Sumário

O anti-inflamatório proteína anexina A1 (ANXA1) foi associada com a progressão e metástase do cancro, sugerindo o seu papel na regulação da proliferação de células tumorais. Nós investigamos o mecanismo de interação ANXA1 com receptor do peptídeo formilado 2 (FPR2 /ALX) no controle, amostras de tecido peritumoral e laringe tumor de 20 pacientes, para quantificar os neutrófilos e mastócitos, e para avaliar a expressão de proteínas e co-localização de ANXA1 /FPR2 nestas células inflamatórias e de células escamosas da laringe por imunocitoquímica. Além disso, foram realizadas experiências in vitro para investigar o papel funcional de ANXA1 /FPR2 na proliferação e metástase de células Hep-2, uma linha de células de carcinoma epidermóide de laringe, após o tratamento com ANXA1

2-26 (anexina A1 -N-terminal derivado de péptido), Boc2 (antagonista de FPR) e /ou dexametasona. De acordo com estes tratamentos, o nível de proliferação de células Hep-2, citocinas pró-inflamatórias, ANXA1 /co-localização FPR2, e a sinalização de prostaglandinas foram analisadas utilizando o método ELISA, imunocitoquímica e PCR em tempo real. Um influxo de neutrófilos e mastócitos desgranulados foi detectado em amostras de tumor. Nestas células inflamatórias das amostras tumorais e peritumorais, expressão ANXA1 /FPR2 foi marcadamente exacerbada, no entanto, em células de carcinoma da laringe, esta expressão foi regulada para baixo. ANXA1

26/2 tratamento reduziu a proliferação das células Hep-2, um efeito que foi bloqueado por Boc2, e expressão sobre-regulada ANXA1 /FPR2. ANXA1

26/2 tratamento reduziu também os níveis de citocinas pró-inflamatórias e afectou a expressão de metaloproteinases e receptores EP, que estão envolvidos na sinalização de prostaglandina. No geral, este estudo identificou potenciais papéis para o mecanismo molecular da ANXA1 /FPR2 interação no câncer de laringe, incluindo a sua relação com a prostaglandina, proporcionando pontos de partida promissores para futuras pesquisas. ANXA1 pode contribuir para a regulação do crescimento de tumores e metástases através de mecanismos parácrinos que são mediadas por FPR2 /ALX. Estes dados podem levar a novos alvos biológicos para intervenção terapêutica em câncer de laringe humana

Citation:. Gastardelo TS, Cunha BR, Raposo LS, Maniglia JV, Cury PM, Lisoni FCR, et al. (2014) Inflamação e Cancro: Papel da anexina A1 e FPR2 /ALX na proliferação e metástase in Human laringe carcinoma espinocelular. PLoS ONE 9 (12): e111317. doi: 10.1371 /journal.pone.0111317

editor: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de dezembro de 2013; Aceito: 30 de setembro de 2014; Publicação: 09 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gastardelo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (subvenções 2008 /08187-4 para SMO e 2008 /01655-2 para TSG) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (concessão 302768 /2010- 6 a SMO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de laringe é um dos tipos mais comuns de tumores de cabeça e pescoço que tem uma alta taxa de mortalidade e um prognóstico pobre [1]. Mais de 12.500 novos casos de câncer de laringe são diagnosticados anualmente e 3.560 mortes anuais ocorrem [2]. O desenvolvimento de um melhor tratamento, bem como abordagens melhor diagnóstico e prevenção requer um entendimento melhorado do processo complexo de tumorigénese da laringe.

Apenas 5% a 10% de todos os cancros são provocados por a herança de genes mutados, enquanto os restantes 90% a 95% dos casos têm sido associados a alterações genéticas e epigenéticas causadas pelo estilo de vida e fatores ambientais, como tabagismo e consumo de álcool [3], [4]. É agora bem reconhecido que a inflamação é um factor de risco para a maioria dos tipos de cancro, incluindo carcinomas da laringe [5], [6]. A inflamação crónica tem sido associada a vários passos envolvidos na tumorigénese, incluindo a transformação celular, promoção, proliferação, invasão, angiogénese e metástase [7], [8]. Hanahan e Weinberg, na sua revisão recente [9], inflamação reconhecidas como uma nova marca do cancro que promove múltiplas características de tumor.

células inflamatórias secretam numerosas citocinas, quimiocinas e factores de crescimento que podem estimular a proliferação, inibir a apoptose, induzir morfogénese e gerar espécies reactivas de oxigénio danificam o ADN [7], facilitando instabilidade genómica [10]. Além disso, estas células sintetizam factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiopoetin, metaloproteinases e outras proteínas que podem estimular a mitose celular endotelial vascular e a remodelação da matriz extracelular [11]. Portanto, inflamação gera não apenas mudanças no microambiente para promover câncer, mas também as mudanças que estimulam a progressão neoplásica.

Tem sido demonstrado que os mastócitos e neutrófilos podem ser recrutados por células tumorais. O aumento do número de mastócitos foram relatados em mamaria [12] e os carcinomas do pulmão [13], entre outros tumores. A evidência experimental indicou que os mastócitos activados libertam factores de crescimento angiogénico e seus reguladores, prostaglandinas, metaloproteinases e citocinas [14], e pode desempenhar um papel duplo na promoção ou inibição do crescimento tumoral, dependendo das condições do estroma locais [15], [16]. Dos tipos de células que residem no microambiente tumoral, neutrófilos associados a tumores (TANs) têm recebido pouca atenção [17]. Embora não haja evidências sugerindo um papel para os neutrófilos de progressão da doença aumentada em tumores humanos específicos, a relação entre a infiltração de neutrófilos e prognóstico no câncer humano não tem sido sistematicamente investigado [18]. O papel dos neutrófilos em progressão tumoral permanece controverso [19], em grande parte porque estas células têm ambas as funções de promoção de tumores e tumoricidas, dependendo da presença de factor de crescimento transformante beta (TGF-β) [20], [21].

a partir destes estudos, é claro que vários mediadores inflamatórios são expressos diferencialmente em vários tipos de cancro e pode estimular a progressão da doença [22]. Assim, os agentes que suprimem estes mediadores inflamatórios representar alvos potenciais para o tratamento do cancro. A anexina anti-inflamatória proteína 1 (ANXA1), um membro de 37 kDa da superfamília de anexina, é uma proteína regulada por esteróides que está implicada na mediação de algumas das actividades benéficas dos glicocorticóides [23], incluindo a regulação da proliferação celular [ ,,,0],24], diferenciação [25] e metástase [26].

a desregulação da ANXA1 tem sido relatada em diversas neoplasias, o que sugere que esta proteína pode desempenhar papéis importantes no desenvolvimento e progressão do tumor [27]. ANXA1 é overexpressed no cancro da mama [28] e carcinoma hepatocelular [29], mas é marcadamente regulada no esôfago [30], [31] e carcinomas da cabeça e pescoço [32]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais ANXA1 modula respostas celulares não foram totalmente determinados.

Os avanços nesta área têm mostrado uma ligação funcional entre as propriedades anti-inflamatórias do ANXA1 e receptor para formil-Met-Leu-Phe (fMLP) FPR [33], uma classe específica de receptores de G-7 transmembranares acoplados à proteína [34]. Nos seres humanos, três membros da família foram identificados, FPR1, FPR2 /ALX (FPRL1) e FPR3 (FPRL2) [35]. Alguns dos efeitos de ANXA1 exógeno pode ser atenuada por Boc2, um antagonista de ambos FPR1 FPR2 e [33]. Recentemente, tem sido mostrado que o péptido N-terminal ANXA1, ANXA1

26/2, promove a migração de fibroblastos da pele humana WS1 [36], e a capacidade de invasão de 15 SKCO-se células de adenocarcinoma colorrectal [24] através da interacção com FPRs. No entanto, não há dados disponíveis sobre o papel da ANXA1 e FPRs em carcinoma de células escamosas da laringe.

várias vias de sinalização medeiam tumorigênese associada à inflamação. Por exemplo, ciclo-oxigenase-2 (COX-2), uma enzima envolvida na conversão de ácido araquidónico em prostaglandinas, é considerado como desempenhar papéis importantes no desenvolvimento do cancro, através da modulação da proliferação celular e outros processos biológicos importantes através dos seus metabolitos, acoplado a proteína G receptores e efectores a jusante [37]. COX-2 é sobre-regulado em várias malignidades [38] – [40], incluindo carcinomas da cabeça e pescoço [41]. Na verdade, Abrahao et al. (2010) têm mostrado que a pró-inflamatória da COX-2 metabolito da prostaglandina E2 e do seu receptor EP3 pode activar as células de carcinoma da cabeça e do pescoço para proliferar e é um alvo potencial para abordagens preventivas. Considerando-se que os glucocorticóides são inibidores altamente eficazes da COX-2 [42], a anexina proteína A1 regulada por esteróides, que está implicada na mediação de algumas das actividades de glucocorticóides, podem também estar envolvidos na rede inflamatória ligada à COX-2.

Dado o papel potencial para ANXA1 em várias neoplasias, como a regulação da proliferação celular, diferenciação e metástase, que incidiu sobre os mecanismos moleculares pelos quais ANXA1 modula estas respostas celulares. Neste relatório, que mostrou que a proteína ANXA1 é sub-regulada no carcinoma da laringe humano e pode regular o crescimento do tumor de uma forma parácrina que é mediada pelo receptor de FPR2 /ALX. Esta investigação demonstra a importância potencial desta ANXA1 /FPR2 interação na tumorigênese. No geral, este estudo identificou potenciais papéis para o mecanismo molecular dessa interação de proteínas no câncer de laringe, incluindo a sua relação com a prostaglandina, fornecendo evidências para o potencial da ANXA1 como um alvo terapêutico e pontos de partida promissores para futuras pesquisas.

Materiais e Métodos

Amostras de tecido

invasivos tecidos de câncer de laringe humanos foram obtidos de 20 pacientes com carcinoma epidermóide de laringe que foram tratados no Hospital de base de São José do Rio Preto, Brasil . Os pacientes eram do sexo masculino, tabagistas alcoólicas, a idade variou de 50 a 80 anos, e nenhum deles tinha recebido radioterapia ou quimioterapia antes da intervenção. Em cada paciente (n = 20), as amostras de tumor cirúrgicos foram recolhidos a partir do centro do tumor da laringe, as amostras foram recolhidas peritumorais a partir da periferia do tumor, e as amostras de controlo foram recolhidas a partir da região livre de células tumorais. Devido à grande heterogeneidade de carcinoma da laringe, os tecidos tumorais foram dissecados e revisados ​​por um patologista sênior e foram caracterizados como moderadamente diferenciados, carcinomas invasivos. Estas amostras de tecido foram utilizados num estudo prévio que foi realizado no nosso laboratório, e o número de pacientes era suficiente para se obter dados estatisticamente significativos [32]. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo, Faculdade de Medicina, Brasil (CEP-0300/08) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes envolvidos.

Cultura celular

a linha celular Hep-2, que foi originalmente estabelecido a partir de um carcinoma epidermóide da laringe, foi utilizado no presente estudo (ATCC, Rockville, Maryland, EUA). autenticação de linha celular foi realizada utilizando o Kit AmpFLSTR Identifiler Amplificação por PCR (Life Technologies) no Laboratório de Técnicas Especiais, Hospital Israelita Albert Einstein (LATE -HIAE), São Paulo. Encontramos 100% de identidade da nossa linha de células comparado com o banco de dados do American Type Culture Collection (ATCC). As células foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

6 células em um-cm 75

frasco de cultura de 2 (Corning, NY, EUA) e incubou-se em meio MEM-Earle (Cultilab, Campinas, Brasil) , pH 7,5, suplementado com 20% de soro fetal de vitelo (Cultilab), aminoácidos não essenciais a 1%, e 0,1% de antibiótico /solução antimicótica (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA), a 37 ° C numa atmosfera húmida de 5% de CO

2 [43].

Drug Treatment

Para as experiências farmacológicas, células Hep-2 foram semeadas como descrito anteriormente. Vinte e quatro horas mais tarde, depois de as células já haviam aderido, que foram incubadas em meio isento de soro para sincronizar o ciclo celular. Após um período adicional de 24 horas, o meio foi substituído com meio de crescimento completo contendo o seguinte: (a) 1? M de ANXA1

26/2 péptido (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (Invitrogen); (B) 1? M de ANXA1

2-26 e 10 uM péptido Boc2, um antagonista não selectivo FPR (N-t-BOC-Met-Leu-Fe) (MP Biomedicals, Aurora, OH); (C) 0,01? M de dexametasona (um glicocorticóide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA); (D) de 0,01 uM e 10 uM de dexametasona Boc2; ou (e) de 10 uM Boc2 sozinho. Os fármacos foram dissolvidos primeiro em pequenas quantidades de dimetil sulfóxido (DMSO) e depois diluiu-se em meio de (a concentração final de DMSO nunca excedeu 1%). As concentrações das drogas foram seleccionados com base em experiências preliminares e os dados da literatura, [44] [32]. As células de controlo foram tratadas com meio completo com a mesma concentração de DMSO utilizada para diluir os fármacos. Cada 2 dias, o meio foi substituído com meio fresco contendo os fármacos com a mesma dose; a morfologia celular foi observada todos os dias [43]. Após 6, 24, 48, 72 e 96 horas, controle e células tratadas foram colhidas e contadas usando o contador de células condessa Automated (Invitrogen).

Fixation, processamento e Incorporação de Luz e Microscopia Eletrônica

amostras laríngea e células HEp-2 foram fixadas em paraformaldeído a 4%, glutaraldeído a 0,5%, e tampão de cacodilato 0,1 mol /L de sódio (pH 7,4) durante 24 horas a 4 ° C, lavadas em cacodilato de sódio, desidratados através de percentagens graduadas de etanol e embebidos em LRGold (Londres Resin Co., Reading, Reino Unido). Para as análises histopatológicas e morfológicas, cortes de tecido (0,5 mm de espessura) foram cortados em um ultramicrotome (Reichert Ultracut; Leica, Áustria), coradas com 1% de azul de toluidina em solução de bórax a 1% (TAAB Laboratories, Aldermaston, UK) e examinadas usando um microscópio Zeiss Axioskop 2-Mot Plus (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Para microscopia eletrônica, as secções (~ 90 nm) foram cortados em um ultramicrotome e colocadas em grades de níquel para a rotulagem immunogold [45].

immunogold Rotulagem dos tecidos pós-incorporados

reacção Imunocitoqu�ica (duplo rotulagem) foi utilizado para detectar a expressão e co-localização de ANXA1 e FPR2 /ALX em mastócitos, neutrófilos, e células de controlo e de tumores de tecidos da laringe e células HEp-2.

as células HEp-2 foram incubadas com meio controle, ANXA1

2-26 e ANXA1

2-26 + Boc2. Após 48 horas, a cultura foi colhida, e as células foram embebidos em resina LRGold para análise imunocitoquímica. Secções ultrafinas de tecidos da laringe e células HEp-2 foram incubadas de um modo passo-a-passo, utilizando os seguintes reagentes e /ou condições, à temperatura ambiente: 1 de água) destilada; 2) tampão fosfato 0,1 mol /l, contendo 1% de albumina de ovo (PBEA); 3) 0,1 mol /L em PBS contendo 5% PBEA durante 30 minutos; 4) LCPS1 anticorpo policlonal de ovelha, induzido contra o segmento N-terminal da ANXA1 (1:500 em PBEA) e anticorpo policlonal de coelho FPR2 /ALX (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (1:500 em PBEA) durante 2 horas; soros de ovelha e de coelho normal foram usadas como controlo (1:500); 5) três lavagens em PBEA contendo 0,01% de Tween 20; Foi adicionado 6), de burro IgG anti-ovelha (fragmento Fc-específica) anticorpo (1:100 em PBEA) conjugado com ouro coloidal de 15 nm (British Biocell, Reino Unido) para detectar ANXA1, e IgG anti-coelho de cabra (fragmento Fc foi adicionado espec�ico) anticorpo (1:100 em PBEA) conjugado com ouro coloidal de 10 nm (Biocell britânica) para detectar FPR2 /ALX). Após 1 hora, as secções foram lavadas em PBEA contendo 0,01% de Tween 20, e depois com água destilada [46]. As secções foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo antes do exame em um ZEISS LEO 906 microscópio eletrônico (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).

Multiplex Assays

Para quantificar as citocinas pró-inflamatórias interleucinas 6 (IL-6) e IL-8, bem como proteína quimiotáctica de monócitos-1 (MCP-1), nos sobrenadantes de cultura de células Hep-2, utilizou-se o instrumento multiplex xMAP da Luminex MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA) . As células foram incubadas com meio de controlo, ANXA1

26/2, ANXA1

2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 ou Boc2. Após 48 horas de tratamento, os sobrenadantes de cultura foram removidas, centrifugadas e armazenadas a -20 ° C. esferas de anticorpo, controles de tampão de lavagem, matriz de soro e padrões foram preparados seguindo as instruções do fabricante (MILLIPLEX HCYTOMAG-60K kit). Em seguida, 200 ul de tampão de lavagem foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços e misturou-se magnético num agitador durante 10 min. O tampão de lavagem foi decantado, e 25 ul de padrões, controlos e amostras foram adicionados aos poços. Em seguida, 25 ul de tampão de ensaio foi adicionado às amostras, e 25 ul de matriz de soro foi adicionado às normas. Finalmente, 25 ul de contas magnéticas (revestido com um anticorpo de captura específico) foi adicionado a todos os poços e incubou-se durante a noite a 4 ° C num agitador. No dia seguinte, a placa foi lavada com tampão de lavagem e incubou-se com 25 ul de anticorpos de detecção durante 1 hora, num agitador. Em seguida, 25 ul de estreptavidina-ficoeritrina foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 30 minutos num agitador. A placa foi lavada e incubada com 150 ul de fluido de accionamento para 5 minutos num agitador. Finalmente, a placa foi analisada com o software utilizando MAGPIX Xponent [47].

-PCR em tempo real

As células HEp-2 foram incubadas com meio de controlo, ANXA1

ou 2-26 ANXA1

2-26 + Boc2 e colhidas após 48 horas. O ARN total foi extraído utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADN genómico foi removido por tratamento com DNase de acordo com a descrição do fabricante (Promega). Alíquotas (2 ug) de ARN total a partir de células tratadas e de controlo foram usadas para a síntese de cDNA de cadeia dupla usando um kit de Alta Capacidade cDNA Archive (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. Quatro genes diferencialmente expressos (

EP3

ou

PTGER3

,

EP4

ou

PTGER4

,

MMP2

e

) foram selecionados para quantitativa em tempo real experiências de PCR de acordo com o seu envolvimento directo ou indirecto nos processos inflamatórios e metastáticos com base no banco de dados Gene Ontology (https://www.geneonthology.org/). PCR em tempo real foi realizada em triplicado usando um rápido em tempo real do sistema de PCR 7500 (Applied Biosystems). A mistura de reacção consistiu de uma solução com o volume total de 20-ul contendo 10 ul da mistura de alimentação SYBR Green PCR Master (Applied Biosystems), uma solução 1