Abstract

As células estromais, como miofibroblastos influenciar a progressão do tumor. Os mecanismos não são claros, mas pode envolver efeitos sobre tanto as células tumorais e o recrutamento de células de osso derivadas de medula estromais mesenquimais (MSCs), que, em seguida, colonizam tumores. Usando iTRAQ e LC-MS /MS foi identificada a adipocina, chemerin, como sobre-expresso em cancro associado esofágicas miofibroblastos escamosas (CAMs), em comparação com tecidos adjacentes miofibroblastos (ATMs). O receptor chemerin, ChemR23, é expressa por MSC. Os meios condicionados (CM) de CAMs aumentou significativamente a migração celular do MSC em relação a MTA-MC; a acção de CAM cm foi significativamente reduzida por neutralização chemerin-anticorpo, o pré-tratamento das CAMs com chemerin siRNA, pré-tratamento de MSC com ChemR23 siRNA, e por um antagonista do receptor ChemR23, CCX832. Estimulação das MSCs por chemerin aumentou a fosforilação de cinases de JNK-II p42 /44, p38 e e os inibidores destas quinases PKC e inverteu migração MSC estimulada por chemerin. Chemerin estimulação das MSCs também induziu a expressão e secreção do factor de inibição de macrófagos (MIF), que tendem a restringir as respostas migratórias a baixas concentrações de chemerin mas não as concentrações mais elevadas. Em um modelo de xenotransplante consistindo de OE21 células cancerosas do esôfago e CAMs, homing de CTMs administradas i.v. foi inibida por CCX832. Assim, chemerin secretado miofibroblastos câncer de esôfago é um quimioatrativo potencial de MSCs e sua inibição pode atrasar a progressão do tumor

Citation:. Kumar JD, Holmberg C, Kandola S, Steele I, Hegyi P, Tiszlavicz L, et al . (2014) a expressão aumentada de Chemerin em epidermóide de esôfago Miofibroblastos Câncer e Papel no recrutamento de células estromais mesenquimais. PLoS ONE 9 (8): e104877. doi: 10.1371 /journal.pone.0104877

editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de maio de 2014; Aceito: 15 de julho de 2014; Publicação: 15 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kumar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Cancer Research UK (AV), NIHR (AV), Instituto Nacional de Saúde /NCI (5U54CA126513, TCW, AV) e húngaro Investigação Científica Fundo (NF100677, PH), Wellcome Trust (AV, CH, SK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Empregados TC e MP são remunerados de ChemoCentryx. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. Os outros autores não têm conflitos de interesse.

Introdução

A importância do microambiente do tumor para determinar o crescimento de células cancerosas e propagação está agora bem reconhecida [1]. tipos de células do estroma, que contribuem para o microambiente incluem células inflamatórias e do sistema imunológico, células endoteliais, pericitos e as linhagens de células de fibroblastos [2]. No caso deste último um corpo crescente de provas indica que os fibroblastos associados ao cancro (FAC), dos quais são miofibroblastos um subtipo proeminente, diferem dos seus homólogos em tecido normal [3], [4], [5]. Há também uma apreciação crescente de que as derivadas da medula óssea estromais mesenquimais células estaminais () (MSCs) pode influenciar a progressão do cancro pela migração para locais de tumores onde se podem diferenciar em uma variedade de tipos de células, incluindo os miofibroblastos [6], [7]; Eles também podem ser úteis como veículos para fornecer terapia direcionada anticancerígeno [8]. Embora haja evidência de envolvimento de quimiocinas no recrutamento MSC os mecanismos continuam a ser mal compreendido [9], [10].

O câncer de esôfago é considerado responsável por cerca de meio milhão de mortes por ano em todo o mundo. Adenocarcinoma, associada a refluxo e obesidade, surge em um fundo de esôfago de Barrett e está aumentando em incidência nas sociedades ocidentais; carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) está associado com o tabagismo, consumo de álcool e dieta pobre e é de alta incidência nos países em desenvolvimento [11]. Há um crescente reconhecimento do papel da FAC /miofibroblastos em ESCC particularmente na promoção da invasão e angiogênese do câncer, embora, em geral, estes continuam a ser mal compreendida [12], [13].

Chemerin (tazarotene induzida gene 2, TIG2 ; ácido retinóico receptor respondedor 2, RARRES2) é uma proteína de 18 kDa de quimiocina-like que actua em ChemR23 (receptor de quimiocina-like 1, CMKLR1) [14], [15]. É secretada como um precursor inactivo que é activado por uma variedade de proteases extracelulares que removem um hexapéptido C-terminal para libertar uma forma activa 157 aminoácidos; que é expresso em adipócitos, fígado e placenta e tem funções na quimiotaxia adipogénese e de leucócitos, incluindo o recrutamento de assassino dendrítica e naturais (NK) para os sítios de inflamação ou cancro [16], [17], [18], [19] . No presente estudo, identificamos a expressão aumentada de chemerin em CICAc myofibrobroblasts associados ao câncer (CAMs) em comparação com miofibroblastos tecidos adjacentes (ATMs), e encontrou expressão de seus ChemR23 receptor cognato de MSCs. Nós, portanto, a hipótese de que chemerin age como um quimioatrativo MSC e que aqui apresentamos provas para apoiar a hipótese.

Materiais e Métodos

Células

Os miofibroblastos foram gerados a partir de tumores e tecidos adjacentes dos pacientes com CICAc utilizando métodos descritos anteriormente (Tabela S1 S1 Arquivo) [20], [21], e foram utilizadas entre as passagens 3 e 10. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Szeged, na Hungria e todos os assuntos de Ética deu consentimento informado. células CICAc (OE21) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). medula óssea humana de células-tronco mesenquimais derivadas foram usados ​​em passagens 3-12 no seu estado indiferenciado; até à passagem 12 exibiram adipócito, osteócito e diferenciação de condrócitos em adipócitos, osteócitos e condrócitos media diferenciação (Lonza, Cambridge, UK); as células foram CD105, CD166, CD29, CD44, α-SMA e vimentina positivas e foram CD14, CD34, CD45, citoqueratina e desmina negativa.

Cultura Celular

Os miofibroblastos foram cultivados como descrito anteriormente [20]. MSCs foram mantidas em um estado indiferenciado em MSCGM (Lonza) contendo suplementos de crescimento MSC meio basal e. As células foram mantidas a 37 ° C em 5% v /v CO

2; HUVECs foram mantidos em meio EGM e foram utilizadas nas passagens 5 a 9; OE21 células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% v /v de FBS, 1% v /v de penicilina-estreptomicina, 2% v /v de L-glutamina.

meios condicionados

miofibroblastos (1,5 × 10

6 células) foram semeadas em frascos T-75 Falcon e mantida a 37 ° C em 5% v /v CO

2 durante 24 h em meio completo (FM). As culturas foram então lavadas 3 vezes com PBS estéril e incubada em 15 ml livres (FS) meio de soro durante 24 h. O meio condicionado (CM) foram recolhidos, centrifugados (7 min, 800 x g, 4 ° C) e armazenaram-se aliquotas a -80 ° C até à sua utilização.

A imunocitoquímica

As células foram paraformaldeído (PFA) -Fixed (4% w /v), permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS (PBS-T) durante 30 min e processadas para imunocitoquímica como previamente descrito [22] utilizando anticorpos primários para CD105, CD34, CD29 (Ancell Corporation, Bayport, MN), α-SMA, vimentina, desmina, pancitoqueratina (Fitzgerald, NJ), ChemR23 (Millipore, MA,) ou GPR1 (Abcam, Cambridge, UK) seguido por incubação com a fluoresceína ou vermelho do Texas anticorpos marcados secundárias levantadas no burro (Jackson Immunoresearch, Soham, Reino Unido), e montado com Vectashield

® contendo DAPI (Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido). As lâminas foram vistos usando um Zeiss Axioplan-2 microscópio (Zeiss Vision, Welwyn Garden City, Reino Unido). As imagens foram capturadas usando uma câmera do dispositivo JVC-3 charge-coupled a 40 × ampliação com software KS300 (imagem Associates, Bicester, Oxfordshire, Reino Unido).

Análise proteômica

O secretome de miofibroblastos esofágicas foi estudado após a marcação de proteínas iTRAQ em meios seguido por LC-MS /MS como descrito anteriormente (ver Métodos S1) [3]. alvos chemerin putativos em MSCs foram procurados rotulagem SILAC de células, seguido de exposição a chemerin (R D Systems, Abindgon, Oxfordshire, Reino Unido) durante 24 h e o processamento de células para a LC-MS /MS (ver Métodos S1) como previamente descrito [23].

Western blotting

Meios ou extractos celulares preparados em tampão RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase foram resolvidas por electroforese em SDS-PAGE e processados ​​para Western blotting tal como descrito anteriormente [24] usando anticorpos para chemerin, migração de macrófagos fator inibidor (MIF), metaloproteinases de matriz (MMP) -2 (R D Systems), GAPDH (Biodesign, Maine), total e fosforilada p42 /44, p38 e quinases JNK-II (Cell Signaling, Massachusetts)

ELISA

ELISAs para chemerin (Adipo Bioscience, CA, EUA) e MIF (R .. D Systems) foram aplicados a miofibroblastos mídia de acordo com as instruções do fabricante

ensaios de migração celular

ensaios de migração Transwell foram realizadas utilizando inserções BD (BD Bioscience, Califórnia) como anterior descritos [25] empregando chemerin (R D Systems), chemerin-9 (Piscataway, NJ) ou não diluído CM no poço inferior. Os efeitos foram estudados de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), Ro320432, SB202190, SP600125, U0126, iso-1 (Calbiochem, Darmstadt, Alemanha), LY294002 (New England Labs, Hertfordshire, Reino Unido), chemerin anticorpo neutralizante ( MAb2325, R D Systems), CCX-832 e CCX826 (ChemoCentryx, mountain View, CA) [26]. Raspadinhas ensaios de migração da ferida foram realizados como previamente descrito [27]. Os ensaios de migração transendotelial foram realizadas utilizando as MSCs marcadas com 1 uM PKH67 (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante e BD BioCoat Matrigel Invasão secções (BD Bioscience) revestida com uma monocamada de HUVECs 48 h anteriormente. MSCs migram subsequentemente foram contadas como células fluorescentes.

ensaios de actividade de MMP-2

actividade de MMP-2 em meios de MSC foi determinada por um substrato de fluorescência selectiva, MCA-Pro-Leu-Ala-Nva -Dpa-Ala-Arg-NH

2, de acordo com as instruções do fabricante (Merk Biosciences, Beeston, Nottingham, Reino Unido).

Chemerin, chemR23, GPR-1 e MIF knockdown

Os miofibroblastos foram transfectadas com 3 diferentes RNAs de silenciamento (siARN, Tabela S2 no ficheiro S1) (3 uM) para chemerin (Sigma, UK). MSCs foram tratados com três diferentes ARNsi (Tabela S2 no ficheiro S1) (3 uM) para chemR23, siRNAs e validados para GPR-1 e de MIF (Invitrogen, Paisley, Reino Unido). A eficiência de knockdown foi verificada por transferência de Western ou imunocitoquímica

transfecção transiente

As células foram transfectadas utilizando kits Amaxa Nucleofector fibroblastos. (Amaxa; Colónia, Alemanha) e kits AmaxaTM MSC Humano Nucleofector (Amaxa; Colónia, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Cada transfecção empregues 2 ug de ADN (5 × 10

5 células) e 100 ul de solução completa Nucleofector. A transfecção foi realizada utilizando o programa de L-23 (de alta eficiência de transfecção) por adição de 500 ul de meio de cultura pré-aquecido para a cuvete e de transferência de amostras para 75 frascos-T com 20 ml de meio recentemente preparado.

MSC homing para xenotransplantes

Todos os experimentos com animais foram realizados após a aprovação pela Universidade do Comitê Bem-Estar animal Liverpool e estavam em conformidade com os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 (PPL 40/3137) .Para estudo MSC recrutamento para xenoenxertos, 6-8 semanas de idade imunocomprometidos BALB /c nu /nu (Charles River, Wilmington, MA) foram injectados SC com células OE21 (10

6) sozinho ou com CAMs (5 × 10

5). Os murganhos com tumores de tamanho comparável (1,0-1,2 cm de diâmetro) subsequentemente recebido CCX832 (2 mg /ml, 125 ul, IV), ou o veículo, seguido, após 24 h por uma segunda dose e as MSCs marcadas com PKH67 (7,5 × 10

5). Após 24 horas, os tumores foram dissecados, fixados em PFA a 4% e processados ​​para a localização de células fluorescentes.

Estatísticas

Os resultados finais foram calculados como média ± erro padrão das médias (EPM). Teste t de Student e ANOVA foram realizadas nos dados, conforme apropriado, com significância de p ≤ 0,05 utilizando Systat Software Inc. (Londres, Reino Unido), salvo indicação contrária.

Resultados

O aumento da expressão chemerin em epidermóide de esôfago webcams

miofibroblastos identificadas pela expressão α-SMA foram encontrados em maior número e exibiu interrompido morfologia e arquitetura na CICAc comparação com tecido adjacente (Fig S1 em S2 Arquivo). miofibroblastos cultivado a partir destes tumores e tecido adjacente expressa α-SMA e vimentina, mas não desmina ou citoqueratina; CM de CAMs estimulou o crescimento e migração de células OE21 comparação com MTA-MC (Fig S2, S3 em S2 arquivo). Usando rotulagem iTRAQ seguido por LC-MS /MS para identificar potenciais moléculas de sinalização de células segregadas por excêntricos, que foi encontrado um aumento abundância chemerin em meios CAM comparada com a MTA de todos os quatro pares de amostras CICAc (Fig S4 em Ficheiro S2; Tabela S3 no ficheiro S1). Western blot confirmaram o aumento chemerin no CAM em comparação com a mídia ATM (Fig 1A) e ELISA dos meios de comunicação indicaram 2,1 ± 0,4 vezes maior secreção chemerin por CAMs

vs

ATMs. Em extractos celulares, Western blot mostrou modesta, mas significativamente elevados chemerin em CAMs comparação com os seus ATMs emparelhados (Fig S5 em Arquivo S2). Um receptor putativo chemerin, ChemR23, foi expressa por MSC (ver abaixo), e chemerin estimulada migração dependente da concentração das MSCs em dois ensaios diferentes (Fig 1B). Além disso, a CAM estimuladas CM-migração MSC e a resposta foi significativamente maior do que a MTA-MC (Fig 1C, esquerda). A evidência directa para um papel de chemerin como um componente activo de CAM-MC foram fornecidas pela observação de que immunoneutralisation de chemerin inibiu o efeito da CAM-CM (Fig 1C, centro); Além disso, siRNA knockdown de expressão chemerin diminuiu a atividade do CM posteriormente aplicada a MSCs em ensaios de migração (Fig 1C, certo; Fig S6 em S2 Arquivo)

A

.. análise de Western representante da chemerin na mídia a partir CICAc CAMs e ATMs (esquerda). A análise quantitativa por densitometria de abundância chemerin na mídia a partir CICAc CAMs e ATMs (n = 4 pares diferentes de miofibroblastos) (à direita).

B

. estimulação dependente da concentração da migração MSC por chemerin em ensaios de migração zero ferida (esquerda) e Boyden ensaios de migração câmara (direita) (n = 3).

C

. O aumento da migração das MSCs em câmaras de Boyden em resposta a meio condicionado (CM) a partir das CAMs e as suas respectivas caixas automáticos (esquerda) (n = 4 pares diferentes de miofibroblastos). A estimulação da migração por MSC CAM-CM foi inibida pelo anticorpo neutralizante chemerin (Chem.Ab; 10 ug /ml) (centro). migração MSC foi diminuída em resposta ao CM a partir de células CAM1 e CAM4 transfectadas com ARNsi chemerin # 3 (à direita). setas horizontais, p . 0,05, teste t (n = 3)

ChemR23 expressa por MSCs medeia as respostas migratórias para chemerin

A expressão em MSCs do receptor chemerin putativa, ChemR23, foi identificado pelo conjunto de genes [28] e constatou-se expressão deste e um segundo receptor putativo, GPR1 [29], por imunocitoquímica. Knockdown por siRNA de ChemR23 (Fig 2A, esquerda; Fig S7 em S2 Arquivo) inibiu significativamente a resposta migratória tanto chemerin (Fig 2A, centro) e CAM-CM (Fig 2A, direita), enquanto knockdown de GPR1 teve pouco efeito. Um antagonista ChemR23, CCX832, dose-dependente migração inibido MSC em resposta a chemerin (Fig 2B, esquerda e centro) e CAM-CM (Fig 2B, à direita), enquanto um análogo inactivo, CCX826 não teve nenhum efeito; a inibição da CAM-CM por CCX832 foi semelhante ao obtido por immunoneutralisation (Fig 2B, à direita).

A

, Imagens representativas de MSCs coradas para vimentina (controle positivo) e chemR23 revelando knock-down (KD) após o tratamento ChemR23 siRNA (esquerda). Knockdown de ChemR23, mas não GPR1, migração MSC inibida em resposta a chemerin (100 ng /ml) (centro) e CAM-CM (à direita).

B

, a inibição dependente da concentração da migração MSC em resposta a chemerin pelo CCX832 antagonista ChemR23 (esquerda), mas não o composto de controlo CCX826 (1 uM) (centro). migração MSC em resposta a CAM-CM foi inibida de forma semelhante por chemerin anticorpo neutralizante, e CCX832, mas não CCX826 (1 uM) (direita).

C

, representativos mostra Western blot aumento da fosforilação da p42 /44, p38 e JNK-II quinases em MSCs tratados com chemerin (100 ng /ml) (à esquerda). Em ensaios de câmara de Boyden, migração MSC estimulada por chemerin foi inibida pelo inibidor de JNK-II, SP600125 (50 uM), o P42 /44 de inibidor, UO126 (10 uM), SB202190 inibidor de p38 (3