Abstract

Adquirida quimio-resistência é um dos fatores causais chave na morte por câncer. evidências emergentes sugerem que miRNA e de transição epitelial-mesenquimal desempenham papéis críticos na quimio-resistência em cancros. Aqui, mostramos a associação de paclitaxel-resistência com o miR-375 sobre-expressão e indução de transição epitelial-mesenquimal no câncer cervical. Usando diferentes modelos de celulares de cancro do colo do útero, descobrimos que paclitaxel transitoriamente induzida up-regulação da expressão de miR-375, inibição da proliferação, a transição do epitélio para o fenótipo mesenquimal, e sensibilidade paclitaxel consequentemente prejudicada. Forçado a sobre-expressão de miR-375 pode suprimir a expressão Ecadherin por uma via de direccionamento directamente, o que levou a resistência paclitaxel. Contrariamente, a re-expressão de Ecadherin parcialmente invertida fenótipo transição epitelial-mesenquimatosa e miR-375 induzida por paclitaxel-resistência. Nossos resultados sugerem que induzida por paclitaxel miR-375 sobre-expressão facilita o processo de transição epitelial-mesenquimal via visam directamente Ecadherin, inibição da proliferação e, consequentemente, resulta em quimio-resistência em células de cancro do colo do útero. A reversão de expressão de miR-375 ou Ecadherin pode ser uma nova abordagem terapêutica para a superação da quimio-resistência em câncer cervical

Citation:. Shen Y, Zhou J, Li Y, Ye F, Wan X, Lu W, et ai. (2014) miR-375 Mediated Adquirida Chemo-Resistência em Câncer do colo do útero, facilitando EMT. PLoS ONE 9 (10): e109299. doi: 10.1371 /journal.pone.0109299

editor: Zhi-Ming Zheng, Instituto Nacional de Saúde – Instituto Nacional do Câncer, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de outubro de 2013; Aceito: 10 de setembro de 2014; Publicação: 16 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro contínuo da National Science Foundation Natural da China (concessão No. 81172475 e 81172474), a Fundação de Ciência Natural da província de Zhejiang da China (Grant No. Z2110056, LQ13H160005 e Y2110206). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

evidências emergentes revelaram que quimio-resistência está associada com a transição epitelial mesenquimal (EMT) em células cancerosas, e a aquisição de quimio-resistência em células cancerosas é acompanhada de uma transição de um fenótipo epitelial para um mesenquimais [ ,,,0],1] – [3]. Por exemplo, vários cancros resistentes a fármacos, incluindo células de cancro colorrectal oxaliplatina-resistente [4], células de cancro do ovário de paclitaxel-resistentes [5], e células cancerosas de pulmão resistentes a gefitinib [6], apresentar a transição a partir do epitélio para o fenótipo mesenquimal juntamente com uma perda de molécula de adesão epitelial Ecadherin e um ganho de marcadores mesenquimais, tais como vimentina, Ncadherin, e fibronectina. Estudos mais recentes mostraram também que os agentes de quimioterapia podem facilitar a epitelial a uma transformação fenotípica mesenquimais nas células cancerosas residuais sobrevivente que pode ser um dos passos críticos na resistência adquirida aos fármacos em cancros [7], [8]. Assim, aquisição de EMT torna-se um processo chave contribuindo para o fenótipo maligno de células de cancro na resistência à quimioterapia. Portanto, a intervenção do processo EMT tem sido proposta como uma abordagem terapêutica contra quimio-resistência adquirida.

Os microRNAs (miRNAs) agir genes reguladores como importantes no genoma humano e sua expressão aberrante pode promover não só Tumori-gênese e a agressividade do tumor, mas também a resistência à quimioterapia [9]. Mais recentemente, os estudos revelaram que miARNs desempenham um papel integral na modulação EMT, tais como miR-200 que regula EMT através da inibição ZEB1 /2, um repressor de transcrição de Ecadherin [1], [10], [11]. Recentemente, relatou que a expressão de miR-375 foi reduzida em células de cancro do colo do útero [12] e aplicada sobre-expressão de miR-375 inibiu a proliferação significativamente bloqueada e G1-S do ciclo celular de transição [13]. Em outro estudo, observou-se ainda que miR-375 foi regulado para cima em células e tecidos cervicais tratados com paclitaxel, e forçou a sobre-expressão de miR-375 diminuição da sensibilidade paclitaxel em câncer cervical [14]. No entanto, o mecanismo molecular preciso subalterno miR-375 regulado resistência aos medicamentos continua a ser explorado. Até o miRNA tem como alvo previsão genética, encontramos um local de ligação entre o miR-375 e Ecadherin 3′-UTR, que indicou que Ecadherin era um potencial alvo direto de miR-375. Portanto, assumimos que miR-375 pode participar na regulação EMT e adquiriu paclitaxel-resistência em células de cancro do colo do útero.

No presente estudo, encontramos pela primeira vez que o paclitaxel inibe a proliferação, induz EMT, e até -regulates expressão de miR-375 simultaneamente em células de câncer cervical. E miR-375 sobre-expressão inibida diretamente a expressão Ecadherin e facilitou paclitaxel-resistência. Assim, existe um mecanismo de feedback positivo distinto entre o paclitaxel, o miR-375, e EMT que leva a fenótipos quimio-resistência adquirida em células de cancro do colo do útero. Tais um loop de feedback regulatório resulta em miR-375 sobre-expressão, a epitelial para uma transformação fenotípica mesenquimal e, consequentemente, aquisição de paclitaxel-resistência. De qualquer forma, poderia ser acreditado que uma ruptura de tal ciclo de feedback seria, pelo menos parcialmente, superar quimio -Resistência em câncer cervical.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

As amostras de tecido de câncer foram coletados de 23 pacientes com carcinoma de células escamosas do colo do útero com a FIGO (2009) estágio IB

2 ou IIA

2, que foi submetido à quimioterapia neo-adjuvante, seguido do tipo III histerectomia radical entre 01 de novembro de 2008 e 30 de Maio de 2010, no Hospital da Mulher, Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang. A recolha de todas as amostras foi aprovado pela Comissão de Ética para a Investigação Clínica do Hospital da Mulher, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang e consentimentos informados por escrito foram obtidas.

Todos os pacientes foram submetidos a 2 ciclos de quimioterapia neo-adjuvante intravenosa ( paclitaxel 135 mg /m

2 e cisplatina 75 mg /m

2, intervalo de 3 semanas) antes da cirurgia. O efeito da quimioterapia foi avaliada de acordo com os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST) [15], como descrito anteriormente

14. De todos os 23 pacientes, com idade média de 36,5 anos (variando de 20 a 65 anos), tiveram amostras pré e pós-quimioterapia de tumor cervical. A composição especificada de cada amostra foram determinadas por um patologista experimentado.

Cultura de células e indução de EMT

Duas linhas celulares de cancro cervical humano, SiHa e CaSki foram cultivadas como anteriormente descrito

14. TGF-β1 recombinante humano e EGF-β foram obtidos a partir de ProSpec-Tany Techno Gene Ltd. (Israel), respectivamente, utilizado a uma concentração final de 5 ng /mL e 2 ng /ml. As linhas celulares de cancro foram semeadas 1 × 10

5 /cavidade em 6 poços placas e incubadas em meio isento de soro durante a noite, e, em seguida, tratadas com TGF-β1 ou EGF-β durante 72 h, respectivamente, para induzir o EMT.

Extração de RNA e em tempo real de RT-PCR

os ARNs totais foram extraídos contendo miARNs a partir de tecidos de azoto conservados líquidos ou as células recolhidas utilizando 1 mL de reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Sintetizou-se ADNc com o kit de reagentes PrimeScript RT (Takara Otsu, Shiga, Japão). RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) para ARNm de miARN e foi realizada como descrito previamente

14. As sequências de todos os iniciadores são dadas na Tabela 1.

Ensaio de Proliferação Celular e MTS Assay

Para determinar o efeito de miR-375 e paclitaxel sobre a proliferação de linhas de células cervicais, o proliferação celular foi determinada com o ensaio de MTT e ensaio de proliferação celular CellTrace CFSE em 24, 48, 72, 96 horas e 5 dias, respectivamente. Para as experiências de viabilidade, as células de cancro cervical com ou sem 10 nM de tratamento com paclitaxel de 72 horas foram plaqueadas (SiHa, 3 × 10

3 /poço na placa de 96 poços e 2 × 10

5 placa /cavidade em 6 poços ; CaSki, 2 × 10

3 /poço na placa de 96 poços e 1 × 10

5 /alvéolo em placa de 6 poços) e cultivadas durante a noite. No ensaio de MTT a absorvância das amostras foi medida com um leitor espectrofotómetro a 490 nm. Ensaio de proliferação de células CellTrace CFSE foi realizada por coloração cancro cervical activado com corante CellTrace CFSE proliferação de células (2,5 uM) (Invitrogen) e analisar usando por citometria de fluxo com filtros de excitação e emissão de 488 nm. Uma in vitro de paclitaxel quimio-sensibilidade de células de cancro do colo do útero foi avaliada utilizando o ensaio de MTS (Promega, Madison, WI) como descrito anteriormente [12]. Quatro cavidades replicadas foram usadas para cada análise, e pelo menos três experiências independentes foram executadas.

Análise Western Blot

Um total de 50 mg de proteína foi separada por desnaturação 8-15% de SDS-poliacrilamida electroforese em gel. A análise de Western foi realizada como previamente descrito [12]. Os filmes foram analisados ​​por densitometria com um sistema de imagem VersaDoc; Modelo 3000 (BioRad) utilizando Quantity One Software. A análise de variância com teste de Bonferroni para múltiplos testes foi utilizado para determinar a significância. Os anticorpos primários utilizados foram anti-Ncadherin (1:5000), anti-Ecadherin (1:2000), anti-fibronectina (1:1000), anti-vimentina (1:1000) e anti-actina (1:2000) quanto um controle endógeno, tudo a partir Epitomics Biotecnologia (Epitomics).

imunohistoquímica

Secções (6 mm de espessura) de tecido do tumor foram cortadas a partir paraffinised 23 casais de auto-emparelhado pré e pós-quimioterapia amostras cervicais cancerosas e análise imuno-histoquímica e scoring foram descritos anteriormente

12. Os anticorpos primários utilizados para análise imuno-histoquímica foram Ecadherin anti-anticorpo (1:1000) e anticorpo anti-actina como um controle endógeno (1:2000), tanto a partir de Epitomics Biotecnologia (Epitomics).

Construção e transfecção Lentivírus

Para gerar miR-375 e Ecadherin sobre-expressão transfectantes estáveis, as células cancerosas cervicais foram transfectadas com vectores lentivirais expressando. A construção de plasmídeo e um pacote de lentivírus estavam completas em GENECHEM Companhia. As sequências de pré-miR-375 foram amplificados e clonados no vector pGCsil-GFP usando os seguintes iniciadores: (Forward) HSA-pré-miR-375-Xhol-F, ACCGCTC GAGCCCCGCGACGAGCCCCTCGC; (Reverse) HSA-pré-mi-R-375-MfeI-R, ACCGCAATTGAAAAAGCCTCACGCGAGCCGAACG. O CDH1-HSA (CDS) do gene foi amplificado e clonado num vector de PGC-FU-GFP usando os seguintes iniciadores: (directo) 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAG-3 ‘, (inverso) 5′-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTCGTCCTCGCCGCCTCCGTACATG-3’. Os vírus de embalagem foram realizados em células HEK 293 células T após a co-transf ecção de 20 mg pGCsil-GFP-pré-miR-375 vector ou PGC-GFP-CDH1 vector com 15 mg do plasmídeo de empacotamento pHelper 1,0 vector e 10 mg do pHelper plasmídeo envelope 2,0 vector utilizando Lipofectamine 2000. Os vírus foram colhidas 48 h após a transfecção, e os títulos virais foram determinados. Os títulos do vírus utilizados neste estudo estavam no intervalo de 5 × 10

8~2 × 10

9 TU /mL.

Para gerar o miR-375 e Ecadherin sobre-expressão estável transfectantes, as células de cancro cervical foram transfectadas com vectores lentivirais expressando-se como anteriormente descrito [12]. Uma MOI = 5 foi usado para SiHa e MOI = 10 foi usado para CaSki. Após 4~7 d de transfecção, os clones estáveis ​​foram seleccionados com GFP por citometria de fluxo e colhidas para posterior experimentação. Um vector de PGC FU-GFP-NC-LV vazio foi utilizado como um controlo negativo.

luciferase Ensaio de Actividade

Para investigar se a expressão CDH1 foi regulada por miR-375, um psicheck-2 dual -luciferase miARN alvo vector de expressão (psicheck-2 -UTR vector) foi usado para realizar o ensaio de actividade de luciferase. O tipo selvagem e mutante 3’UTR do CDH1 adição de miR-375 previsto sítio de ligação foi sintetizado e inserido na região 3′-UTR a jusante do gene da luciferase do pirilampo de psicheck-2 vector (psicheck-2 -UTR) usando Xho I I e NotI locais de restrição. Todas as construções foram verificadas através de sequenciação. Após co-transf ectadas com o miR-375 imita (20 uM) e os vectores Repórter (0,2 ug /ml), as actividades da luciferase foram medidas após 24 horas, utilizando um sistema Dual-Glo de ensaio de luciferase (Promega). atividade luciferase relativa em todas as figuras se refere a Firefly actividades da luciferase normalizados para Renilla luciferase. células valores com vazia psicheck-2 vector foram ajustados igualmente a 1.

Análise Estatística

Os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes. Os resultados são expressos como média ± S.E.M. t-teste de um estudante independente ou um ANOVA foi utilizado para comparar variáveis ​​contínuas. teste de coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar a correlação entre duas variáveis ​​contínuas. P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Paclitaxel induzida EMT e inibiu a proliferação simultaneamente em células cancerosas cervicais

Quando a morfologia das células cancerosas cervicais rotineiramente cultivadas tratadas com ou sem paclitaxel foram examinadas por microscopia, observou-se que células SiHa cresceu tão firmemente-embalados “calçada”, como células epiteliais, enquanto que as células tratadas com paclitaxel parecia uma forma fusiforme achatada e perdeu a maioria de seus contatos célula-célula. (Figura 1a) Por outro lado, a expressão de proteína Ecadherin foi diminuída (10,5% ~66.6% e 43,75% ~67.6% com menos de 5 nM a 20 nM de tratamento com paclitaxel, respectivamente) e as expressões de Ncadherin e proteína fibronectina foram aumentados numa dose de resposta maneira. Também foram observados (Figura 1B) efeitos semelhantes em células CaSki. (Figura 1b, a figura S1).

(a) alterações morfológicas visíveis de “calçada”, como a “fibroblastos”, como células foi observada em SiHa após 72 h de tratamento paclitaxel. As células representativas com alterações morfológicas foram marcadas (b) Imunotransferência medida a expressão de Ecadherin e outras proteínas EMT relacionados (vimentina, Ncadherin, e fibronectina) em células de cancro do colo do útero (SiHa e CaSki) sob diferentes quantidades (0, 5, 10, 20 nM) de tratamento com paclitaxel. A expressão da proteína foi Ecadherin diminuiu e as expressões de vimentina, Ncadherin, e proteína fibronectina foram aumentados em células tratadas com paclitaxel durante 72 horas de uma forma de dose-resposta. Todas as expressões de as proteínas foram normalizadas para beta-actina e os dados em gráficos de barras são apresentados como a média de amostras triplas de três experiências independentes. Todas as barras de erro indicado S.E.M. (** P≤0.01, * p≤0,05). (C, d) A inibição da proliferação de células transientes e as alterações morfológicas induzidas pelo paclitaxel foram observadas. As alterações de proliferação em células SiHa e CaSki após a administração de paclitaxel foram analisados ​​por proliferação CellTrace CFSE célula (C) e ensaio de MTT (d) às 24 h, 72 h, 96 h, Dia 5, Dia 7, Dia 14, e no dia 21, respectivamente. A taxa de proliferação de paclitaxel e células tratadas SiHa CaSki foi significativamente reduzida no dia 7 e restaurado ao dia 21 após a administração de paclitaxel. As células CaSki sobreviveram foram restaurados em morfologia normal no dia 21 após a administração de paclitaxel.

Além disso, uma inibição da proliferação celular transitória induzida por paclitaxel, observou-se por citometria de fluxo e MTT. células SiHa e CaSki foram rotineiramente cultivadas com 10 nM de paclitaxel, após 72 horas, o paclitaxel foram removidos e as células foram cultivadas com meio completo continuamente, subsequentemente as alterações de proliferação em células SiHa e CaSki antes e depois da administração de paclitaxel revelou às 24 h, 72 h, 96 h, dia 5, dia 7, dia 14, e no dia 21, respectivamente. Como mostrado na Figura 1c, 1d, a taxa de proliferação de células tratadas com paclitaxel SiHa e CaSki no dia 7 foi significativamente reduzida (SiHa, p = 0,002 e p = 2,3 x 10

-5; CaSki, p = 3,1 x 10

-4 e p = 1,2 x 10

-5, respectivamente), em comparação com a do controlo em branco, e restaurados para os níveis antes do tratamento droga no dia 21. ao mesmo tempo, o “cobblestone”, como alterações morfológicas induzida por paclitaxel em células sobreviveram, também foram restaurados à morfologia normal no dia 21. estes factos indicam que o paclitaxel transitoriamente inibe a proliferação e induz a EMT simultaneamente em células cancerosas do colo do útero, mas todas essas mudanças induzida por paclitaxel revertida após a retirada da droga.

paclitaxel up-regula miR-375 durante a indução de inibição EMT e proliferação

Nós tinha explorado miR-375 expressão mudando envolvido em paclitaxel induzida EMT e proliferação de inibição em células de cancro do colo do útero, eo efeito dose-dependente clara de paclitaxel em miR-375 sobre-expressão foi observada

14. Além disso, a expressão regulada para cima progressiva de miR-375 atingiu um pico no dia 7 após a administração de paclitaxel, diminuiu gradualmente após paclitaxel removido e restaurado para o nível de antes do tratamento de drogas por volta do dia 21

14. Além disso, houve uma forte correlação negativa entre a expressão de miR-375 e a proporção relativa a proliferação de células cancerosas cervicais (SiHa, r = -0,472, P = 1,52 × 10

-3; CaSki, r = -0,835 , P = 3,03 × 10

-4). (Figura S2) Nossos dados revelaram que o paclitaxel-regulada a expressão de miR-375 e inibiu a proliferação simultaneamente em células cancerosas do colo do útero, mas ambas as alterações induzidas pelo paclitexel revertida após a retirada da droga, sugerindo que algumas das células cancerosas cervicais sobreviver em paclitaxel, provavelmente, embora para cima a regulação da expressão de miR-375 e a aquisição de fenótipos mesenquimais malignas, em seguida, o desenvolvimento de um potencial de diminuir a proliferação e resistir à toxicidade do fármaco. Estes correlação sugerem que miR-375 sobre-expressão pode ter um papel causal na quimioterapia EMT induzida.

miR-375 medeia EMT diretamente pela segmentação Ecadherin

Por miRDB e TargetScan análise de programas de pesquisa, encontrado um previu ligação de miR-375 com CDH1 (Ecadherin) 3′-UTR, o que indicou que era Ecadherin um potencial alvo directo de miR-375 (Figura 2c). Para determinar ainda que Ecadherin é um gene alvo de miR-375, que em primeiro lugar analisar a relação entre Ecadherin e expressão de miR-375 em células de cancro do colo do útero, sob diferentes quantidades de tratamento com paclitaxel. Como mostrado na Figura 1B e Figura S2, a expressão de miR-375 em células era marcadamente não regulada de uma forma dependente da dose durante o processo de EMT induzida por paclitaxel, assim como a proteína Ecadherin e miR-375 de expressão foram inversamente correlacionados (r = -0,752, P = 2.32 × 10

-4). Em seguida, utilizou-se ainda mais a luciferase Ensaio de Actividade para confirmar a ligação do miR-375 para a 3′-UTR de Ecadherin. (Figura 2c).

(a), imagens de contraste de fase de células de cancro cervical infectadas com o vector de lentivírus pré-miR-375 ou negativo e controlo em branco. (B) medição Immunoblotting de Ecadherin e EMT proteínas relacionadas em tercells câncer cervical infectadas com o lentivírus vetor pré-miR-375 ou negativo. (C) Um previu a formação de duplex entre CDH1 humana (Ecadherin) 3′-UTR e miR-375. A actividade de luciferase foi reduzida observada após a co-transfecção de Ecadherin 3′-UTR do tipo selvagem do vetor com miR-375, mas não mutado ou vector vazio (p = 0,014). Os dados de um-C foram apresentados como a média de amostras triplas de experiências independentes. Todas as barras de erro indicado S.E.M. (** P≤0.01, * p £ 0,05).

Para testar se a sobre-regulação de miR-375 contribuiu para o paclitaxel EMT induzida, os efeitos de miR-375 sobre-expressão em foram avaliadas estes eventos. A expressão de miR-375 foi analisada por PCR em tempo real na segunda semana, a terceira semana e primeiro mês após a pré-miARN transfecção estável de lentivírus. Tal como mostrado na Figura 2a e 2b, o forçado sobre-expressão de miR-375 processo EMT induzida em células do cancro do colo do útero, caracterizado por aquisição de morfologia de células do tipo fibroblastos, a supressão da expressão Ecadherin (65% ~69.2%), e aumento de vimentina, Ncadherin, e expressão fibronectina, semelhante aos efeitos observados nas células tratadas com paclitaxel.

Assim, os nossos resultados indicam que o miR-375 sobre-expressão induzida promove EMT-paclitaxel, em parte, por direccionamento directamente Ecadherin no cancro do colo do útero células.

EMT regula a sensibilidade paclitaxel, mas não miR-375 expressão

Para determinar se EMT pode regular miR-375 expressão inversamente, o próximo conjunto de experimentos foi realizada. Nós induzida EMT por TGF-β1 ou EGF-β em células de cancro do colo do útero (SiHa e CaSki) e observou a influência da EMT na sensibilidade paclitaxel e miR-375 expressão. Estimulada por TGF-β1 ou EGF-β, células de cancro cervical EMT submetidos acompanham mudanças visíveis morfológicas (Figura 3A), tais como a aparência de uma forma fusiforme em células, e EMT marcador alteração, incluindo a diminuição da expressão da proteína Ecadherin (28,5% ~ 65,8% para o TGF-β1 e 47,5% ~67.6% para EGF-β), bem como o aumento Ncadherin, vimentina e expressão da proteína fibronectina (Figura 3c). No entanto, a expressão de miR-375 não foi alterada durante o TGF-β1 ou EGF-β induzida processo EMT em células de cancro do colo do útero (SiHa,

p

= 0,538; CaSki

p

= 0,542) (Figura 3d).

(a) alterações morfológicas visíveis em SiHa e CaSki sob TGF-β1 ou indução EGF-β. (B) análise MTS de paclitaxel-sensibilidade em células de câncer do colo do útero. (C) Análise de imunotransferência de Ecadherin e outras proteínas relacionadas após EMT TGF-β1 ou indução de EGF-β. (D) miR-375 expressão em SiHa e CaSki sob TGF-β1 ou indução EGF-β. Dados em b-d foram apresentados como a média de amostras triplas de experiências independentes. Todas as barras de erro indicado S.E.M. (** P≤0.01, * p≤0,05).

Além disso, nós delineado a sensibilidade de drogas de células submetidos a EMT usando ensaio MTS. A sensibilidade paclitaxel foi significativamente diminuída em células SiHa e CaSki após TGF-β1 ou estimulação EGF-β em comparação com controlos de cultura isentos de soro (Figura 3b). Os valores de IC50 foram aumentados em SiHa e CaSki com 5 ng /ml de TGF-β1 (95,81 ± 2,53 nM e 66,66 ± 2,32 nM, respectivamente, SiHa,

P

= 0,032; CaSki,

P

= 0,023) ou 2 ng /estimulação EGF-β ml (96,74 ± 2,47 nM e 94,78 ± 1,72 nM, respectivamente, SiHa,

p

= 0,038; CaSki

p

= 0,028) em comparação com soro controlos de cultura livre de (24,54 ± 1,37 nM, e 23,98 ± 2,62 nM, respectivamente).

Nossas descobertas indicam que o TGF-β1 ou EGF-β induz EMT mas dose não alteram miR-375 expressão em células de câncer cervical, células cervicais e semelhantes a células mesenquimais cancerígenas induzida por TGF-β1 ou EGF-β são tipicamente resistentes paclitaxel. A expressão significativamente regulada de miR-375 em paclitaxel trataram células caner cervical é induzida por paclitaxel, mas não EMT.

Ecadherin sobre-expressão atenua a capacidade miR-375 para mediar EMT e paclitaxel resistência

Ecadherin não é apenas uma molécula importante na iniciação da EMT, mas também um marco para EMT e miR-375 medeia EMT diretamente pela segmentação Ecadherin.To investigar o papel do Ecadherin na EMT e sensibilidade paclitaxel e para testar se o aumento da regulação ofEcadherin pode atenua o efeito de miR-375 em EMT e paclitaxel-resistência em células de cancro do colo do útero; o Ecadherin sobre-expressos lentviral vector PGC-flag-CDH1 foi usado. Nós respectivamente transfectadas Ecadherin sobre-expresso do vetor lentviral e controlo negativo em células SiHa e CaSki com e sem o miR-375 sobre-expressão, e observou-se que o efeito da expressão forçada sobre Ecadherin em EMT e paclitaxel-resistência. Em Ecadherin que sobre-expressam clones com e sem o miR-375 sobre-expressão, houve um aumento acentuado e significativo na expressão de Ecadherin (Figura 4a). Em células sem miR-375 sobre-expressão, não foram observadas diferenças notáveis ​​de marcadores morfológicos e mesenquimais em células SiHa e CaSki após Ecadherin expressão over-, que é provavelmente porque suas células parentais já exibia um fenótipo epitelial. Contrariamente, em células com o miR-375 sobre-expressão, não havia uma transição a partir de células fibroblásticas isoladas para “paralelepípedo”, como as células epiteliais. Enquanto isso, as expressões de Ncadherin, vimentina, e fibronectina foram diminuiu significativamente após Ecadherin sobre-expressão (Figura 4a, 4c).

Immunoblotting (a) e MTS (b) análise da Ecadherin e outras proteínas relacionadas EMT em SiHa com e sem miR-375 superexpressão após a Ecadherin expressando ou negativo transfecção lentivírus vetor. Os dados em (a) e (b) foram apresentados como a média de amostras triplas de experiências independentes. Todas as barras de erro indicado S.E.M. (** P≤0.01, * p≤0:05). (C) As alterações morfológicas em SiHa com e sem miR-375 sobre-expressão após a Ecadherin expressando ou negativo transfecção lentivírus vetor. As células representativas com alterações morfológicas foram rotulados.

O paclitaxel quimio-sensibilidade foi então avaliada por ensaios MTS. Como esperado, a sensibilidade paclitaxel foi significativamente aumentada em células transfectadas Ecadherin-lentvirus com e sem o miR-375 sobre-expressão em comparação com células de controlo. Os valores de IC50 foram diminuídos em SiHa e CaSki com Ecadherin superexpressão (12,82 ± 2,54 nM e 7,62 ± 0,93 nM, respectivamente, SiHa,

p

= 0,043; CaSki,

p

= 0,038) em comparação com controles negativos (20,73 ± 1,23 nm e 11,68 ± 0,62 nM, respectivamente, SiHa,

p

= 0,028; CaSki,

p

= 0,021). Além disso, a resistência ao paclitaxel foi significativamente atenuada após Ecadherin foi efectivamente sobre-expressos em células cervicais com sobre-expresso de miR-375 em comparação com o controlo negativo (Figura 4b). Os valores de IC50 foram diminuídos em SiHa e CaSki com Ecadherin e miR-375 cotransfec�o (22,82 ± 3,54 nM e 13,68 ± 0,64 nM, respectivamente, SiHa,

p

= 0,033; CaSki,

p

= 0,038) em comparação com SiHa e CaSki com o controle negativo e miR-375 cotransfec�o (82,83 ± 2,23 nM e 20,31 ± 3,01 nM, respectivamente, SiHa,

p

= 0,032; CaSki,

p = 0,025

). Os nossos resultados mostraram que Ecadherin sobre-expressão aumentada de forma significativa a sensibilidade paclitaxel em células de cancro do colo do útero, com ou sem o miR-375 sobre-expressão, o que sugere que Ecadherin sobre-expressão aumenta drasticamente a sensibilidade paclitaxel, ainda mais, a re-expressão de Ecadherin inverte, pelo menos em parte, o fenótipo EMT e paclitaxel-resistência mediada por miR-375 em células de cancro do colo do útero.

miR-375 sobre-expressão correlaciona-se com a expressão Ecadherin em humanos tecidos pós-quimioterapia de carcinoma cervical

Para estabelecer a relevância clínica de miR-375 entre as expressões Ecadherin sob efeitos de quimioterapia, avaliamos a expressão de miR-375 e Ecadherin em 23 casais de auto emparelhado tecidos de câncer do colo do útero humanos pré e pós-quimioterapia. A imunocoloração para Ecadherin revelou expressão mais amplo e mais forte no pré-quimioterapia do que em tecidos de tumor de pós-quimioterapia (Figura 5). Ao mesmo tempo, o miR-375 foi marcadamente regulada positivamente (4,67 vezes) em amostras cervicais tratados com paclitaxel, Ecadherin e miR-375 correlacionada inversamente expressão foram em todos os tecidos, incluindo pré- e pós-quimioterapia (r = -0,905, P = 1,81 × 10

-3) (Tabela S1).

(a) Ecadherin e miR-375 correlacionada inversamente expressão foram em todos os tecidos, incluindo pré- e pós-quimioterapia (r = -0,905, P = 1,81 × 10

-3). (B) Coloração de expressão específica Ecadherin-humano em três representantes (1 DP 2 e PR) (x 200). Uma expressão Ecadherin diminuição foi mostrado nos tecidos após a quimioterapia (p = 0,0023).

De todos os 23 pacientes, 19 eram sensíveis à quimioterapia e 4 quimio-resistência, a expressão regulada positivamente de miR-375 é de forma mais significativa em pacientes quimio-resistência quando comparado tecidos pós-quimioterapia com sua auto emparelhado tecidos pré-quimioterapia (6,7 ± 2,3 vezes na quimio-resistência e 4,35 ± 0,63 vezes em doentes quimiossensíveis respectivamente,

p

= 0,033) . Mas deve notar-se que não há energia suficiente para concluir que a expressão de miR-375 é mais elevado em pacientes quimio-resistência, parcialmente devido ao pequeno tamanho da amostra para os pacientes quimio-resistência (N = 4).

Discussão

Chemo-resistência é um dos fatores causais chave em recidivas e progressão do câncer. A maioria das células cancerosas responde bem à quimioterapia inicialmente, mas, eventualmente, desenvolve resistência após exposição à droga. evidências emergentes revelaram que as células de cancro submetidos a EMT promove a sobrevivência de células e resistência à quimioterapia [3]. Embora tenha sido relatado que miARN pode desempenhar um papel integral na modulação EMT [16]; No entanto, o procedimento de regulação detalhada permanece por explorar. miR-375 foi inicialmente encontrado para ser expresso em ilhéus pancreáticos, onde regula a secreção de insulina e metabolismo de glucose [17]. Recentemente, miR-375 foi identificado como um regulador importante na tumorigênese e progressão do cancro; no entanto, as funções específicas desta miRNA permanecem em grande parte obscura. miR-375 foi identificado como um supressor de tumor na maioria dos cânceres, como câncer gástrico [18], [19], câncer de fígado [20], de cabeça e de carcinoma de células escamosas do pescoço [21] e próstata [22], mas peças um papel oncogênico no cancro da mama ERa-positivos [23], em pacientes de adenocarcinoma de pulmão [24], e em pacientes positivos HCC HBV [25]. Assim, estes relatos conflitantes sobre a associação entre nível de miR-375 e câncer sugeriu uma relação específica mais complexo e, possivelmente, câncer. Em outro estudo nosso, observou-se a associação entre o miR-375 sobre-expressão e -Resistência paclitaxel em câncer cervical

16. Aqui, nós ligar diretamente miR-375 para o processo de EMT induzida pela quimioterapia no cancro cervical. Encontrámos pela primeira vez que o paclitaxel inibe a proliferação, induz EMT, e regula-se-miR-375 a expressão de uma forma dependente da dose ao mesmo tempo em células de cancro do colo do útero, mas todas essas alterações induzidas pelo paclitaxel revertido após retirada da droga. Mecanisticamente, ectópica sobre-expressão de miR-375 resultou em expressão Ecadherin reduzida e acompanhada por características mesenquimais adquiridos e quimio-resistência em células de cancro do colo do útero. Assim, nossos resultados sugerem que o paclitaxel não elimina todas as células cancerosas do colo do útero e algumas das células residuais podem sobreviver sob exposição à droga. Durante este procedimento, as células de cancro cervical residuais com expressão sobre-regulada de miR-375, provavelmente, possuem um potencial de aquisição de fenótipos mesenquimais, abrandar a proliferação, e resistir à toxicidade do fármaco.