Abstract

Fundo

adenocarcinoma esofágico (EAC) é uma doença curável e raramente está crescendo rapidamente em todo o mundo em incidência. esôfago de Barret (BE) e displasia de grau elevado (HGD) são considerados os principais fatores de risco para adenocarcinoma invasivo. No estudo atual, metabólica mundial imparcial métodos de perfil foram aplicados a amostras de soro de pacientes com EAC, BE e HGD e indivíduos saudáveis, a fim de identificar biomarcadores com base metabólitos associados com os estágios iniciais da EAC com o objetivo de melhorar o prognóstico.

Metodologia /Principais achados

perfis de metabólitos de soro de pacientes com EAC (n = 67), BE (n = 3), HGD (n = 9) e voluntários saudáveis ​​(n = 34) foram obtido usando espectrometria líquida de alta eficiência cromatografia de massa (LC-MS) métodos. Doze metabólitos diferiram significativamente (

p Art 0,05) entre pacientes EAC e controles saudáveis. A análise discriminante modelo parciais mínimos quadrados (PLS-DA) teve uma boa precisão com a área sob a curva característica operativa (AUROC) de 0,82. No entanto, quando os resultados de LC-MS foram combinados com 8 metabolitos detectados por ressonância magnética nuclear (RMN) num estudo anterior, a combinação de NMR e MS detectado metabolitos proporcionado um desempenho muito superior, com AUROC = 0,95. Além disso, os valores médios de 12 destes metabolitos variaram de forma consistente de controles saudáveis ​​para os indivíduos de alto risco (BE e pacientes HGD) e assuntos da EAC. caminhos metabólicos alterados incluindo um número de vias de aminoácidos e metabolismo energético foram identificados com base em níveis alterados de vários metabolitos.

Conclusões /Significado

perfis metabólicos obtidos a partir da combinação de LC-MS e RMN métodos de distinguir prontamente pacientes EAC e potencialmente prometer rotas importantes para a compreensão da carcinogênese e detectar o câncer. Diferenças nos perfis metabólicos entre indivíduos de alto risco e a EAC indicam a possibilidade de identificar os pacientes de risco muito mais cedo para o desenvolvimento do câncer de

Citation:. Zhang J, Bowers J, Liu L, Wei S , Gowda GAN, Hammoud Z, et al. (2012) Cancro esofágico metabolito Biomarkers detectado por LC-MS e Métodos de RMN. PLoS ONE 7 (1): e30181. doi: 10.1371 /journal.pone.0030181

editor: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, França |

Recebido: 22 de setembro de 2011; Aceito: 12 de dezembro de 2011; Publicado: January 23, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Centro Purdue University for Cancer Research e do Centro de Ciências Oncológicas no Discovery Park em Purdue. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de esôfago é uma doença mortal com uma estimativa de 16.640 novos casos e 14.500 mortes nos Estados Unidos em 2010 [1]. No ano de 2000 os números correspondentes eram de 12.300 e 12.100, respectivamente [2], o que indica um aumento significativo na incidência. Dos dois tipos de câncer, adenocarcinoma esofágico (EAC) e carcinoma de células escamosas, EAC é mais prevalente nos Estados Unidos. Embora os factores de risco associados com o EAC não são claramente compreendido até à data, o esófago de Barrett (BE) é considerado para ser um factor para a carcinogénese do esófago [3]. Além disso, displasia de alto grau (HGD) é considerado como um precursor imediato do adenocarcinoma invasivo [4]. No entanto, não existe actualmente intervenção que podem impedir a progressão da BE ou HGD para EAC [5]. Os métodos tradicionais para o diagnóstico de cancro do esófago, incluindo endoscopia e deglutição de bário, sofrem de falta de especificidade e sensibilidade, que normalmente resultam na detecção da doença só numa fase avançada [6], [7], [8], [9]. Em alternativa, espera-se que um certo subconjunto de biomarcadores moleculares podem caracterizar o estágio da doença e ajudar a personalizar o tratamento [10]. Ao nível molecular, a carcinogénese do esófago é pensado para ser um processo complexo que envolve múltiplas anormalidades genéticas e factores ambientais. Numerosos estudos relatam alterações específicas nas proteínas, genes e vias metabólicas em EAC que podem ser úteis para ajudar no diagnóstico, prognóstico e tratamento de cancro do esófago [11], [12], [13], [14]. Microarray estudos focaram também descoberta de novos marcadores com base na composição genética tumor individual [15]. No entanto, os marcadores confiáveis, especialmente em um estágio inicial e potencialmente curativa, ainda estão em grande demanda.

Metabolomics, também conhecido como perfil metabólico e metabonomics, é um campo em rápido crescimento na biologia de sistemas e oferece um poderoso e abordagem promissora para identificar biomarcadores associados com câncer e outras doenças. Metabolomics se concentra em obter os fluxos e concentrações de metabolitos de baixo peso molecular ( ~ 1 kDa) em fluidos biológicos ou tecidos, que fornecem informações detalhadas sobre sistemas biológicos e seu status atual [16], [17]. Espectrometria de massa (MS) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) são os dois métodos analíticos mais poderosos e frequentemente utilizadas para a impressão digital metabólica [17], [18]. Os dois métodos são complementares; enquanto que MS é altamente sensível, NMR é altamente quantitativo e reprodutível. A utilização de ambos os métodos de RMN e MS leva à análise de rotina de mais de 1000 metabolitos.

Um número crescente de estudos metabolômicos têm sido relatados para a detecção de vários cancros [19], [20], [21], [22 ], [23]. No entanto, os estudos que se concentram em EAC ainda são relativamente pequenos em número. Recentemente, dois trabalhos relatados na análise de metabolitos de tecido do ângulo mágico usando fiação (MAS) RMN e cromatografia gasosa (GC) MS cada uma delas combinada com métodos estatísticos multivariados [24], [25]. Ambas as obras relatou uma série de metabólitos de distinção estatisticamente significativos. Outro estudo

1H NMR investigado plasma humano e variações identificadas em várias concentrações dos metabólitos associados com EAC que diferiam entre os grupos étnicos [26]. Os esforços em nosso laboratório têm sido focados no desenvolvimento de ferramentas metabolômica e candidatos biomarcadores para detectar precocemente EAC e identificar pacientes com alto risco de desenvolver EAC. Recentemente, relatou investigações baseadas em metabolômica de EAC usando

1H NMR espectroscopia e mostrou que oito metabólitos séricos diferenciado EAC de controles saudáveis ​​[27]. Também como alvo um número de nucleósidos no soro utilizando cromatografia de quádruplo triplo líquido (LC-qqq) MS e mostrou variações muito significativas num certo número de nucleósidos normais e metilados em EAC [28]. Com o objetivo de aumentar a sensibilidade e especificidade da classificação paciente, bem como a identificação de indivíduos em risco de desenvolver o câncer, no presente estudo foi aplicado abordagem global perfil metabólico das amostras de soro de EAC, BE e pacientes Hgd e controles saudáveis ​​utilizando espectrometria de massa de tempo-de-voo altamente sensível e resolvido juntamente com a cromatografia líquida (LC-MS TOF). perfis metabólicos foram analisadas separadamente e em combinação com marcadores de metabolitos derivados anteriormente utilizando métodos de RMN [27]. Avaliou-se a combinação dos dados de RMN e MS em termos de desempenho na classificação de doentes EAC e controlos saudáveis ​​quando comparado com o desempenho de ambos os dados de RMN ou MS sozinho. Examinou-se a capacidade dos perfis metabólicos para distinguir os indivíduos de alto risco (os pacientes BE e HGD) de EAC, bem como controlos saudáveis. Nós também identificou uma série de metabólitos que agiu como marcadores de tendências, em que os seus níveis médios aumentado /diminuído continuamente desde controles saudáveis ​​para indivíduos de alto risco e, em seguida, os pacientes da EAC.

Materiais e Métodos

Chemicals

óxido de deutério (99,9% D) foi comprado de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA). Trimethylsilylpropionic ácido-d

4 de sal de sódio (TSP), ácido tridecanóico, clorofenilalanina, ácido láctico, valina, leucina, isoleucina, metionina, carnitina, tirosina, triptofano, ácido mirístico, ácido margárico, ácido linolénico, ácido linoleico e ácido piroglutâmico foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (grau analítico, St. Louis, MO). 5-hidroxitriptofano foi comprado de Alfa-Aesar (grau analítico, Ward Hill, MA). metanol de grau HPLC e ácido acético foram adquiridos a Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). água deionizada foi obtido a partir de uma II UV sistema de purificação de água EASYpure (Barnstead International, Dubuque, IA).

coleta e armazenamento de amostras Soro

O jejum amostras de sangue de pacientes com comprovada histologicamente EAC (n = 67), HGD (n = 9) e BE (n = 3) foram coletados na Escola Indiana University of Medicine (Indianapolis, IN). As características clínico-patológicas detalhadas de pacientes EAC foram descritos em nosso trabalho anterior [27], e um resumo é apresentado na Tabela S1. Nós usamos 68 EAC, amostras de 11 Hgd e 5 BE no estudo NMR anterior. No entanto, devido às quantidades limitadas de algumas amostras, removemos 1 EAC, 2 HGD e 2 amostras ser para os experimentos LC-MS e posterior análise neste trabalho; os dados de RMN correspondentes também foi excluído da análise e discussão combinados. Amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​(n = 34) foram obtidos em condições de jejum. Cada amostra de sangue foi deixada a coagular durante 45 minutos e depois centrifugou-se a 2000 rpm durante 10 min. O soro foi recolhido, dividido em alíquotas num frasco separado, congelados, e enviado sobre gelo seco para Universidade de Purdue (West Lafayette, IN), onde foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. Todas as amostras foram recolhidas de acordo com o protocolo aprovado pela Indiana University School of Medicine e da Universidade de Purdue Institucionais Review Boards. Todos os indivíduos incluídos no estudo consentimento informado por escrito fornecido de acordo com as diretrizes institucionais.

A preparação da amostra e aquisição de dados

Para a análise LC-MS, as amostras de soro congeladas foram descongeladas e a proteína foi precipitada por 100 uL de mistura de soro e 200 mL de metanol frio. Dois padrões internos, ácido tridecanóico e clorofenilalanina também foram incluídos para monitorizar a eficiência da extracção. A mistura foi centrifugada a 13200 rpm durante 10 min. A solução sobrenadante obtido após a remoção de proteína foi seco sob vácuo e o resíduo obtido foi reconstituído em 15 mL de metanol /água (01:01) de solução. A solução resultante foi de novo centrifugada a 13200 rpm durante 10 min para remover as partículas, se houver, e o sobrenadante foi transferido para um frasco de LC. Separadamente, uma amostra combinada foi obtido pela mistura de 20 uL de cada uma das 20 amostras de soro humanos seleccionados aleatoriamente a partir de todas as amostras, e os metabolitos foram extraídos utilizando o mesmo procedimento como acima. Esta amostra colectiva, referida como a matriz de amostra de controlo da qualidade (QC), foi submetido a análise periodicamente entre cada 10 amostras. dados de amostra QC também serviu como repetições técnicos em todo o conjunto de dados para avaliar a reprodutibilidade do processo. A análise por LC-MS foi realizada utilizando um sistema Agilent LC-QTOF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) que consiste em um sistema de cromatografia líquida SL Agilent 1200 acoplado em linha com um espectrómetro de massa de tempo-de-voo Agilent 6520. Uma aliquota de 3 uL de amostra reconstituído foi injectada numa 2,1 x 50 milímetros Agilent Zorbax Extend-C18 1.8 coluna uM de partícula com um 2,1 x 30 milímetros Agilent Zorbax SB-C8 3,5 um pré-coluna de partículas, que foram ambos aquecidos a 60 ° C. metabolitos de soro foram gradiente-eluiu a 600 mL /min, utilizando a fase móvel A: ácido acético 0,2% em água e a fase móvel B: 0,2% de ácido acético em metanol (2% a 98% de B em 13 min, 98% de B durante 6 min ). A ionização por electrospray (ESI) foi utilizada no modo positivo. O capilar interface de MS foi mantida a 325 ° C, com um fluxo de gás bainha de 9 l /min. A tensão de pulverização para injecção de ião positivo foi de 4,0 kV. O analisador de massa foi digitalizada em um intervalo de 50-1000

m

/

z

. Agilent MassHunter Workstation LC-TOF e software QTOF Acquisition (B.02.01) foi utilizado para detecção de pico automática e deconvolução espectro de massa.

Os procedimentos detalhados para preparação de amostras e experiências de RMN foram recentemente publicados em outros lugares [27]. Resumidamente, as amostras de soro congeladas foram descongeladas e 200 ul foi misturada com 350 ul de D

2O. As soluções resultantes foram transferidas para tubos de RMN de 5 mm. Uma solução de 60 mL de TSP (0,12 mg /mL) num capilar selado foi utilizado como um padrão interno, que actuou como a referência de desvio químico (δ = 0,00). Todos

experiências de RMN de 1H foram realizados a 25 ° C num DRX 500 espectrómetro Bruker equipado com uma ressonância tripla

1H sonda de detecção inversa com o eixo triplo gradientes de campo magnético.

espectros de 1H NMR foram adquiridos utilizando a sequência de pulso padrão unidimensional CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill), com pré-saturação sinal de água. Cada conjunto de dados foi em média mais de 64 transientes usando 16 K pontos no domínio do tempo. Os dados foram transformada de Fourier após multiplicação por uma função de janela exponencial com uma ampliação de linha de 1 Hz, e os espectros foram fase e de linha de base corrigido usando o software TopSpin Bruker (versão 3.0).

A análise dos dados

LC-MS foi processada utilizando software MassHunter Análise qualitativa do Agilent (versão B.03.01) para a identificação de compostos. Uma lista de intensidades de iões para cada pico detectado foi gerado usando o índice de um tempo de retenção (RT) e de dados m /z como os identificadores para cada ião. Professional software Agilent MassHunter Workstation Mass Profiler (versão B.02.00) foi então usado para o alinhamento composto de pico. Um filtro foi criado para remover quaisquer sinais de metabolitos que tinha falta picos (intensidade iónica = 1) em mais de 10% das amostras em qualquer grupo. Picos de padrões internos também foram removidos. Finalmente, a base de dados Agilent Fórmula (Agilent, 2010) foi utilizado para a identificação de compostos combinando o espectro de massa precisas para uma base de dados de compostos de metabolito. de Student não pareado

t

análise -test dos dados foi realizada para avaliar as diferenças de intensidades compostos detectados entre EAC, BE e amostras Hgd e controles saudáveis. Metabolitos com baixo

p

-Valores ( 0,05) foram selecionados como candidatos potenciais biomarcadores e verificado a partir dos espectros de massa e RTs de compostos comerciais autênticas executado separadamente. A mudança vezes (FC) para cada metabolito foi calculado para determinar a variação do metabolito entre os grupos.

NMR regiões espectrais foram binned a 4 K baldes de igual largura (1,5 Hz) para minimizar os erros devido a eventuais flutuações de química deslocamentos resultantes de pH ou de iões de variações de concentração. Cada espectro foi alinhado com o pico de metilo de alanina no 1,48 ppm, e normalizada utilizando o sinal de TSP integrada. regiões espectrais de 0,3 a 10,0 ppm foram utilizadas para a análise depois de eliminar os sinais de água e ureia (4,5-6,0 ppm). A análise univariada foi realizada através da aplicação de Student não pareado

t

-teste para identificar significativamente diferentes caixas espectrais entre EAC, BE e pacientes Hgd e controles saudáveis. Caixas que apresentaram diferenças significativas entre os vários paciente /controla os grupos foram então atribuído aos metabolitos correspondentes, comparando os desvios químicos e as multiplicidades de picos com a literatura ou bases de dados on-line [29], [30], [31]. As regiões espectrais característicos para cada metabólito foram integrados, e

p

-Valores e dobre mudanças entre diferentes grupos foram calculados.

Os dados MS /RMN dos metabolitos estatisticamente significativas selecionados (com

p Art 0,05) foram importados para Matlab (R2008a, Mathworks, Natick, MA) instalado com uma caixa de ferramentas PLS (versão 4.1, Eigenvector Research, Inc., Wenatchee, WA) para PLS-DA analisa. A matriz X, que consiste em os dados espectrais de MS /RMN, foi auto-ajustadas antes de todas as análises estatísticas. Dependendo do grupo, cada indivíduo foi atribuído um “0” (isto é, o paciente) e “1”, (isto é, controlo saudável) para servir como a matriz (unidimensional) Y. Deixe-one-out validação cruzada (CV) foi escolhido, eo número de variáveis ​​latentes (VEs) foi selecionado de acordo com a raiz mínimo erro médio quadrado de procedimento CV. As previsões foram feitas visualmente utilizando um gráfico de dispersão Y-previu com um valor de corte escolhida para minimizar erros na associação de classe. O pacote estatístico R (versão 2.8.0) foi usado para gerar características de funcionamento receptor curvas (ROC), calcular e comparar a sensibilidade, especificidade e área sob a curva ROC (AUROC).

Resultados

o espectro de LC-MS para cada amostra de soro consistiu em mais do que 5000 características do que cerca de 1400 picos foram designados para os metabolitos usando o banco de dados Agilent. Picos do espectro de que estavam em falta em mais de 10% das amostras a partir de um grupo foram omitidos da análise posterior. A utilização deste filtro e a biblioteca química Agilent resultou num total de aproximadamente 200 metabolitos identificados mais comuns a todos os grupos. Além disso, para identificar metabólitos específicos que melhor se correlacionaram com as diferenças de estatuto biológico para as várias comparações, os metabólitos identificados-biblioteca foram analisados ​​usando análise univariada. Os resultados mostraram que 40 metabolitos variou significativamente (

p Art 0,05) entre ambos os EAC e controles saudáveis, EAC e pacientes de alto risco (BE e pacientes HGD), ou pacientes de alto risco e controles saudáveis. Treze destes metabolitos pôde ser verificada a partir dos espectros e retenção vezes em massa dos autênticos compostos comerciais. Tabela S2 mostra a lista dos metabólitos verificados de LC-MS juntamente com suas fórmulas, massas e tempos de retenção. Do mesmo modo, como mostrado na Tabela S3, quinze doentes de classe diferenciação metabolitos com baixo

P

-Valores (

P

0,05), obtido por integração dos picos de RMN correspondentes foram confirmados por correspondentes a observada dados deslocamentos químicos e multiplicidades com o relatado anteriormente [29], [30], [31]

o resumo dos candidatos metabólito biomarcadores de LC-MS e RMN com a sua

p.

– valores e mudanças dobra são mostrados na Tabela 1. ANOVA também foi realizada, com resultados que se assemelhavam estreitamente às da

t

-test (Tabela S4). No entanto, uma vez que estávamos interessados ​​na identificação de marcadores individuais que distinguem cada um dos três grupos de pacientes separadamente, foram utilizados os

t

-Test dados para identificar marcadores para construção de modelos. A sensibilidade, especificidade e valores AUROC dos modelos PLS-DA de cada comparação estão listadas na Tabela 2. Comparação de dados de MS e RMN usando o

t

-teste, separadamente, não apresentaram diferenças significativas devido ao sexo, idade ou estágio do câncer (

p Art 0,05) entre EAC e controles (Tabela S5)

Comparando perfis metabólicos entre os pacientes EAC e controles saudáveis ​​

Como se mostra na Tabela 1, metabolito doze candidatos marcador detectado por LC-MS diferenciadas pacientes EAC e controlos saudáveis, e as suas identidades foram confirmadas com compostos autênticos. Figura S1 mostra as parcelas box-and-suiça para as intensidades de pico dos 12 diferenciadoras candidatos biomarcadores. Como pode ser visto na Tabela 1 e Figura S1, os níveis de ácido láctico, carnitina e ácido margárico foram mais elevadas, e os da valina, leucina /isoleucina (estes isómeros estruturais não podiam ser separados com o método LC corrente), metionina, tirosina, triptofano ,, ácido mirístico 5-hidroxitriptofano, ácido linolênico e ácido linoléico foram menores nos pacientes EAC em comparação com controles saudáveis.

Os candidatos marcador de

1H NMR análise foram relatados em nosso estudo anterior [27]. Resumidamente, um conjunto de 8 metabolitos, incluindo β-hidroxibutirato, lisina, glutamina, citrato, creatinina, lactato, glucose e uma molécula desconhecida foram estatisticamente significativas (

P

0,05), e níveis mais elevados de cada um dos esses metabolitos nas amostras EAC foram observadas (Tabela 1).

Figura 1 mostra a comparação do desempenho de 3 perfis metabólicos entre os pacientes EAC e controles saudáveis. Um modelo PLS-DA usando os doze LC-MS derivados metabolitos (e deixar-one-out valorização cruz) forneceu 77% de sensibilidade e 86% de especificidade com uma AUROC de 0,82. análise similar usando os oito metabólitos RMN derivados desde 82% de sensibilidade e 88% de especificidade com uma AUROC de 0,86. No entanto, quando os dados de metabólitos foram analisados ​​combinando o 12 LC-MS e os 8 RMN metabolitos detectados, o modelo fornecido um desempenho muito superior com a sensibilidade e especificidade de 91% e uma AUROC de 0,95.

(A ) Esquerda, resultado do modelo PLS-dA utilizando 12 marcadores de metabólitos de LC-MS análises; meio, curva ROC usando os valores de classe previstos validadas (AUROC = 0,82); previsão direita, PLS-DA para o BE e amostras Hgd do modelo LC-MS comparando EAC e controles saudáveis. (B) O mesmo que (A), excepto usando 8 marcadores de metabolitos a partir de análises de RMN, (AUROC = 0,86); (C) O mesmo que (A), utilizando a combinação de LC-MS e NMR detectados marcadores de metabolitos, (AUROC = 0,95).

Para avaliar o BE e amostras Hgd, os mesmos PLS-DA modelo foi aplicado, e o resultado é também mostrado na Figura 1 (à direita). amostras sejam deu um resultado misto, e nenhuma conclusão confiável poderia ser feito por causa do pequeno número de amostras. No entanto, a maioria das amostras de HGD foram previstos como EAC neste caso. O modelo PLS-DA baseado em RMN detectados metabolitos, eo modelo baseado na combinação de LC-MS e NMR detectados metabolitos ambos mostraram que 7 dos 9 pacientes HGD foram indicados como sendo semelhante a amostras da EAC.

metabólica Comparando perfis de EAC e pacientes de alto risco

os dados para pacientes de alto risco (BE e pacientes HGD) foram combinados para a análise por causa de seus números de amostras pequenas. A análise univariada dos dados mostrou que 7 LC-MS e NMR 8 metabólitos detectados variou significativamente entre EAC e os pacientes de alto risco, o que, juntamente com o

p

-Valores e dobre as alterações são apresentados na Tabela 1.

modelos PLS-dA foram então construído utilizando LC-MS e RMN sinais derivados de metabolito, separadamente e em combinação, para testar a precisão da classificação para os dois grupos de pacientes, e os resultados são mostrados na Figura 2. a LC -MS metabolitos derivados fornecida sensibilidade e especificidade de 83% e 80%, respectivamente, com um AUROC de 0,87, e RMN metabolitos fornecidos tanto a sensibilidade e a especificidade de 77% com um derivado AUROC de 0,72. Quando os dados foram analisados, combinando os metabólitos derivados de LC-MS e RMN, uma sensibilidade e especificidade de 67% e 97% foram obtidos, respectivamente, com uma AUROC de 0,82. Aqui, embora o desempenho do modelo a partir dos dados combinados foi ligeiramente melhor do que a partir dos dados de RMN sozinho, o modelo derivado da LC-MS detectado metabolitos mostrou o melhor desempenho. Ao testar os controles usando os mesmos modelos PLS-DA derivadas da LC-MS detectado, NMR detectado e metabolitos, 22, 12 combinados e 22 de 34 controles foram acima do valor de corte, respectivamente, e, portanto, foram classificados como não sendo semelhante aos pacientes EAC

(a) Esquerda, resultado do modelo PLS-dA usando 7 marcadores de metabólitos de LC-MS analisa.; meio, curva ROC usando os valores de classe previstos validadas (AUROC = 0,87); direita, previsão PLS-DA para os controles saudáveis, utilizando o modelo desenvolvido usando metabólitos LC-MS comparando pacientes EAC e de alto risco. (B) O mesmo que (A), excepto que se utilizaram os 8 marcadores de metabolitos a partir de análises de RMN, (AUROC = 0,72). (C) O mesmo que (A), utilizando a combinação de LC-MS e NMR detectados marcadores de metabolitos, (AUROC = 0,82).

Comparando perfis metabólicos de controles saudáveis ​​e pacientes de alto risco

Apenas um metabolito, ácido piroglutâmico, detectado por LC-MS, RMN e três metabolitos detectados, prolina, ácido láctico e um metabolito desconhecido, diferiram significativamente (

P

0,05) entre os de alto risco pacientes de controlos saudáveis ​​(Tabela 1). Além disso, um pico resultante da proteína N-acetilada nos espectros de RMN mostrou uma diferença significativa entre os dois grupos. Enquanto os níveis de ácido piroglutâmico, prolina e ácido láctico foram maiores no grupo de alto risco, os outros foram menores.

Os dados de LC-MS e RMN para os indivíduos de alto risco e controles saudáveis ​​foram comparadas usando análise PLS-DA (figura S2). O metabolito distintiva solitário detectado por LC-MS, ácido piroglutâmico, tinha uma sensibilidade e uma especificidade de 74% e 75%, respectivamente, com um AUROC de 0,76. Um modelo PLS-DA com base no RMN detectado metabolitos fornecidos uma sensibilidade e uma especificidade de 68% e 92%, respectivamente, com um AUROC de 0,80. A análise combinada dos dados provenientes dos dois métodos analíticos fornecidos resultados semelhantes aos que só por RMN. No entanto, todos os modelos não conseguiu dar uma previsão clara dos pacientes EAC usando apenas o alto risco e grupos saudáveis, indicando que (não de forma inesperada) amostras da EAC de pacientes são necessários para construir um modelo de detecção bem sucedida.

marcadores de tendências

os níveis de metabólitos entre os três grupos, EAC, BE HGD e controles saudáveis ​​foram comparadas usando parcelas box-and-suiça. Interessantemente, os níveis médios de 12 dos metabolitos, incluindo o ácido láctico, valina, leucina /isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, ácido mirístico, ácido linoleico, β-hidroxibutirato, lisina, glutamina e citrato progressivamente alteradas com os níveis médios para BE e pacientes HGD caindo entre os níveis de controlos saudáveis ​​e EAC (Figura 3). Enquanto os níveis de ácido láctico, 3-hidroxibutirato, lisina, glutamina e citrato aumentou, os níveis de valina, leucina /isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, ácido mirístico e ácido linoleico diminuiu progressivamente.

na linha horizontal a parte do meio da caixa, mediana; limites inferiores e superiores do caixas, inferiores e quartil superior; bigodes, 5 e 95 percentis; círculos abertos, valores aberrantes. Os primeiros oito marcadores foram detectados por LC-MS, e os restantes quatro foram detectados por RMN.

Usando esses 12 marcadores, os modelos PLS-DA foram novamente construída utilizando LC-MS e RMN separadamente e em combinação, para testar a precisão da classificação para cada uma das duas comparações entre os grupos (Figura 4). A Figura 4A mostra o modelo PLS-DA para EAC v. Os controlos saudáveis ​​e prevê valores para os doentes de alto risco. O modelo proporcionou uma sensibilidade e especificidade de 89% e 90%, respectivamente, com um AUROC de 0,92, embora o teste preditivo para BE e HGD não melhorar ao longo do que usando os PLS-DA anteriores modelo (Figura 1B e C). A Figura 4B mostra o modelo PLS-DA comparando EAC e o grupo de doentes de alto risco, resultando numa sensibilidade, especificidade e AUROC de 76% a 70% e 0,78, respectivamente. Neste caso foi obtida uma melhoria no teste preditivo dos indivíduos do grupo controle, com 30 dos 34 controles que aparecem acima da linha de corte (não-EAC like). No entanto, esses 12 marcadores não poderia ser utilizado para gerar uma clara classificação de entre os controlos saudáveis ​​e em pacientes de risco utilizando PLS-DA, pelo que não é possível utilizar um tal modelo para prever EAC (dados não mostrados).

(A) comparação de desempenho de perfis metabólicos entre pacientes EAC e controles saudáveis, AUROC = 0,92. (B) Comparação do desempenho dos perfis metabólicos entre EAC e BE /pacientes Hgd, AUROC = 0,78.

Discussão

Este estudo é focado na identificação de metabólitos distintivos para o estabelecimento de melhoria clínica biomarcadores para a detecção de EAC, o desenvolvimento de um modelo de classificação mais robusta, e insights sobre as vias metabólicas alterados em EAC.

os metabolitos derivados de diferenciação do indivíduo LC-MS e RMN mostrou diferenças distintas em um número de metabolitos entre EAC e controles e alcançou boa precisão da classificação. No entanto, a combinação de perfis metabólicos dos dois métodos permitiu o acesso a um número aumentado de metabolitos distinguem. A capacidade de previsão do modelo derivado a partir da combinação de métodos de MS e de RMN apresentou melhor desempenho tanto em sensibilidade e especificidade quando comparado com os resultados dos métodos analíticos individuais. A natureza complementar da piscina metabólica combinado derivado dos dois métodos contribuíram para esta melhoria do modelo. De facto, todo o LC-MS do metabolito detectado marcadores candidatos, com excepção do ácido láctico são diferentes dos que os detectados por RMN. Convém, no entanto, sublinhar que, apesar da melhoria na classificação foi muito claro para distinguir EAC e controles, quando os dois métodos analíticos foram combinados o melhor desempenho para discriminar alto risco (BE e HGD) pacientes versus EAC foi menos perceptível e só em a região de especificidade elevada (Figuras 1 e 2). Este efeito é provavelmente devido ao pequeno número de pacientes de alto risco e, possivelmente, a variação de alterações metabólicas para um grau maior de um paciente para outro, sendo que ambos podem fazer previsão do modelo mais desafiadora.

Comparação do indivíduo metabolitos e os modelos estatísticos desenvolvidos usando os metabólitos de diferenciação entre os três grupos mostraram que os perfis metabólicos do BE e pacientes Hgd eram diferentes de ambos os pacientes EAC e controles saudáveis. progressivas alterações nos níveis de metabolitos derivados de 12 métodos de RMN e LC-MS indicam a utilidade potencial para a identificação de pacientes BE e HGD que podem desenvolver EAC (Figura 3). Isto é particularmente importante, uma vez BE e HGD são os principais fatores de risco para o desenvolvimento de EAC. Identificação de metabolitos nestes pacientes, que são potencialmente preditivos para o desenvolvimento de EAC é particularmente importante para a gestão de pacientes em risco.

Identificação das vias metabólicas associadas com metabolitos específicos exibindo níveis alterados pode melhorar a compreensão de a biologia e a patologia da trajectória de normal a doença esofágica e, finalmente, o cancro. Anteriormente, demonstrou um mapa simplificado via com base nos marcadores de metabolito identificado por RMN e comparados os resultados com outros tipos de cancros [27]. Com base neste modelo, A Figura 5 mostra um mapa via mais detalhada associada com marcadores de metabolitos identificados usando ambos os métodos MS e de RMN. vias alterados incluem alterações no metabolismo de aminoácidos, a biossíntese e degradação (glutamina, lisina, carnitina, valina, leucina /isoleucina, metionina, triptofano, 5-hydroxytrytophan, e tirosina), a glicólise (lactato e de glucose), a síntese de corpos cetónicos e degradação (