Sumário
As tirosina quinases receptoras (RTKs), em resposta a seus ligantes factor de crescimento, fosforilar e activar os sinais a jusante importantes para o desenvolvimento fisiológico e patológico transformação. O aumento da expressão, activação de mutações de rearranjo e fusões de RTKs levar a cancro, inflamação, dor, doenças neurodegenerativas, e outras desordens. A activação ou a sobre-expressão de ALK, ROS1, TRK (A, B, e C), e RET estão associados com fenótipos oncogénico dos respectivos tecidos, tornando-os alvos terapêuticos atractivos. estudos de matriz de cDNA do cancro demonstrada a sobre-expressão de TRK-A e ROS1 em uma variedade de cancros, em comparação com os seus respectivos controlos de tecido normal. Nós sintetizada uma biblioteca de moléculas pequenas que inibem as RTKs indicados acima com picomolar a potência nanomolar. A molécula de chumbo GTx-186 inibiu RTK dependente de células cancerosas e o crescimento do tumor.
In vitro
e
in vivo
crescimento de IMR-32 células de neuroblastoma TRK-dependente A e células NIH3T3 ROS1-sobre-expressam foram inibidos por GTx-186. GTx-186 também sinais inibidos inflamatórias mediadas por NFkB, AP-1, e TRK-A e potentemente reduzida dermatite atópica e do ar-bolsa de inflamação em murganhos e ratos. Além disso, GTx-186 inibia eficazmente a fosforilação ALK e ALK crescimento de células cancerígenas dependentes. Colectivamente, o inibidor RTK GTx-186 tem um perfil único quinase com potencial para tratar o câncer, inflamação e dor neuropática
Citation:. Narayanan R, Yepuru M, Coss CC, Wu Z, Bauler MN, Barrett CM , et ai. (2013) Descoberta e pré-clínica caracterização de novos pequena molécula TRK e ROS1 tirosina quinase inibidores para o tratamento de câncer e inflamação. PLoS ONE 8 (12): e83380. doi: 10.1371 /journal.pone.0083380
editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 11 de outubro de 2013; Aceito: 02 de novembro de 2013; Publicação: 26 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Narayanan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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Introdução
O receptor tirosina quinase (RTK) a família é composta de proteínas 58 transmembranares que regulam muitos funções celulares incluindo a proliferação, a migração e a progressão do ciclo celular [1]. O aumento da expressão, activação de mutações, rearranjos de fusão, ou coativação destes proto-oncogenes promover a transformação oncogénica dos respectivos tecidos [2], [3]. Devido à sua importância funcional, as RTK têm evoluído como alvos terapêuticos para o tratamento do cancro, inflamação, dor, doenças neurodegenerativas, e outros [4]. descoberta esforços para desenvolver inibidores de pequenas moléculas ou anticorpos de RTKs têm aumentado exponencialmente nos últimos 10-15 anos. Desde a descoberta de BCR-Abl rearranjo e a sua imatinib inibidor, outros inibidores de RTK, tais como crizotinibe (inibidor de ALK), afatinib (inibidor de EGFR), e lenvatinib (inibidor VEGFR), têm sido desenvolvidos para indicações oncológicas [5] – [7 ].
quinase relacionadas com a tropomiosina
(TRK) é uma família de três RTKs (TRK-a, TRK-B, e TRK-C) regulam várias vias de sinalização que são importantes para a sobrevivência e diferenciação de neurónios [8 ], [9]. Para além da sua função crítica em neurónios, eles e os seus ligandos (factor de crescimento do nervo (NGF), factor de crescimento derivado do cérebro (BDNF), neurotrofinas e, respectivamente) são importantes para o crescimento de células não-neuronal e sobrevivência. O aumento da expressão e activação de TRK-A são observadas no neuroblastoma, cancro da mama, psoríase, e a dor neuropática, para citar algumas doenças resultantes de TRK-A disfunção [10] – [12]. Embora fusões oncogénicas de TRK-A não foram identificados até à data, a sua sobre-expressão é suficiente para aumentar a proliferação e invasão de células. Enquanto os anticorpos NGF estão em ensaios clínicos de dor, K252a, a única molécula pequena TRK-A inibidor na clínica, está atualmente em fase de avaliação para o tratamento da psoríase [13], [14].
ROS1 é um proto-oncogene que pertence à mesma ramificação filogenética como TRK-a [15]. Ao contrário de TRK-A, a activação de ROS1 tipicamente ocorre quando ele é fundido com parceiros de fusão oncogénicos, tais como condensados no glioblastoma (fig) e soluto família transportador 34 membro 2 (SLC34A2) [2], [16]. ROS1 foi demonstrada a ser sobre-expressos em glioblastoma, o colangiocarcinoma, o cancro do pulmão, e outros [17] – [19]. A expressão aumentada de ROS1 em vários cancros tem solicitado o desenvolvimento de inibidores selectivos. Crizotinibe, desenvolvido para o câncer de pulmão positiva ALK, também inibe ROS1 e está em um ensaio clínico para câncer de pulmão positiva ROS1-.
A pressão selectiva aplicada por resultados contínuos de inibição RTK no surgimento de diferentes populações clonais de câncer células com resistência adquirida e frequentemente proliferação acelerada [20], [21]. mecanismos de escape utilizadas pelas células cancerosas para superar a inibição RTK incluem mutações, fusão oncogénica, e ativação de cinases secundárias e vias de sinalização. Por isso, o desenvolvimento de inibidores de RTK segunda e terceira geração é imperativo para tratar os fenótipos resistentes que, inevitavelmente, surgem a partir de uma terapia de primeira geração. Desenvolvimento de inibidores com farmac�oros distintas e perfis inibidores de cinase únicas irá fornecer estratégias alternativas necessárias para superar a resistência.
Existem alguns estudos que mostram ROS1 ou TRK-A sobre-expressão em cânceres, mas a expressão individual ou combinada de ROS1 e TRK- a em uma ampla gama de cancros foi até agora pouco caracterizados. Utilizando 381 amostras de cDNA de 22 tipos de câncer, demonstramos sobre-expressão de TRK-A e ROS1 em cancros que não foram descritos anteriormente. TRK-A é sobre-expressa em 100% do feocromocitoma e a maioria das outras amostras de cancro analisadas. GTx-186, um novo inibidor RTK com perfil inibidor quinase única, inibe a família TRK, quinases ROS1, ALK, e RET em picomolar para baixo nanomolares IC
50 valores. GTx-186 cancros eficientemente inibidos impulsionado por TRK-A e expressão ROS1 e também foi excepcional na superação doenças inflamatórias tais como a dermatite.
In vitro
estudos demonstraram que GTx-186 também inibe a dor neuropática sinalização mediada por TRK-A ligando, NGF, tornando GTx-186 uma ferramenta valiosa no arsenal para combater o câncer, inflamação e dor.
Materiais e Métodos
Reagentes
Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA). Os reagentes de PCR em tempo real e os iniciadores e sondas TaqMan foram obtidos de Life Technologies (Carlsbad, CA). A citocina rato matriz-2 foi obtido a partir de Ray Biotech (Norcross, GA). Cancro da matriz de ADNc de levantamento (CSRT 103) era de Origene (Rockville, MD). humano recombinante de NGF 2,5 S foi de Millipore (Billerica, MA) e dexametasona foi obtido a partir de LKT Labs (St. Paul, MN). Tumor α factor de necrose (TNF-a) e lipopolissacárido (LPS) foram adquiridos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN). óleo de cróton, carragenina, e acetato de forbol miristato (PMA) foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO). Indometacina foi de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). TNF-a kit ELISA foi obtido a partir de Thermo Scientific (Norcross, GA). GTx-186 (isómero-S) e crizotinibe (racemato) foram sintetizados por químicos GTx e foram caracterizados por técnicas analíticas convencionais. Todos os outros reagentes utilizados eram de grau analítico.
Ensaio de Actividade de Cinase
Os compostos a serem testados foram dissolvidos em DMSO a 100% numa gama de concentrações de 10
-8 a 10
-3 M, em seguida diluídos com tampão de ensaio de cinase (HEPES 50 mM, pH 7,5, 1 mM de EGTA, 10 mM de MgCl
2, 0,01% de Tween-20, e 2 mM de DTT, adicionado fresco) a 4X a concentração final. A curva final incluiu 11 concentrações (10
-11 a 10
-5 M). concentrações quinase (Invitrogen) e ATP (Sigma) necessários para uma actividade óptima foi determinada em experiências separadas (Quadro S1). A concentração de quinase que resultou em actividade máxima e a concentração de ATP mostrou que 50% de estimulação máxima (CE
50) foram escolhidos para experiências de inibidor de enzima.
Os ensaios de quinase foram efectuados num volume final de 10 ul em placas de 384 poços, com 2,5 uL de composto de teste em triplicado para cada concentração, 2,5 jil de quinase, e 5 ul de ATP e substrato péptido (LANCE®
Ultra
L
luz
™ poli-GT, PerkinElmer) mistura. As reacções foram incubadas à temperatura ambiente (TA), no escuro, durante 30-120 min. Após a incubação, as reacções foram paradas com a adição de EDTA 40 mM em tampão 1X LANCE® (PerkinElmer) (5 ul), e incubou-se à TA durante 5 min. LANCE® Eu-W1024 anti-fosfotirosina anticorpo PT66 (5 ul) em tampão 1X LANCE® foi adicionado aos poços a uma concentração final de 1,25 nM e incubou-se durante 1 h à TA. A quantidade relativa de substrato fosforilado foi medido com o leitor de placas VICTOR ™ Multilabel utilizando o protocolo LANCE ™ para a transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo. A concentração do composto de teste necessária para diminuir o sinal de fluorescência (665 nm) por 50% (
50 IC) valor, foi determinada por regressão não-linear com a Sigma Plot® e a curva logística de quatro parâmetros padrão.
Cultura celular
IMR-32 e NIH3T3 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) e foram cultivadas de acordo com as instruções fornecidas. As linhas celulares autenticado pelo fornecedor foram cultivadas durante menos de 6 meses após a reanimação no laboratório. Para experiências de expressão de genes de crescimento induzidas pelo factor, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 10.000 células por poço, em meio suplementado com 1% de carvão despojado de FBS (csFBS). As células foram mantidas em 1% csFBS durante 3 dias para reduzir a transcrição basal com meio mudado no dia 1 antes do tratamento e no dia 3. chapeamento de crescimento celular e as condições para todas as outras experiências são como descrito nas legendas das figuras.
a linha de linfoma de U-937 (ATCC Manassas VA) e linhas de grandes anaplásicas linfoma de células SUDHL-1 e K-299 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e 100 U /mL de penicilina /estreptomicina. células Kelly (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foram cultivadas em meio RPMI-1640 e FBS a 10%.
BaF
3 células foram obtidas a partir de DSMZ (Braunschweig, Alemanha) e mantida em meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de soro fetal bovino, 10 ng /mL de interleucina-3 (R D Systems Minneapolis, MN) e 100 U /mL de penicilina /estreptomicina. BaF
3 linhas de células estáveis foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U /mL de penicilina, e uma solução de sulfato de /mL de G418 500 ug (Mediatech).
Clonagem e Estável Linha celular Criação
Todas as construções de plasmídeos foram sequenciados para assegurar fidelidade. A FIG-ROS1 (S) [17], sintetizado por Genscript (Piscataway, NJ), foi clonado no vector de pCMV6 e, em seguida, sub-clonado no plenti U6 PGK-Puro vector. As linhas celulares estáveis de NIH3T3 foram gerados pela infecção por lentivírus de plenti U6 PGK-puro-A FIG-ROS1 (S), como descrito anteriormente [22]. A NPM-ALK de fusão foi obtida a partir de ADNc amplificado a partir de células K299 e clonado em pCR3.1 (Life Technologies Carlsbad, CA) com EcoRI. EML-4ALK foi sintetizado por Genscript a partir da sequência de referência que representa o AB274722 E13: A20 fusão e também foi clonado em pCR3.1 com EcoRI. Inserir orientação e fidelidade foram confirmadas por sequenciação de ADN.
Isolamento de ARN e Gene Expression
O ARN foi isolado utilizando o kit de Células-a-CT e em tempo real de PCR foi realizada utilizando os iniciadores TaqMan e as sondas na ABI 7900 (Life Technologies). experiências de matriz de ADNc foram realizadas utilizando os iniciadores TaqMan e as sondas de PCR na máquina ABI 7900.
Western Blotting
As células foram cultivadas e tratadas tal como descrito nas legendas das figuras. Os extractos de proteína foram preparados e os extractos foram executados usando um SDS-PAGE num gel de gradiente 4-20% e imunotransf para as proteínas indicadas.
ensaio de crescimento do ciclo celular e Análise
As células aderentes eram colocadas em placas a 10.000 células por poço em placas de 96 poços no respectivo meio. As células foram tratadas tal como indicado nas figuras e a viabilidade celular foi medida utilizando sulforrodamina B (SRB) reagente e a densidade óptica medida a 535 nm. Para a análise do ciclo celular, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços e tratadas para os pontos de tempo indicados. As células foram fixadas, coradas com iodeto de propídio, e distribuição em diferentes fases do ciclo celular foi avaliada utilizando citometria de fluxo.
ensaio de migração Migração Ensaio
foi realizada utilizando o kit de ensaio de migração ornitorrinco (Fisher Scientific) . As células foram semeadas em placas de 96 poços e as inserções foram removidos 24 horas após a sementeira. As células foram tratadas tal como indicado nas figuras e fotografada 12 horas após o tratamento.
Cytokine matriz
matrizes de citocina foram obtidos a partir de Ray Biotech (Norcross, GA) e matrizes foram processados de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as matrizes foram incubadas durante a noite com um volume igual de exsudados da bolsa de ar, lavado, e incubado com os anticorpos secundários antes de desenvolver usando quimioluminescência aumentada.
P ALK-Quantificação
K-299 células de ELISA foram tratados com crizotinib ou GTx-186 durante seis horas. Os lisados celulares foram, em seguida, isolado e a proteína foi extraída utilizando tampão de lise celular (Cell Signaling) contendo Cocktail de Inibidor de Protease (Roche Diagnostics), de PMSF (Sigma Aldrich), e a fosfatase Inibidores de cocktail (Sigma Aldrich). p-ALK ELISA (Cell Signaling Technology Beverly, MA) foram realizadas em lisados celulares de acordo com as instruções do fabricante, usando 0,01 mg /mL de proteína.
Experimentação Animal
Todos os protocolos com animais foram aprovados pela a Universidade do Tennessee Institutional animal Care e do Comitê Use. Camundongos e ratos obtidos de Harlan (Indianapolis, IN) foram alojados com cinco ou três animais por gaiola, respectivamente, e foi permitido o acesso livre à água e ração comercial para roedores (Harlan Teklad 22/5 roedor dieta – 8640). Durante o curso do estudo, os animais foram mantidos num 12 hr luz: ciclo escuro
Tumor de Xenoenxerto Experiências
experimentos foram realizados xenoenxertos em ratinhos nus, como descrito anteriormente [23].. Resumidamente, uma mistura de células em suspensão em meio RPMI + 0,0375 mL FBS a 10% e 0,0625 ml de Matrigel foi injectado s.c. no flanco posterior esquerda de cada rato. Uma vez que o volume do tumor atingiu 100-200 mm
3, os animais foram distribuídos aleatoriamente e tratados (GTx-186 foi dissolvido em 81% de PEG-300 + 18% estéril dupla água desionizada + 0,6% de ácido clorídrico 12 N, foi dissolvido em crizotinibe DMSO a 10% + 90% de PEG-300) como indicado nas figuras. O volume do tumor e peso corporal foram medidos como indicado nas figuras. O volume do tumor foi calculado usando a largura * fórmula comprimento * largura * 0,5236.
Croton Oil-induzida Dermatite
camundongos C57BL /6 foram tratados duas vezes em 16 horas e 2 horas antes da aplicação de acetona ou óleo de cróton (20 ul de óleo de croton em acetona a 10% em cada ouvido interno) [24]. Seis horas após a aplicação de óleo de cróton, os animais foram sacrificados, e punções da orelha foram pesadas e armazenadas em ARN mais tarde para o isolamento de ARN.
Ar Inflamação modelo de bolsa de
Ar foi injectada nos flancos de ratos Sprague Dawley ratos quatro dias (20 mL) e dois dias (10 mL) antes da injecção de carragenano (1 mL de 2% de carragenina) na bolsa [25]. Seis horas após a administração do carragenano, os animais foram sacrificados, 5 ml de solução salina foi injectada na bolsa, os exsudados da bolsa foram recolhidas e o número de leucócitos e macrófagos infiltrados dentro da bolsa foram contadas sob um microscópio.
Foram realizadas análises estatísticas usando o software GraphPad Prism.
resultados
TRK-a e ROS1 estão sobre-expressos em vários cancros
Isolado estudos têm identificado a sobre-expressão de qualquer TRK-a ou ROS1 neuroblastoma em [26], o cancro do pulmão [2], glioblastoma [16], e colangiocarcinoma [17]. Uma vez que ambas estas cinases são proto-oncogenes, nós especulamos que a informação sobre a expressão combinada poderia ajudar a prever aditivo ou crescimento sinérgico do respectivo câncer. Para determinar o TRK-A e padrão de expressão ROS1, arranjos de cDNA de tecidos de verificação contendo 381 amostras de ADNc a partir de 22 cancros e de tecidos normais adjacentes foram usadas (Figura 1). Os cancros da supra-renal (7/10 amostras de cancro expressos TRK-A), pâncreas (17/05 TRK-A), dos ovários (7/20 TRK-A), o esófago (9/20 TRK-A e ROS1), bexiga urinária ( 6/22 TRK-a), e no endométrio (ROS1 17/09) manifestou um aumento dos níveis de TRK-a e /ou ROS1, em comparação com amostras normais correspondentes. Curiosamente, 100% do feocromocitoma, um cancro adrenal neuro-endócrino com origem no sistema nervoso simpático, as amostras sobre-expresso TRK-A entre 50-1000 vezes, em comparação com tecidos normais renais. Relatórios anteriores demonstraram que a linha de células de feocromocitoma, PC12, expressou o mais alto nível de TRK-A entre os inúmeros
in vitro
sistemas celulares examinados, corroborando esses achados [27]. As amostras de cancros da bexiga urinária (3 amostras) e esôfago (4 amostras) expressa tanto TRK-A e ROS1, o que poderia potencialmente levar a aditivos ou proliferação sinérgica. Os cancros da próstata, da mama e outros não expressaram níveis detectáveis de qualquer uma das cinases. Uma vez que estes resultados são a partir de um pequeno subconjunto de amostras, que tem que ser validada com amostras adicionais.
A expressão de TRK-A e ROS1 foram quantificados por PCR em tempo real em ADNc a partir de 381 amostras de 22 diferentes tipos de cancro e normais correspondentes tecidos. TRK-A e expressão ROS1 foram normalizados para actina e representado como diferença vezes a partir de amostras não-cancerosas normais e utilizando o método DDCT. Média de amostras normais foi feita para o cálculo DDCT. cancer Ad.C-Adrenal; Normal-cDNA a partir de tecidos não-cancerosas. Números menores de amostras indicam amostras normais.
In vitro Caracterização de GTx-186
GTx186 é uma imidazo [4,5-f] isoindole derivado relacionado com previamente o romance divulgado RTKI GTx -134 [28]. Para alavancar a oncologia, inflamatória, e os papéis nociceptivos de TRK-A e tirosina quinases ROS1, construímos uma biblioteca de moléculas pequenas que inibe selectivamente as quinases no ramo filogenética contendo TRK-A e ROS1. GTx-186 inibiu selectivamente TRK-A, TRK-B, TRK-C, ROS1, Alk, e fosforilação mediada por RET com IC
50 valores na gama picomolar para baixo nanomolar (quadro 1). Por outro lado, GTx-186 inibiu o IGF-1R e fosforilação mediada pelo EGFR em concentrações muito mais altas (superiores a 100-1.000 nM), indicando a sua selectividade para apenas um subconjunto das quinases. Uma vez que LFA e a expressão de RET em tecidos normais são mínimas e animais knockout tem fenótipos inconsequentes [29], [30], reactividade cruzada com estas duas cinases são de pequena preocupação permitindo GTx-186 para o tratamento de doenças TRK-A e ROS1-dependentes, com risco mínimo de efeitos indesejados.
GTx-186 Inibe IMR-32 Neuroblastoma celular TRK-dependente A e Crescimento Xenoenxerto
Uma vez que as células IMR-32 de neuroblastoma expressam isoformas TRK e são dependentes em TRK-a para o seu crescimento [31], usamos esta linha como um modelo para estudar os efeitos de GTx-186 em TRK-a fosforilação e crescimento, tanto
in vitro
e
in vivo
. O altamente potente GTx-186 inibiu a fosforilação induzida por NGF de p42 /44 MAPK, uma quinase a jusante de TRK-A que medeia a proliferação e a inflamação em resposta a NGF [32], a uma concentração tão baixa como 10 nM (Figura 2A). Por outro lado, a 10 vezes menos potente análogo inibida induzida por NGF p42 /44 MAPK fosforilação apenas com uma concentração maior do que 100 nM. Subsequentemente, células IMR-32 foram tratadas com concentrações crescentes de GTx-186 para determinar o efeito sobre o crescimento de células após 72 horas. Tal como mostrado na Figura 2B, GTx-186 dependentemente da dose inibiu o crescimento de células IMR-32, com um IC
50 valor de aproximadamente 100 nm. GTx-186 também a migração dependente de NGF inibiu completamente de células IMR-32 (Figura 2C), indicando que a inibição de TRK-A é tanto anti-proliferativo e anti-invasiva. Sob condições idênticas, GTx-186 não teve efeito sobre o crescimento de células SH-SY5Y, uma linha de células de neuroblastoma que não têm TRK-A [26].
. GTx-186 inibe ERK induzida por NGF (p42 /44 MAPK) fosforilação. IMR-32 de neuroblastoma células foram privadas de soro durante 2 dias, pré-tratadas durante 2 horas com as concentrações indicadas do GTx-186 e tratados com 200 ng /mL de NGF durante 30 minutos. As células foram colhidas e Western blot realizado para fosfo-ERK-total de ERK. B. GTx-186 inibe a proliferação de células IMR-32. As células IMR-32 foram semeadas em meio de crescimento e tratou-se com a concentração indicada do GTx-186 durante 3 dias. As células foram fixadas e coradas com sulforrodamina B (SRB) e densidade óptica (OD) foi medida a 535 nm. C. GTx-186 inibe a migração de células IMR-32. As células IMR-32 foram plaqueadas numa placa de ensaio de migração ornitorrinco e foram tratados com veículo, o NGF, ou combinação de NGF e GTx-186. As imagens foram capturadas em microscópio de luz 12 horas após o tratamento. D-L. GTx-186 inibe o crescimento de IMR-32 de neuroblastoma de xenoenxerto. As células IMR-32 foram implantados subcutaneamente em ratinhos nus (10 milhões de células /ratinho). Uma vez que os tumores atingiram 100-200 mm
3, os animais (n = 8) foram randomizados e tratados diariamente com o veículo ou 20 mg /kg /dia i.v. GTx-186. O volume do tumor (D) e o peso corporal (F) foram medidos todos os dias durante 4 dias. Os animais foram sacrificados, os tumores pesavam (E), armazenados em formalina e processados para imuno-histoquímica de TUNEL (L-número de células positivas TUNEL (painel da esquerda) e a intensidade de coloração TUNEL (painel da direita)). Os valores são expressos como Média ± D.P. Factor de Crescimento de Nervos-NGF; bares abertos são bares e encheu tratados com o veículo são amostras tratadas com GTx-186. * -statistically Significativa a p 0,05; ** – Estatisticamente significativa a p 0,01
Para demonstrar que os efeitos anti-proliferativa de GTx-186 são reprodutíveis
in vivo
num modelo de xenotransplante tumoral, IMR-32. As células foram implantadas em ratinhos nus e os animais portadores de tumores foram tratados com veículo ou GTx-186 por via intravenosa. Devido ao rápido proliferativa e natureza altamente invasiva de células IMR-32, os tumores cresceram de 200 mm
3 a 2000 mm
3 dentro de 4 dias. GTx-186 de forma eficaz e significativamente reduziu o crescimento do tumor (Figura 2D), a partir do dia 1 até ao final do estudo, o que resulta na inibição do crescimento do tumor superior a 80%. Estes efeitos foram desencadeadas sem quaisquer efeitos tóxicos visíveis, incluindo quaisquer alterações no peso corporal (Figura 2F). GTx-186 também reduziu significativamente o peso do tumor (Figura 2E) por mais de 50% em comparação com animais tratados com veículo. A fim de determinar o mecanismo para este efeito anti-tumor, tecidos tumorais fixados em formalina foram imuno-histoquimicamente coradas para TUNEL e o número de células positivas TUNEL-TUNEL e intensidade de coloração foram avaliadas. GTx-186 aumentou a apoptose de células de tumor por mais de duas vezes em comparação com animais tratados com veículo, como mostrado, tanto o número de células positivas TUNEL e intensidade de coloração TUNEL (Figura 2G). Estes efeitos foram obtidos com uma concentração de equilíbrio de cerca de 50 nm GTx-186, o que é comparável ao
in vitro
IC
50 valores.
Efeitos GTx-186 provoca Anti-inflamatórios in vitro
TRK-a e o seu ligando NGF são mediadores de doenças inflamatórias, tais como dermatite, psoríase e artrite. O NGF é expresso em macrófagos e
In vitro
, NGF induz a síntese do TNF-α e sinergiza com o interferão-γ para aumentar a expressão de citocinas inflamatórias [33]. Estes efeitos podem ser invertidos por inibidores de TRK-A. Além disso, o NGF e TRK-A têm sido implicados numa variedade de condições inflamatórias e alérgicas, incluindo asma e a quimiotaxia dos leucócitos polimorfonucleares [34]. Para compreender o efeito do GTx-186 sobre a inflamação induzida por várias citocinas e factores de crescimento, as células PC12 foram pré-tratados com GTx-186 ou dexametasona e subsequentemente tratado com PMA ou NGF para induzir a expressão de citoquinas inflamatórias. Enquanto GTx-186 inibiu eficazmente a expressão de MMP-3, uma metaloproteinase de matriz, induzida tanto por PMA e NGF, dexametasona inibiu a expressão de MMP-3 induzida apenas pelo PMA, mas não por NGF (Figura 3A). Isto demonstra que o NGF e PMA mediar a inflamação através de vias distintas, e glucocorticóides, como a dexametasona, são eficazes apenas em inflamação não-NGF-mediada. Para determinar os efeitos mais amplos anti-inflamatórias de GTx-186, se houver, IMR-32 células (Figura 3B), queratinócitos humanos normais (NHEK; Figura 3C), macrófagos LADMAC (Figura 3D) e RAW 264.7 de macrófagos de rato (Figura 3E) foram pré-tratados com -GTx-186, e citocinas inflamatórias foram induzidas por NGF, o TNF-α, ou LPS. GTx-186 inibiu eficazmente mediadores inflamatórios importantes, tais como cFos, IL-8 e IL-1β com potência comparável aos seus efeitos sobre a actividade da quinase.
As células foram privadas de soro durante 2 dias, pré-tratadas com as concentrações indicadas do GTx-186 durante 30 min e tratada com factores de crescimento ou citoquinas para 12-16 horas. Extraiu-se ARN, ADNc sintetizado, e expressão de genes inflamatórios foram medidos por PCR em tempo real utilizando iniciadores Taqman e sondas. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes. Os valores são expressos como Média ± D.P. Dex-dexametasona; PMA-miristato de forbol acetato de etilo; Factor de Crescimento de Nervos-NGF; Factor de necrose de TNF-α-tumoral; LPS Lipopolissacárido; MMP3-Matrix Metalloproeinase 3; IL-8-Interleucina 8; As células PC-12-Feocromocitoma; As células IMR-32 de Neuroblastoma-; NHEK-Normal Human epidérmico queratinócitos; LADMAC por macrófagos /monócitos; RAW-264,7-Rato macrófagos.
GTx-186 Inibe induzida por óleo de cróton Dermatite Atópica em Ratos
Desde TRK-A tem sido implicado na psoríase [12] e dermatite [ ,,,0],35] e GTx-186 inibiu a IL-8, uma das citocinas críticas que medeiam a inflamação dérmica [36] (Figura 3C), avaliou-se GTx-186 num modelo de óleo de cróton de dermatite atópica. óleo de cróton aumenta eritema, peso de espigas, e vazamento vascular, um fenótipo semelhante à dermatite atópica [37]. Aplicação de óleo de cróton aumento do edema e o peso das orelhas, que foram reduzidas por forma dependente da dose GTx-186 (Figura 4A). ARN a partir de punções da orelha foram isoladas e expressão de vários genes nas vias inflamatórias foi medida (Figura 4B). óleo de cróton aumentou a expressão de todos os genes de vias inflamatórias medidos, incluindo o NGF, que foram todos marcadamente inibida por GTx-186 e dexametasona.
. Murganhos C57BL /6 (20-25 g, n = 3) foram administrados duas vezes, com a dose indicada do GTx-186 (sc) ou dexametasona (SC), 16 horas e 2 horas antes da aplicação de óleo de cróton (20 ul de 10 óleo de cróton em acetona% em cada ouvido interno). Seis horas após a aplicação de óleo de cróton, os animais foram sacrificados, punções da orelha foram pesadas e armazenadas para isolamento de ARN. * Indica significância de P 0,05 em acetona aplicado animais tratados com veículo. # Indica significância de P 0,05 de óleo de cróton aplicado animais tratados com veículo. B. O ARN foi isolado a partir de punções da orelha dos animais no Grupo A e expressão de genes indicados foram medidos por PCR em tempo real e normalizado para GAPDH utilizando iniciadores TaqMan e as sondas. Os valores são expressos como Média ± D.P. Dex-dexametasona; 186-GTx-186; Factor de Crescimento de Nervos-NGF; A interleucina IL-; ligando CCL-quimioquina; MMP-Matriz de Metaloproteinase; MCSF-macrófagos factor estimulador de colónias.
GTx-186 inibe a inflamação induzida por carragenina em ratos Pouch Modelo Air
NGF
são clinicamente bem sucedida no tratamento de dores artríticas [38]. No entanto, não foi avaliado o potencial de tratar a inflamação sistémica, em conjunção com a dor. Desde GTx-186 inibiu citocinas inflamatórias numa variedade de linhas de células, incluindo macrófagos, nós testamos -GTx-186 em inflamação sistémica induzida por carragenano utilizando um modelo de bolsa de ar. O modelo de bolsa de ar é fisiologicamente e mecanisticamente comparável a artrite, e, portanto, este modelo foi utilizado para avaliar GTx-186 [25], [39]. A administração de carragenina aumento de leucócitos e infiltração de macrófagos na bolsa de ar, em comparação com animais tratados com solução salina (Figuras 5A e 5B). Subcutânea e intra-bolsa de administração de GTx-186 reduziu significativamente de leucócitos e infiltração de macrófagos. administração intra-bolsa de GTx-186 provocou uma resposta melhor do que a administração subcutânea, o que indica uma correlação positiva entre a exposição do fármaco no local de inflamação e os efeitos anti-inflamatórios.
A-C. Uma bolsa foi criada por via subcutânea no flanco de um rato (n = 3) através da injecção de 20 ml de ar quatro dias antes e 10 mL de ar de dois dias antes do tratamento. GTx-186 (pb, no painel A e intra-bolsa ou SC no painel B; 40 mg /kg), dexametasona (30 mg /kg sc), ou indometacina (30 mg /kg sc) foram administrados três vezes, 48 horas, 24 h e 1 h, antes da administração de carragenina (1 mL de 2%). Seis horas após a administração do carragenano, os animais foram sacrificados, 5 ml de solução salina foi injectado no saco para esvaziar o fluido da bolsa e o número de leucócitos e macrófagos infiltrados dentro da bolsa foram contadas sob um microscópio. TNF-α foi medida utilizando um ensaio ELISA em que os exsudados da bolsa a partir da experiência no painel B. (C). D. Efeito do GTx-186 sobre as citocinas inflamatórias em inflamação bolsa de ar induzida por carragenano foi medida em que os exsudados da bolsa utilizando uma variedade de citoquinas. citocinas-chave foram quantificadas e expressas em gráficos de barras à direita. Os valores são expressos como Média ± D.P. de n = 3. 186-GTx-186; Indom-indometacina; Dex-dexametasona; Factor de necrose tumoral-TNF; A interleucina IL-; CINC-Cytokine-Induced proteína de Neutrófilos-Quimioatraente.
exsudados da bolsa de ar foram submetidos a matriz de citoquinas para determinar o efeito do GTx-186 e indometacina na expressão da proteína citocina global (Figura 5D e Tabela S2) . Curiosamente, GTx-186 e indometacina diferiam nos seus efeitos para inibir citocinas. Embora ambos GTx-186 e indometacina inibida induzida por carragenina TNF-α, IL-1β, fractalcina, IL-13 e leptina, única GTx-186 inibiu CINC-1, CINC-2, IL-6, e LIX. Por outro lado, nem GTx-186 nem indometacina inibiu CINC-3, TIMP-1, PDGFa, MMP-8 e MCP-1, indicando que estas citoquinas podem não ser mediadores importantes da inflamação no modelo de bolsa de ar induzida por carragenano .
TNF-α é um mediador importante da inflamação na inflamação aguda induzida por carragenina em modelos sinoviais bolsa de ar. Os níveis locais de TNF-α correlacionada com o inchaço e a extensão da inflamação, os quais foram invertidos por um anticorpo anti-TNF-α [25].