética

Os pacientes que receberam radioquimioterapia, sofria de outros tipos de câncer, ou que tinham uma história familiar de GC foram excluídos do estudo. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Zhongshan Hospital [28].

imuno-histoquímica (IHQ)

níveis de proteína

TGF-p1 e TGF-p2 foram examinadas por IHC em 4 μm- secções de parafina de espessura cortados a partir de um único bloco seleccionado, contendo tecidos gástricos neoplásicas e não neoplásicas. As amostras foram rotineiramente desparafinados e hidratado. Após o bloqueio da actividade da peroxidase endógena, os antigénios foram recuperados por meio de aquecimento com ácido tetraacético de etilenodiamina (pH = 9,0). Os antigénios foram subsequentemente detectados usando um procedimento de coloração convencional (™ Detection Kit EnVision, Dako, CA, EUA). Os anticorpos policlonais de coelho foram usados ​​para detectar o TGF-β1 e TGF-β2 (todas as diluições 1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA). Para os controlos de anticorpo-negativo, os anticorpos primários foram substituídos com soro de coelho normal. Capas foram considerados como positivos se pelo menos 5% de células displásicas ou cancro exibida coloração citoplasmática para o TGF-β1 ou TGF-β2 em × 100 de ampliação.

quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de amostras de biópsias cirúrgicas e, ou a partir de células cultivadas, utilizando Trizol reagente (Invitrogen, EUA). O DNA complementar foi preparado utilizando oligo

iniciadores dT de acordo com o protocolo fornecido com o iniciador de RT Script ™ Reagente (Takara, Tóquio, Japão). Os níveis de expressão de TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, e Smad4 Smad7 mRNAs foram confirmadas por SYBR® verde II qRT-PCR utilizando Mastercycler EP realplex (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) com duas etapas, a 95 ° C durante 30 segundos, em seguida 60 ° C durante 1 min, repetido durante 40 ciclos. As aliquotas dos produtos de PCR foram analisados ​​por curvas de fusão para testar a sua especificidade. Todos os iniciadores, incluindo TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, e Smad4 Smad7, foram testados quanto à eficiência de amplificação e normalizadas para os níveis de mRNA de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) (Tabela S1). Todos os experimentos qRT-PCR foram realizadas pelo mesmo investigador, sem conhecimento dos dados clínicos correspondentes.

Células e Cultura de Células

linhas de células AGS e MKN45 GC foram adquiridos a partir de Xangai Instituto de Biologia Celular , Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Eles foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM (Gibco, Invitrogen, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina e 100 ug de estreptomicina /ml (Gibco) em 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C.

Isolamento de PBMC

PBMC foram isolados a partir de sangue venoso de doentes GC ou controlos, tal como descrito anteriormente [22], [29]. Resumidamente, 3 mL de sangue foram imediatamente diluídos em 3 ml de solução salina tamponada com fosfato e em camadas, em 3 ml de Ficoll-Paque Plus ™ (Amersham Saúde, Aylesbury, Reino Unido). Após a centrifugação, as PBMC foram recuperados a partir da camada da interfase, ressuspensas em meio de cultura completo e cultivadas a 37 ° C durante 24 h para permitir a fixação de células aderentes, tais como células dendríticas.

celular Coculture Modelo

Transwell placas (Corning, Nova Iorque, EUA) foram utilizados como um modelo de co-cultura indirecta, que contêm câmaras inferiores e câmaras de topo com 0,4 mícrons poros do filtro de membrana que não permitem que as células GC para passar através mas permitir meio para trocar livremente. A co-incubação de os dois tipos de células foi utilizada como um modelo de co-cultura directa. cultura única de células GC foi definida como mono-cultura. GC células foram ajustadas a 5 x 10

5 células /mL, semeadas em câmaras de fundo de placas de 6 poços e incubadas durante 8 h para permitir a ligação. Pastilhas contendo 5 × 10

5 células /mL de PBMCs em cultura foram então transferidas para as câmaras superiores e co-cultivadas durante mais 24 h em meio com FBS condicional livre ou meio completo. Como controlos negativos, as inserções com PBMCs foram colocados em poços com o mesmo meio de cultura na ausência de células de cancro, e os poços com células de GC foram deixados sem inserções. A contagem de células no grupo de monocultura foi o dobro no grupo co-cultura, para assegurar o número de células semelhantes em todos os grupos. Sobrenadantes e as células foram recolhidas em separado após 24 h para uso posterior.

Proliferação Celular Ensaio

Uma plataforma de cultura de células Cell-IQ (Chip-Man Technologies, Tampere, Finlândia), equipado com uma fase -contrast microscópio Nikon (TPI Achromat objectiva de contraste de fase com 10 × ampliação, Nikon, Japão) e uma câmara, foi utilizado para detectar o crescimento de células tumorais, tal como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, as células foram cultivadas GC em placas de 24 poços (1 × 10

4 células /poço) durante 24 h e, em seguida, tratadas com TGF-β1 (Peprotech, EUA) a 25 ng /mL. grupos de controlo foram deixados sem tratamento. As células foram então incubadas durante mais 72 h no sistema de células-QI. As imagens foram capturadas em intervalos de 30 minutos durante 72 h, controlado por software de imagem (Chip-Man Technologies), e analisados ​​utilizando software imagem livremente distribuído (Facility McMaster Biophotonics, Hamilton, ON), usando o rastreamento manual plug-in criado por Fabrice Cordelières (Institut Curie, Orsay, França). O sistema de célula-QI discrimina automaticamente a divisória e fases celulares estáveis, e calcula os números de células totais durante a proliferação. Oito imagens foram analisadas para cada grupo.

A mobilidade de linfócitos faz com que seja difícil de controlar e calcular com precisão o número de células usando o sistema celular-QI. Por conseguinte, utilizado um ensaio de contagem celular Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Kumamoto, Japão) para avaliar a viabilidade de PBMC, de acordo com as instruções do fornecedor. Resumidamente, as PBMC cultivadas foram semeadas a 5 x 10

3 células /cavidade em placas de 96 poços. As culturas foram tratadas com TGF-β1 ou deixada sem tratamento como controlos. Após 72 h, a CCK-8 reagentes foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 4 h. As contagens de células foram então determinados por cinco poços por grupo experimental, com base na absorvância a 450 nm reduzida da CCK-8 de reagente, utilizando um leitor de automicroplate (Flexstation 3, Molecular Devices, USA). A viabilidade celular foi expressa como a percentagem de células viáveis ​​em relação às contagens de células não tratadas. Cada experimento foi realizado duas vezes. Os dados foram calculados e uma experiência representativa foi mostrado.

Immunosorbent Assay (ELISA) ligado a enzima

níveis

TGF-p 1 e TGF-p2 em sistemas de monocultura e co-cultura foram determinados por ELISA sanduíche utilizando Quantikine imunoensaio humana TGF-β1 e imunoensaios de TGF-p2 (R D Systems, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Um total de 100 ul de sobrenadantes de células a partir dos grupos de cultura directos e indirectos, respectivamente, foram tratados com 20 uL de 1 M de HCl durante 10 minutos, seguida por neutralização com 20 uL de NaOH 1,2 M. As amostras foram então pipetadas para poços pré-revestidas com um anticorpo monoclonal específico para o TGF-β1, e incubou-se durante 2 h à temperatura ambiente. Um anticorpo policlonal ligado a enzima específica para o TGF-β1 foi então adicionado aos poços e incubou-se durante mais 2 h a sanduíche do ligando a TGF-β1. Adicionou-se uma solução de substrato que consiste em peróxido de hidrogénio e tetrametilbenzidina e a intensidade da cor foi determinada utilizando um leitor de automicroplate (Flexstation 3, Molecular Devices). Cada experimento foi realizado duas vezes e cada ponto de amostra foi avaliada em triplicado, e os dados foram em média.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada usando SPSS 16.0 para Windows (SPSS, Chicago, EUA). Os dados foram apresentados como médias ± DP. testes qui-quadrado foram utilizados para analisar a correlação entre a coloração TGF-β e características patológicas clínicas. testes de Kruskall-Wallis foram usados ​​para comparar valores entre os diferentes grupos, e os testes de Mann-Whitney foram utilizados para identificar diferenças específicas entre dois grupos, com um valor α corrigido. Emparelhados Wilcoxon assinado testes de classificação foram realizadas para comparar os níveis de mRNA em tecidos tumorais e peritumoral. As concentrações de TGF-β no soro e de células sobrenadante foram analisados ​​por ANOVA. análise de correlação bivariada foi realizada para examinar as associações entre os status de mRNA de TGF-β1, TGF-β2 e moléculas SMADs.

Resultados

Mudanças na TGF-β1 e TGF-β2 Expressão em Displasia -carcinoma Sequência

positiva TGF-β1 estava presente não só na displásico ou células epiteliais malignas, na parte superior da glândula, adjacente ao lúmen, mas também fortemente em actina de músculo liso que expressa fibroblastos (Figura 1A-1C) . A coloração positiva para a forma intracelular de TGF-β1 ocorreu em 20% das amostras de controlo, 52,3% de PC, 59,1% de EGC, e 66,7% de amostras de AGC. teste de tendência linear mostrou que as taxas de positividade para TGF-β1 foram positivamente correlacionados com a progressão da lesão (χ

2 = 9,487,

P

= 0,002). A histologia de GC foi então dividido em tipos ‘intestinais “e” difusas “, de acordo com os critérios de Lauren [31]. Entre as amostras de GC, 64,1% do intestinal-type mostraram forte reação imunológica e 63,6% do tipo difuso foram fracamente coradas. Todos os tecidos foram corados positiva para o TGF-β2 (Figura 1D). Não houve diferença na expressão de TGF-β1 em relação a Helicobacter pylori (

HP)

infecção, classificação ou linfa envolvimento de Lauren nó (Tabela 1).

(A) A coloração positiva para TGF-β1 em caso de pré-cancro gástrico. (B) Coloração citoplasmática forte em células tumorais limitados à mucosa, em um caso de cancro gástrico precoce e coloração fraca em algumas células do estroma. (C) a expressão TGF-β1 em um caso de câncer gástrico avançado do tipo intestinal, segundo a classificação de Lauren. (D) de coloração citoplasmática para o TGF-β2 em um caso de cancro gástrico avançado. (Todas as fotos são mostradas na × 200 ampliação).

Alterações em TGF-β1 e TGF-β2 de mRNA em gástrica PC e Câncer tecidos

níveis de TGF β1-mRNA foram aumentados em AGC, enquanto que os níveis de TGF-p2 foram reforçadas em EGC. níveis de TGF β1-mRNA aumentou significativamente a partir do controle, PC, estágios EGC, e AGC (Figura 2A;

P Art 0,05). Sub-análise demonstrou que os níveis de mRNA de TGF-β1 foram significativamente maiores nos AGC em comparação com os grupos de controlo (PC e

P

0,05), enquanto que os níveis de TGF-p2 foram aumentados em CGA AGC e, em comparação com o grupo controle (

P Art 0,01) (Figura 2B). Além disso, os níveis de ARNm de TGF-β1 foram mais elevados no tumor do que em peritumoral (

P

0,001) (Figura 2C); No entanto, os níveis de TGF-p2 demonstrou a tendência oposta (

P

0,05) (Figura 2D). Além disso, a análise de correlação identificada correlação positiva entre os níveis de mRNA de TGF-β1 e Smad2 (

r =

0,346,

P =

0,025) e Smad7 (

r =

0,461,

P =

0,002) (Figura 2E e 2F). TGF-β2, no entanto, não mostrou associação com Smad2 ou Smad7, e nem TGF-β1 nem TGF-β2 foi correlacionada com Smad3 ou Smad4. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o TGF-β1 e TGF-β2 podem desempenhar diferentes papéis na progressão tumoral.

(A), os níveis de TGF-β1 mRNA na sequência de controlos (

n =

20), pré-câncer (PC) (

n

= 21), o câncer gástrico precoce (EGC) (

n

= 22), para câncer gástrico avançado (AGC) (

n

= 30). Os dados são apresentados como médias ± DP de níveis de transcrição normalizadas para GAPDH. (B) correspondentes níveis de TGF-β2 ARNm na mesma sequência. (C) e (D), os níveis de TGF-p1 foram regulados positivamente e os níveis de TGF-p2 foram regulados negativamente nos tecidos tumorais, em comparação com tecidos peritumorais dos mesmos pacientes. Níveis foram normalizados para GAPDH. Os dados de qRT-PCR em 20 casos emparelhados são mostrados. (E) e (F) correlações positivas significativas entre TGF-β1 e Smad2 /Smad7, utilizando um modelo de correlação bivariada. Os dados representam os níveis de transcrição em 36 casos de GC após a normalização para GAPDH. (G) As concentrações séricas de TGF-β1 e TGF-β2 medido por ELISA foram significativamente maiores no GC fase inicial e avançada em relação aos controles (

F =

4,745 e

P = 0,018

;

F =

4,939 e

P =

0,015, respectivamente). Não houve diferença significativa entre o GC precoce e avançado.

Ctrl

: controla voluntários;

EGC

: câncer gástrico precoce;

AGC

:. câncer gástrico avançado

concentrações séricas

Os níveis séricos de TGF-beta

Para explorar ainda mais a ocorrência de TGF-β no ambiente em geral, comparamos de TGF-β em pacientes com CGA AGC ou para aqueles nos controlos. As concentrações séricas de TGF-β1 em controlos e doentes com EGC e AGC foram 27,78 ± 6,11, 50,08 ± 4,38 e 45,76 ± 5,00 ng /ml, respectivamente, enquanto os valores correspondentes para o TGF-β2 foram 59,41 ± 15,42, 133,61 ± 21,90 , e 111,34 ± 15,76 ng /mL, respectivamente. Ambos os níveis de TGF-β1 e TGF-β2 foram significativamente maiores em pacientes com EGC ou AGC comparados aos controles (

F =

4,745 e

P = 0,018

;

F =

4,939 e

P =

0,015). No entanto, não houve diferenças significativas entre os pacientes com estágio precoce e tardio de GC (Figura 2G). Estes resultados sugerem que o estado anormal de TGF-β na carcinogênese gástrica pode ser uma resposta sistêmica, envolvendo não só o microambiente do tumor, mas também o sistema circulatório geral.

co-cultura em Vitro

A co-cultura modelo foi estabelecido para determinar se o contato direto célula-célula ou contato dependentes de citocina indirecta é o principal mecanismo em um microambiente do tumor imitando. Em primeiro lugar, não houve diferença significativa nos resultados do TGF-β1 e os níveis de TGF-β2 de mRNA em células de GC no modelo de co-cultura directa utilizando PBMC isoladas a partir de pacientes ou controlos GC (Figura 3A), e, por conseguinte, estes dados foram agrupadas para análise. Além disso, as concentrações de TGF-β1 no sobrenadante de células de co-culturas foram significativamente aumentados em comparação com aqueles em PBMC ou GCs cultivados sozinhos em um ambiente livre de FBS-(

P

0,05) e os seus níveis na co-cultura directa grupo foram significativamente maiores do que aqueles no grupo indireta (

P =

0,029); No entanto, embora os níveis de TGF-p2 foram também aumentadas em co-culturas directos, as co-culturas depois de diferenças não foram significativas (Figura 3B).

os níveis de (A) de TGF-p1 e TGF-β2 de mRNA em células de co-culturas depois de GC directos foram aumentadas em comparação com monocultura, mas não houve diferenças significativas na expressão de TGF-β1 e os níveis de TGF-β2 de mRNA em células de GC, independentemente da origem do PBMC (GC pacientes ou controlos). (B) de TGF-β1concentrations no sobrenadante de células de co-culturas foram significativamente aumentados em comparação com aqueles em PBMC ou GCs cultivados sozinhos em um ambiente livre de FBS (

P

0,05). Seus níveis no grupo co-cultura directa foram significativamente maiores do que aqueles no grupo indireta (

P =

0,029). Os níveis de TGF-p2 foram também aumentadas em co-culturas directos, mas as co-culturas depois de diferenças não foram significativas. (C) os níveis de produção de citoquinas foram significativamente aumentados em grupos co-cultura indirecta, após a adição de FBS (

P

0,05), mas sem alteração óbvia foi detectado em mais directos co-cultura. O experimento foi realizado duas vezes. Todos os dados são apresentados como médias ± DP de triplicados. (D) Origem das citocinas. Em células de GC, os níveis de ARNm de TGF-β1 foram aumentados aproximadamente 3 vezes na co-cultura directa e aumento de 2 vezes na indirecta uma comparação com monoculturas; os níveis de mRNA de TGF-β2 foram significativamente aumentados após co-cultura directa, mas estatisticamente não mudou após uma indireta. Em PBMCs, os níveis de ARNm de TGF-β1 foram significativamente diminuída e os níveis de TGF-p2 foram notavelmente aumentada, após co-culturas. Níveis foram normalizadas para GAPDH, e os níveis no grupo de monoculturas foram definidos como 1,0. Todos os dados estão apresentados como médias ± DP. (E) Os níveis de mRNA de Smad2 e Smad3 em células GC foram significativamente aumentados após a co-culturas (

P Art 0,05), que foram maiores no co-cultura directa do que os da indireta, mas não havia nenhuma estatística diferença nos níveis de Smad4. (F) QI-celular mostrou que a adição exógena de TGF-β1 (25 ng /mL) às células GC suprimiu o crescimento e a divisão das células tumorais, mas sem diferença significativa. Oito imagens de campo visual diferente foram analisadas para cada grupo. (L) Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ensaio mostrou que o TGF-β1 (25 ng /mL) inibiu a viabilidade dos PBMC significativamente a 72 h. A linha mostra a taxa de inibição de TGF-p 1 células estimuladas em comparação com controlos não tratados.

GC:

câncer gástrico;

PMBC:

de células mononucleares do sangue periférico;

Dir-co:

co-cultura directa;

Ind-co:

co-cultura indirecta;

Mono:

monocultura;

FBS:

soro fetal bovino.

ns,

não significativo; *,

P Art 0,05; **,

P

. 0,05

A seguir, foi investigado o efeito do soro sobre a interacção entre as células tumorais e PBMC. Surpreendentemente, as concentrações de TGF-p 1 e TGF-p2 no grupo indirecta, em comparação com a condição de que em FBS livre, foram inversamente mais elevada do que aqueles no grupo directa, após a adição de FBS. Além disso, as concentrações de TGF-β1 e TGF-β2 no sobrenadante da célula foram significativamente aumentados em grupos indirectos (

P

0,05), mas eles foram apenas um ligeiro aumento nos grupos directos (

P

0,05), através da adição de FBS (Figura 3C). Isto sugere que um ambiente enriquecido pode facilitar a produção de citocinas na indireta não em comunicação direta.

Além disso, para determinar as origens das citocinas, os níveis de TGF-p1 e TGF-β2 de mRNA foram medidos em células GC e PBMC, respectivamente . Em comparação com monocultura, os níveis de ARNm de TGF-β1 foram aumentados aproximadamente 3 vezes no grupo directa e duas vezes no grupo indirecta em células GC após co-cultura com PBMC; os níveis de TGF-β2 de mRNA foram significativamente aumentados em células GC após co-cultura directa, mas estatisticamente não mudou após co-cultura indirecta. Enquanto isso, os níveis de ARNm de TGF-β1 foram significativamente diminuída e os níveis de TGF-β2 ARNm foram aumentado mais do que 5 vezes em PBMC após co-culturas (

P

0,05) (Figura 3D). Estes resultados indicam que os níveis elevados de TGF-p 1 no sobrenadante de células pode ser originário a partir de células de GC, enquanto o TGF-β2 pode ser originário a partir de PBMCs. Além disso, verificou-se que os níveis de mRNA de Smad2 e Smad3 em células de GC foram significativamente aumentados após co-culturas, que foram maiores na co-cultura directa do que aqueles na uma indirecta, mas não havia nenhuma diferença estatística nos níveis de Smad4 (Figura 3E). No geral, estes resultados sugerem que a produção de citocinas principalmente depende da interacção directa entre as células cancerosas e as PBMC, e TGF-β /Smad2 /3 de sinalização pode ser promovido durante este processo.

Finalmente, para explorar ainda mais o TGF-β1 papéis em células PBMC e de GC, a capacidade de crescimento de células dos dois tipos de células foram detectados pela adição exógena de TGF-β1 de monoculturas de PBMCs ou células GC. QI-celular mostrou que as contagens médias de tanto as células totais e dividindo foram reduzidos; reconstituído TGF-β1 inibiu o crescimento de células de GC em 72 h, mas a diferença não era significativa (Figura 3F), enquanto exógena de TGF-β1 afectado significativamente a viabilidade dos PBMC (Figura 3G). Esta descoberta indica que o TGF-β1 elevada principalmente inibida a função das células mononucleares, mas não de células tumorais.

Tomados em conjunto, estes resultados na secção demonstrado que a interacção entre as células tumorais e as PBMC ocorre principalmente por meio de células directo contato -para-célula, mas com alguma contribuição do contato dependentes de citocina. Além disso, as condições enriquecidas promover a produção de citoquinas tais como TGF-β1 e TGF-β2. TGF-β1 agiu principalmente através da inibição da função do PBMC, mas não de células GC.

Discussão

Anormalidades no fator de crescimento e secreção de citocinas, especialmente TGF-β, desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento de câncer [ ,,,0],3], [32]. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, a proteína e status de mRNA de TGF-β1 e TGF-β2 na pré-câncer não têm sido bem estudada, e a produção de citocinas durante a interação entre as células tumorais e PBMC permanece obscuro. Por conseguinte, o presente estudo determinou os perfis de TGF-β1 e TGF-β2 em pr�cancro gástrico e cancro, e para analisar a natureza da interacção (directa ou indirecta) entre as células cancerosas e as PBMC e o seu efeito sobre a produção de citoquinas.

estudos anteriores encontraram que o aumento dos níveis de proteínas TGF-p 1 e TGF-p2 de expressão foram associados com pior prognóstico [5], [11], e os níveis de TGF-β1 de ARNm e de proteína foram aumentadas em tecidos displásicas e GC em comparação com tecidos gástricos normais [33], [34]; Em contraste, os níveis de ARNm de TGF-β2 em tecidos GC eram comparáveis ​​com os controlos [33]. Os resultados do presente estudo confirmou e estendeu as observações anteriores; Os níveis de TGF-β1 ARNm foram significativamente maiores em AGC, enquanto que os níveis de TGF-p2 foram maiores em displasia e EGC. Além disso, os níveis de ARNm de TGF-β1 foram mais elevados no tumor do que em peritumoral, enquanto que o TGF-β2 demonstraram a tendência oposta. Os níveis de proteína TGF-β1 mostraram por IHQ foram consistentes com estes resultados. Estas descobertas sugerem que a transformação neoplásica pode ser um evento precoce envolvendo o aumento de TGF-β1, em conjunto com a perda de TGF-β2.

Embora um estudo anterior demonstrou que 80% dos espécimes do tipo intestinal GC TGF expressa -β1 em comparação com apenas 43% do tipo difuso [10], não encontramos diferença na expressão de TGF-β1 em relação ao

Hp

infecção, classificação de Lauren, ou linfonodal. Activado TGF-β1 foi abundante na mucosa do

HP

pacientes infectados, no entanto, não houve diferença significativa em relação ao

pacientes -negative Hp

[35]. Além disso, os nossos resultados mostraram também que algumas células do estroma foram coradas positivas para TGF-β1. Do mesmo modo, as células mononucleares na lamina própria foi relatada ser a fonte principal de TGF-β1 [36]. Comerci

et al

[37] revelou que TGF-β1 segregada para ou produzidos por elementos de suporte do estroma pode indirectamente promover a progressão do tumor. Ottaviano

et al

[38] mostrou que a interferência entre células cancerosas e elementos estromais mediados por TGF-β1 influenciado à superfície celular e pericelular matriz de degradação potencial

in vitro

. Concluímos, portanto, que a secreção de TGF-β por células tumorais e as células do estroma podem desempenhar papéis importantes na manutenção de ocorrência e microambiente do tumor.

Os resultados revelaram que o TGF-β também foi pronunciado no sistema periférico, desde as concentrações séricas de TGF-β1 e TGF-β2 em pacientes GC foram maiores do que os controlos. No entanto, a relação entre as concentrações séricas de TGF-β1 e caracteres clinicopatológicas é controversa. Estudos anteriores descobriram que as concentrações séricas de TGF-β1 em pacientes do GC foram significativamente maiores do que os controles, e foi positivamente correlacionada com a massa tumoral, invasão, metástase e estágio clínico [39], [40].