Abstract

Fundo

A família de zinco contendo dedo GATA fatores de transcrição peças papéis críticos na especificação das linhagens de células durante o desenvolvimento embrionário inicial e formação de órgãos. GATA4 e GATA6 foram encontrados para ser frequentemente perdido no câncer de ovário, ea perda é proposto para explicar desdiferenciação das células cancerosas.

Metodologia /Principais Achados

Nós ainda investigada a expressão de GATA4 e GATA6 em lesões epiteliais da superfície do ovário e subtipos histológicos de carcinomas ovarianos por imunocoloração. GATA4 e GATA6 foram encontrados para estar ausente em percentagens elevadas (80 a 90%) de células serosa, clara e endometrióides câncer de ovário examinado. Em contraste, ambos foram positivos em 11 de 12 casos de carcinomas mucinosos, sugerindo a expressão dos factores GATA pode distinguir do cancro mucinoso de outros subtipos histológicos. GATA4 foi frequentemente perdido em lesões pré-neoplásicas, tais como cistos de inclusão morfologicamente normais e hiperplasia epiteliais adjacentes às células malignas. A perda de GATA6 correlaciona-se estreitamente com a transformação morfológica neoplásica do epitélio de superfície do ovário. Na cultura, expressão GATA4 foi reduzida progressivamente Após passagem células epiteliais da superfície ovariana primária, que se correlacionaram com as mudanças na modificação da histona do locus GATA4. A dosagem do gene GATA6 reduzido como no GATA6 (+/-) camundongos levou a um aumento de alterações pré-neoplásicas e cistos de inclusão nos ovários, o que sugere a perda de GATA6 contribui para o desenvolvimento de cancro do ovário.

Conclusões /Significado

Este estudo sugere que o estatuto de GATA4 e GATA6 expressão podem ditar caminhos patológicos distintos que levam a carcinomas de ovário seroso ou mucinoso. O prontamente perda de expressão GATA4 através de mudanças na conformação da cromatina sugere um potencial não-fenotípica iniciar evento, levando à perda subsequente de GATA6, a transformação morfológica, e tumorigênese final

Citation:. Cai KQ, Caslini C, Capo- chichi CD, Slater C, Smith ER, Wu H, et al. (2009) Perda de GATA4 e GATA6 Expressão Especifica cancro do ovário histológicos subtipos e precede a transformação neoplásica do epitélio de superfície do ovário. PLoS ONE 4 (7): e6454. doi: 10.1371 /journal.pone.0006454

editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril de 2009; Aceito: 23 de junho de 2009; Publicado: 31 Julho 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Cai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados por fundos de bolsas R01 CA095071, CA79716 e CA75389 a XX Xu, e os fundos de ovário CA83638 SPORE cancro da P50 (RF Ozols, PI), e Core Grant # CA006927. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer epitelial de ovário geralmente é pensado para ocorrer a partir do epitélio coelomic que cobre a superfície do ovário [1], [2] ou a partir de cistos de inclusão, que também são pensados ​​para derivar do epitélio de superfície do ovário [3], [4 ]. No entanto, também existem fortes argumentos de que pelo menos algum do cancro epitelial do ovário originado de fontes diferentes do epitélio de superfície de células [5], [6], [7]. Vários subtipos histológicos distintos podem ser classificados com base na morfologia celular: são células serosa, mucinoso, clara e subtipos endometrióide [8], [9]. Uma ideia para explicar os diferentes subtipos histológicos é que as células epiteliais da superfície do ovário submetidos a metaplasia de adoptar várias características histológicas durante a transformação [2], [8]. Outra ideia é que o câncer de ovário podem surgir a partir dos restos de estruturas de Müller duto [6], que são precursores das trompas de falópio, colo do útero, útero, etc, e pode apresentar-se como todos os subtipos histológicos em tumores. Com efeito, as recentes observações levam à hipótese de que uma porção significativa de carcinomas do ovário serosas pode ter origem a partir de tubos de falópio [5], [7], o que tem como serosa células epiteliais.

Embora algumas características das células precursoras pode reter, a distinção das células do cancro a partir de células precursoras é evidente, e várias características das células neoplásicas foram reconhecidos [10]. mutações genéticas únicas são a base para os fenótipos neoplásicas [11] – [13], e, adicionalmente, as células cancerosas aparecem frequentemente em um estágio de forma inadequada diferenciada, e o termo “desdiferenciação” é frequentemente utilizado [14] – [16]. O fenótipo descrito como “indiferenciados” ou “desdiferenciação” de cancro do ovário, muitas vezes refere-se às alterações aparentes das células cancerosas no sentido de uma morfologia epitelial menos semelhante a ou deriva a partir das células precursoras. Para fornecer uma interpretação molecular de “desdiferenciação” das células cancerosas, pode-se considerar o conceito de diferenciação linhagem celular de destaque na biologia do desenvolvimento, no qual uma célula primordial passa por mudanças em seu perfil de expressão gênica global em direção a um tipo de célula madura específico. Por analogia, desdiferenciação de células cancerosas pode ser causado pela perda de um ou mais genes que são críticos na indução da diferenciação de um tipo de célula primordial para se obter as células epiteliais da superfície do ovário. Estudos recentes sugerem a perda de factor de transcrição a GATA6 GATA4 e no cancro do ovário pode contribuir para a perda de características epiteliais e pode ser o mecanismo subjacente de “desdiferenciação” de células de cancro do ovário [17], [18].

Os fatores de transcrição GATA vincular a um consenso uma sequência /TGATAA /G no promotores e são conservados em insetos e vertebrados, de mosca para os seres humanos [19]. GATA4 GATA6 e são expressos na maioria dos órgãos, e desempenham um papel crítico no desenvolvimento destes órgãos [20], [21]. GATA4 GATA6 e são expressos em primeiro lugar durante a formação da endoderme extraembryonic diferenciadas a partir de células estaminais embrionárias pluripotentes da massa celular interna durante o desenvolvimento embrionário inicial [22] – [25]. factores GATA são não específica do tecido, mas sim função na especificação e diferenciação de linhagens de células dentro de um órgão, tal como a diferenciação de uma linhagem de células epiteliais a partir de células do estroma. GATA4 GATA6 e são expressos em células epiteliais da superfície do ovário humano [17], [18], e, presumivelmente, GATA4 GATA6 e são importantes para a formação e manutenção do estado diferenciado das células epiteliais da superfície do ovário. GATA4 GATA6 e são frequentemente perdidas em células de cancro do ovário [17], [26], e especula-se que a perda destes factores de transcrição importantes desenvolvente pode ser o mecanismo subjacente de desdiferenciação [17], [18].

se GATA6 é importante para a formação da superfície do epitélio do ovário é desconhecida, uma vez que pouco é conhecido sobre a derivação das células epiteliais da superfície do ovário. Ambas as proteínas GATA4 GATA6 e são expressos em células epiteliais da superfície do ovário, mas ausente na maioria das células de cancro do ovário [17], [18], [26]. Encontramos por ensaio de chip que a histona H3 e H4 acetilação do locus GATA4 diminuiu consideravelmente em células cancerosas em comparação com células não tumorais GATA4-positivos [18]. Em contraste, histona H3 e H4 acetilação do locus GATA6 em muitas células de cancro não foi reduzida e os traços de ARNm GATA6 poderia ser detectado por RT-PCR, indicando que o gene GATA6 não é transcricionalmente silenciados mas a mensagem é suprimida por outro mecanismo (s ) [18].

alvos de transcrição alguns para os factores GATA foram identificados, e a pessoas com incapacidades-2 (DAB2) é um alvo de transcrição conhecido de GATA6 [27]. DAB2 também foi encontrado perdido no cancro do ovário [28], correlacionando-se com a ausência de transformação morfológica GATA6 e [18]. DAB2 deficiência em ratinhos conduz a letalidade embrionária precoce [29] – [31], e ratinhos mutantes heterozigóticos DAB2 desenvolvem lesões pré-neoplásicas a partir de epitélio da superfície do ovário [32]. DAB2 é uma proteína adaptadora envolvido no tráfico endocítica, DAB2 e desempenha um papel no estabelecimento da polaridade epitelial e a superfície de posicionamento [33]. Perda de DAB2 é pensado para provocar a transformação morfológica do epitélio do ovário superfície [34], [35]. Assim, a especulação é que a perda de GATA6 vai levar à perda de DAB2 e transformação neoplásica morfológica do epitélio de superfície do ovário.

No presente estudo, foram analisados ​​ainda os detalhes da GATA4 e expressão GATA6 em tecidos ovarianos e câncer e examinou o impacto da redução da GATA6 em camundongos sobre a transformação do epitélio de superfície do ovário.

resultados

a expressão de GATA4 e GATA6 no cancro do ovário subtipos histológicos

Anteriormente, ambos GATA4 GATA6 e foram observados para ser fortemente expressa nas células epiteliais da superfície do ovário primárias, mas ausente em células de cancro do ovário em cultura por transferência de Western tanto para examinar a proteína ou transferência de Northern de ARNm para medir [17], [18].

com a continuação do desenvolvimento de anticorpos e refinamento do processo de coloração, foi realizada análise imuno-histoquímica para a expressão de GATA4 e GATA6 em um painel de ovário tecidos não neoplásicas e câncer em tissue microarray (Tabela 1). tecidos ovarianos 26 não cancerosas adicionais de oophorectomies profiláticos também foram utilizados neste estudo. Estes tecidos ovarianos foram obtidas de ambas as mulheres altos e normais de risco, mas nenhum caso de câncer microscópico foi encontrado [36]. Os 111 carcinomas ovarianos informativos em tissue microarray utilizados neste estudo consistem em 82 serosa, 12 mucinoso, 12 de células claras, e 5 subtipos endometrióides (Tabela 1). No monocamada de epitélio normal de superfície do ovário, todas as células epiteliais da superfície do ovário foram coradas positivas para GATA4 nuclear e GATA6 (Figura 1A). Enquanto GATA4 e coloração GATA6 são muito reduzida ou ausente na maioria dos carcinomas ovarianos (Tabela 1). Entre os casos informativos, perda de GATA4 foi encontrada em 81/82 (99%) de carcinomas serosos, 1/12 (8,3%) de carcinomas mucinosos, 11/12 (92%) de carcinoma de células claras, e 5/5 ( 100%) de carcinomas endometrióide. Perda de GATA6 foi encontrada em 55/82 (67%) de carcinomas serosos, 1/12 (8,3%) de carcinomas mucinosos, 10/12 (83%) de carcinoma de células claras, e 05/05 (100%) de endometrióide carcinomas. Exemplos de colorações imunológicas são mostrados na Figura 1, para um GATA4- e carcinoma seroso GATA6-negativas (Figura 1B), um carcinoma seroso GATA4-negativa, mas GATA6-positivo (Figura 1C), um carcinoma seroso GATA6-negativa, mas GATA4-positiva (Figura 1D), e um GATA4 e GATA6-positivo de mucinosos (Figura 1E). É também notável que alguns GATA4 e /ou GATA6 coloração está presente em células de estroma em ambos os ovários normais e timorous, embora a maioria destes coloração não são tão intensos como os das células epiteliais. Em alguns casos, como pode ser visto no tumor mostrada na Figura 1B, alguns pequenos células estromais, células do sistema imunológico e linfocíticas prováveis, mostram forte coloração nuclear de GATA4.

imunomarcações de GATA4 e GATA6 foram realizados em 111 carcinomas ovarianos, incluindo o 4 subtipos histológicos. Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 1. A. células epiteliais da superfície do ovário normais são positivas tanto para GATA4 e GATA6 no núcleo. 200 × ampliação. B. Um exemplo de ambos GATA4- e carcinoma seroso GATA6-negativo. Ampliação de 40 ×. C. Um exemplo do carcinoma seroso GATA4-negativo e GATA6-positiva. Ampliação de 40 ×. D. Um exemplo do carcinoma seroso GATA4-positiva e GATA6-negativo. Ampliação de 40 ×. E. Um exemplo de ambos GATA4- e carcinoma mucinoso GATA6-positiva. Ampliação de 40 ×. E, epitélio; T, tumor; S, estroma.

Uma característica marcante do GATA4 e coloração GATA6 é que, embora GATA4 e GATA6 são perdidas no câncer de ovário mais (subtipo predominantemente serosa), carcinomas do subtipo mucinoso são principalmente GATA4 – e GATA6-positivos (Tabela 1). Assim, a expressão de GATA4 e GATA6 distingue carcinomas mucinosos de outros subtipos histológicos.

Perda de GATA4 precede a perda de GATA6 na pré-neoplásica epitélios de superfície e cisto ovariano

expressão GATA4 está ausente na maioria de cancro do ovário seroso, e GATA6 também está ausente em muitos, mas também, em alguns casos positivos (Tabela 1). GATA6 negativo e positivo GATA4 existem apenas em raros casos de carcinomas ovarianos. Assim, a perda de GATA4 parece ser mais prevalecente do que a perda de GATA6 no cancro do ovário.

Anteriormente, carcinomas microscópicos e alterações morfológicas pré-neoplásicas foram observadas em oophorectomies profiláticos, que mostra a utilidade destes tecidos para o estudo da iniciação de cancro epitelial do ovário [37]. Na presente análise, os 26 casos de tecidos de ovário de oophorectomies profiláticos foram encontrados para conter nenhum tumor microscópicas, mas exibia lesões morfologicamente alterados derivados a partir da superfície do ovário ou cisto epitélios [36]. Em alguns carcinomas dos ovários evidentes, monocamadas morfologicamente normais de células epiteliais pode ser encontrada adjacente a células malignas. Apenas por causa da proximidade física, essas células epiteliais normais morfológicas podem compartilhar algumas características com as células neoplásicas. Por imunocoloração, verificou-se que na maioria dos casos o GATA4 está ausente e GATA6 é positivo na única camada, lesões benignas morfologicamente, como mostrado por exemplo (Figura 2A). Num segundo exemplo, as células epiteliais que revestem a superfície do ovário são positivos para GATA6 e negativo para GATA4, e os quistos epiteliais abaixo da superfície perdeu tanto GATA4 e GATA6 expressão (Figura 2B).

Cada lâminas das 26 amostras contém números variáveis ​​de lesões com graus variáveis ​​de alterações morfológicas. Examinámos cerca de 80 dessas lesões fazer várias descrições gerais: GATA4 é negativo em cerca de 80% da superfície do epitélio, e GATA4 está ausente em quase todas as lesões óbvias e também cerca de metade das monocamadas morfologicamente normais. GATA6 está geralmente presente (70%) nas lesões epiteliais, e perda de GATA6 correlaciona com alterações morfológicas neoplásicas (múltiplo de camadas epiteliais) em cerca de 90% dos casos. Assim, a perda GATA4 muitas vezes precede a perda GATA6, e perda de GATA4 e GATA6 ocorre antes da transformação maligna de células epiteliais da superfície do ovário.

A imunocoloração de GATA4 e GATA6 na superfície do ovário morfologicamente normais e /ou epitélio cisto encontrado no ovário carcinomas. A. Um epitélio de superfície do ovário é positivo para GATA6 e negativo para GATA4. GATA4 coloração positiva no estroma é anotado. B. Um epitélio de superfície do ovário é positivo para GATA6 e negativo para GATA4. Ambos GATA4 e GATA6 são perdidos no quisto células epiteliais adjacentes à superfície. 200 × ampliação. E, epitélio; C, cisto; S, estroma.

Perda de GATA4 e /ou GATA6 estreitamente correlacionada com epitelial transformação morfológica

Ao longo dos anos, nós reuniu uma coleção de 12 carcinomas ovarianos que contêm lesões do epitélio contíguo ligando morfologicamente células epiteliais benignos para as células cancerosas evidentes [35]. Tais lesões foram também descritas anteriormente para cystadenocarcinomas ovarianos mucinosos e serosos [38]. Nós fundamentado que a presença de uma transição de benigno para maligno pode ser útil para determinar o envolvimento de genes candidatos na tumorigénese epitelial do ovário. Na verdade, em todos os 12 casos de benigno para transições neoplásicas analisados, perda de GATA4 e /ou GATA6 intimamente associa com a transformação morfológica neoplásica. No primeiro exemplo (Figura 3A), é já GATA4 ausente na monocamada benigna; GATA6 é positiva nas células em monocamada, mas é perdida nas células cancerosas adjacentes. Perda de GATA6 estreitamente correlacionada com a perda da sua transcrição DAB2 alvo (Figura 3A). Num segundo exemplo, e GATA4 expressão GATA6 são perdidos simultaneamente, estreitamente associada com a perda de DAB2 e transformação morfológica (Figura 3B). A alargada benigna para o site transição neoplásicas (Figura 3B, painéis inferiores) mostra que GATA4 é abruptamente perdido, e GATA6 é bastante reduzido na transição.

Exemplos de cancro do ovário humano coradas para GATA4, GATA6 e DAB2 em secções de tumor adjacentes. A. Um epitélio de superfície do ovário que consiste em um epitélio de superfície (cabeça de seta) morfológico normal, de forma contígua ligando células malignas (seta) que quer invadiram no estroma ou expandidos em áreas ao redor do ovário. GATA4 é negativo em ambas as células normais epiteliais neoplásicas ou morfológicas. As células epiteliais do epitélio normal morfológica são positivos para GATA6 e DAB2, e as células malignas são negativas para GATA6 e DAB2. Algumas células dispersas no estroma são DAB2 positivo, mas negativo para GATA6. Estas células são os macrófagos em que a expressão não é dependente DAB2-GATA6. B. Neste carcinoma do ovário, as células epiteliais no epitélio normal morfológica são positivos para GATA4, GATA6, e DAB2, e as células malignas são negativas para adjacentes GATA4, GATA6, e DAB2. As imagens foram tiradas sob um microscópio com uma ampliação de 100 ×. As colorações para GATA4 e GATA6 na transição no painel B estão mostrados em uma ampliação mais elevada (400 ×) nos painéis menores. E, epitélio; C, cisto; S, estroma; T, tumor.

Assim, a perda de expressão GATA6 se correlaciona intimamente com a transformação neoplásica do epitélio da superfície do ovário, como observado na superfície contígua epitélio do ovário de ligação morfologicamente normais em células malignas (Figura 3). Em estudos anteriores [18], [35], o epitélio de superfície do ovário imediatamente adjacente às áreas tumorais foi considerado para ser pré-neoplásico. Estas lesões pré-neoplásicas frequentemente não têm uma membrana basal intacta como indicado pela ausência do colagénio IV e laminina de coloração, bem como a perda de expressão DAB2 [35]. Nos epitélios morfologicamente normais imediatamente adjacentes às áreas tumorais, tanto GATA6 e DAB2 são positivos. No entanto, as células neoplásicas contiguamente ligados são negativas para ambos GATA6 e coloração DAB2. As células neoplásicas no epitélio transformado que é imediatamente ligados às células epiteliais da superfície do ovário morfologicamente normais são susceptíveis mais similar ao normal, e, portanto, são consideradas células tumorais iniciais. Esta análise sugere a possibilidade de que a perda de GATA6 é um dos factores causadores de transformação epitelial do ovário.

As observações a partir de tecidos de cancro humano do ovário sugere que a perda de expressão GATA4 precede frequentemente a perda de GATA6, e a perda de GATA6, correlacionada com a perda de DAB2, associados com a transformação morfológica epitelial.

Redução da expressão do fator de GATA após passagem de células epiteliais da superfície do ovário em culturas primárias

ao longo dos últimos 5 anos no estudos de factores GATA em células epiteliais da superfície do ovário e de cultura, verificou-se que GATA4 está ausente em linhas de células de cancro dos ovários e também mais SV-40 transfectadas, “imortalizado” células epiteliais da superfície do ovário [17], [18]. Além disso, a expressão GATA4 foi variável em culturas primárias de células epiteliais da superfície do ovário humano. Assim, especula-se que a expressão de GATA4 não é estável em células epiteliais da superfície do ovário e pode reduzir gradualmente ao longo do tempo.

Para testar essa ideia, seguimos cuidadosamente as passagens das células epiteliais da superfície do ovário primárias em horas extras a cultura e monitorado a expressão de GATA4, GATA6 e genes DAB2. As células epiteliais da superfície do ovário foram colhidas a partir de ovários de oophorectomies profiláticos como descrito anteriormente [17], [18]. Os tecidos foram examinados e foram determinados como sendo morfologicamente normais e sem efeito de tumores microscópicos. A célula de tempo de duplicação foi de cerca de duas semanas inicialmente e reduzido para uma semana de 5 dias de passagens posteriores. Efetuamos as passagens de uma preparação celular MANGUEIRA (ROE 1.005.816) para a passagem 10 ao longo de um período de dois meses e as células ainda estavam altamente proliferativa no final. Tipicamente, as células podem crescer em cultura durante cerca de 20 passagens ao longo de um período de 6 meses antes de se submeter a senescência replicativa. Em cada passagem, metade das células foram recolhidos e utilizados para análise de expressão, e a outra metade foi mantida em cultura contínua.

Primeiro, as alterações na morfologia das células epiteliais da superfície do ovário, foi evidente. Inicialmente, as células pareciam ser redondo e achatado, com uma morfologia “calçada”, e cada vez mais as células tornou-se alongado e fusiforme, e as mudanças mais dramáticas foi observada na passagem 4 (Figura 4A). Os níveis de ARNm GATA4 foram encontrados para rapidamente reduzida, e tornou-se indetectável por passagem 4 (Figura 4B, C). A expressão de GATA6 e seu alvo transcrição DAB2, gradualmente reduzido ao longo do tempo, e os níveis de mRNA de ambos os genes eram 20-30% das células originais (Figura 4C). Como um controlo, mantendo-TBP casa gene (TATÁ box proteína de ligação, o número de acesso NM_003194) Nível de expressão tinha alterações insignificantes no decurso da cultura, e a variação reflecte, provavelmente, a gama de erro do ensaio.

células epiteliais da superfície do ovário humano foram isolados a partir de ovários humanos morfologicamente normais obtidos a partir de cirurgia de ooforectomia. As células foram passadas 10 vezes ao longo de um período de 3 meses, e as células foram colhidas a partir de cada passagem para análise de ARNm. A. Morfologia das células na passagem # 1, 2, 4, 6, 8, 10. B. O ARN total foram utilizadas para quantitativo em tempo real de RT-PCR para ensaiar os níveis de mRNA. Os resultados são apresentados como um “mapa de calor”. C. A quantidade de ARNm em relação à passagem 1 foi quantificada e apresentados como um gráfico de barras.

Assim, todos os GATA4, GATA6, e os níveis de ARNm são reduzidos DAB2 Após passagem das células epiteliais da superfície do ovário primárias em cultura. A perda de GATA4 precede a perda de GATA6 (e DAB2), semelhante à observação no epitélio do ovário pré-neoplásicas adjacentes para os carcinomas do ovário, onde GATA4 é muitas vezes perdida antes GATA6. Anteriormente, a perda de GATA4 GATA6 e no cancro do ovário e células epiteliais foi demonstrado ser pelo mecanismo de hipoacetilação de histonas H3 e H4 e a perda de histona H3 /lisina K4 trimethylation os seus promotores [18]. A expressão genética é determinada pelo padrão de modificação de histonas associada, conhecidos como os códigos de histona [39]. Perda de acetilação da histona leva a uma conformação da cromatina mais compacta e de perda de actividade de transcrição [40], e associados a histona H3 /lisina K4 metilação com genes activos [41], [42]. A perda de GATA4 prontamente e GATA6 expressão sugere a instabilidade da conformação estados epigenética /cromatina, consistente com a perda precoce de factores GATA na tumorigénese do ovário.

A alteração de modificação da cromatina no local GATA4 associada à perda de expressão mediante Passaging de células epiteliais da superfície do ovário em culturas primárias

Para determinar a causa da redução da expressão do factor de GATA em culturas primárias, que em primeiro lugar determinar a expressão de um grande painel de células epiteliais da superfície do ovário e células cancerosas. O ARN total foi isolado a partir de 8 preparações de células HOSE primárias (a partir de 7 pessoas, aqui, C.47 e D.47 foram divididos a partir das mesmas preparações HOSE mas foram cultivadas por diferentes funcionários de laboratório), 6 HIO linhas de células que são transfectadas com HOSE SV40-T-antigent para prolongar a expectativa de vida de cultura, e 6 linhas de células de cancro do ovário (Figura 5). O ARN foi submetido a semi-quantitativo de RT-PCR (Figura 5A) e em tempo real de RT-PCR (Figura 5B) para determinar os níveis de mRNA para GATA4, GATA6, DAB2, e GAPDH ou BHD como controlos de carga. GATA4 expressão é reduzida em algumas preparações de mangueira e de linhas de hio, e está ausente em todas as linhas de cancro, tal como determinado por tanto semi-quantitativo de RT-PCR e em tempo real de RT-PCR (Figura 5A, B). Redução da expressão e GATA6 DAB2 em Hio e linhas de cancro é mais aparente por em tempo real de RT-PCR (Figura 5B).

células epiteliais da superfície do ovário humano foram isolados a partir de ovários humanos morfologicamente normais obtidos a partir de cirurgia de ooforectomia. Várias linhas de hio também foram estabelecidas através de transfecção das células primárias com SV-40 antigénio-T para prolongar o tempo de vida em culturas. O ARN total isolado a partir de uma colecção de HOSE primária, HIO, e as células cancerosas foram usadas para: A. semi-quantitativo de RT-PCR, e B. quantitativo em tempo real de RT-PCR, para ensaiar os níveis de mRNA para GATA4, GATA6, DAB2, e GAPDH (semi-quantitativa por RT-PCR) ou BHD (em tempo real de RT-PCR) como controlos de carga. RNA suficientes foram obtidos a partir HOSE.96 (ou C.96), passagem # 3; HOSE.47 células, passagem Nº 5; e HOSE.63 células, passagem # 12; para o ensaio de CHIP. C. A localização dos iniciadores de F3 e R3 a GATA4 gene para o ensaio de PCR no chip é mostrado. D. lisados ​​de HOSE.96, HOSE.47, HOSE.63, ES2, SKOV3, A2780, OVCAR3 e OVCAR10 foram preparadas para o ensaio CHIP. precipitações de cromatina por anticorpos para AC H3, H4 Ac, Me

2H3K4, Me

3H3K4, Me

2H3K9, Me

2H3K27, e HPγ1 foram utilizados para amplificar por PCR, utilizando iniciadores F3 e R3. Foram incluídos o sinal de entrada ( “no”, 2% do total de cromatinas utilizadas para imunoprecipitação), de controlo sem anticorpo ( “Não”), e sem controlo de modelo ( “H

2O”). As imagens de campo brilhante dos produtos de PCR semi-quantitativos são mostrados. E. A localização dos primers F2 e B2 no gene GATA6 para PCR no ensaio CHIP é mostrado. F. Lysate de HOSE.96, HOSE.47, A2780, OVCAR3 e OVCAR10 foram preparadas para o ensaio CHIP. As imagens de campo claro dos produtos semi-quantitativos de PCR são mostrados.

Nós fomos capazes de obter uma quantidade suficiente de 3 células MANGUEIRA primárias (HOSE.96, HOSE.47 e HOSE.63) para mais estudo de alterações na modificação da cromatina e GATA4 GATA6 lócus por ensaio ChIP durante Passaging das células em culturas. Os níveis de GATA4 expressão correlacionam inversamente com o número de passagem das células: HOSE.96 (ou C.96) células, passagem # 3, têm alta expressão GATA4; HOSE.47 células, passagem nº 5, ter um nível GATA4 inferior; e HOSE.63 células, passagem # 12, tem um nível de expressão muito reduzida (Figura 5B).

Na sequência do protocolo previamente estabelecido para o ensaio de chip para genes GATA4 e GATA6 [18], descobrimos que, na verdade, num local imediatamente a montante do GATA4 exão 1 (Figura 5C), a redução dos níveis de expressão GATA4 correlaciona-se com a perda de acetilação da histona H3 e H4 (Figura 5D). Nenhuma mudança significativa foi visto por di e tri metilação de H3K4, marcadores para conformação activa da cromatina [41], [42]. No entanto, dimetilação de histona H3 em lisina 9 e 27 (Me

2H3K9, Me

2H3K27) e HP1 está ausente, sugerindo que o gene silenciado GATA4 não está sendo incorporada na heterocromatina [43].

ao lado da acetilação reduzida da histona H3 e H4 em células A2780, os padrões de modificação da histona no locus GATA6 (Figura 5E) é semelhante entre as células de mangueira e de linhas de cancro OVCAR3 e OVCAR10 (Figura 5F), o que sugere a alteração de modificação da histona em GATA6 lócus não é um evento geral nas células epiteliais e de cancro do ovário.

ovário tumor fenótipo propensa de ratos heterogêneo GATA6

Encontrar uma estreita correlação entre a perda de GATA6 e transformação epitelial nos levou a especular que a perda de GATA6 pode ser causal na transformação de células epiteliais da superfície do ovário. As observações acima sugerem também que a perda de GATA6 pode ser mais crítico do que a perda de GATA4 na promoção da transformação epitelial do ovário. Para determinar a consequência para a perda de GATA6 no epitélio de superfície do ovário, foi investigada a fenótipo de ovário de GATA6 (+/-) ratinhos, uma vez que os ratinhos homozigóticos são embrionário letal [24], [25]. Temos obtido e manteve uma colônia de camundongos knockout GATA6 ao longo dos últimos 2 anos. tecidos ovarianos foram colhidas dos ratinhos em cerca de um ano de idade, e a morfologia dos ovários a partir da mesma ninhada de GATA6 (+/-) e de tipo selvagem foram comparadas. Surpreendentemente, todos os ovários de GATA6 (+/-) genótipo apresentaram algumas anomalias (Tabela 2): Alguns ovários têm extensas lesões proliferativas do epitélio superficial (Figura 6A), e os outros têm grandes cistos ovarianos que são positivas para citoqueratina (Figura 6B ). O fenótipo de ovário parece com a de

DAB2

(+/-) ratos [32], de acordo com DAB2 como um alvo GATA6 transcrição e mediador [27].

A morfologia ovariana de GATA6 (+ /-) e ninhada de tipo selvagem de cerca de um ano de idade foi comparada. Citoqueratina coloração foi utilizado como um marcador para as células epiteliais. A. Um exemplo típico de um ovário de tipo selvagem mostra inúmeros folículos em vários estágios de desenvolvimento fechados dentro de uma camada de epitélio de superfície. Um ovário GATA6 representante (+/-) mostra a presença de crescimento de células epiteliais da superfície (seta). B. Uma grande parte do GATA6 (+/-) ovários também apresenta grandes cistos dentro dos ovários. As células que revestem os cistos são citoqueratina positivas (painéis inferiores). Todas as imagens foram tiradas sob um microscópio com uma ampliação de 100 ×.

Assim, este resultado sugere influências de deficiência GATA6 superfície do ovário epitélios, possivelmente, promover a transformação, embora o tecido eliminação específica de GATA6 no epitélio de superfície do ovário células será um teste melhor, quando GATA6 camundongos knockout condicional se tornam disponíveis.

Discussão

Este estudo analisou a expressão do GATA 4 e GATA6 em células epiteliais da superfície do ovário e carcinomas em detalhe, e encontrou que a perda de propagação GATA4 é mais ampla e muitas vezes precede GATA6 na transformação do epitélio de superfície do ovário. A perda de GATA6, no entanto, está intimamente relacionada com a transformação morfológica do epitélio. O prontamente redução da GATA4 e GATA6 expressão por cultura das células epiteliais da superfície do ovário sugere a instabilidade da epigenética conformação estado /cromatina de GATA4 e GATA6 lugar, consistente com a perda precoce na tumorigênese de ovário. A perda precoce de GATA4 e GATA6 ea estreita correlação com a transformação neoplásica do epitélio de superfície do ovário sugere um papel causal, que é apoiado pela prevalência de lesões epiteliais de ovário em ratos deficientes heterozigotos GATA6 [32].

contraste com outros subtipos histológicos, carcinomas mucinosos do ovário geralmente são positivas para GATA4 e expressão GATA6. Na verdade, a morfologia dos carcinomas mucinosos do ovário é muito único em que as células cancerosas parecem manter a polaridade apical e muitas vezes existe como epitélios monocamada.

A perda rápida de GATA4 em passaging de pilhas na cultura é intrigante. A perda de expressão GATA4 em Passaging de células primárias em cultura associados com perda de H3 e a acetilação da histona H4 no locus promotor GATA4. A perda de GATA4 em linhas celulares de cancro aparece também mediado pela redução da histona H3 e H4 acetilação do locus promotor.