Abstract
Berberin, extraído de ervas chinesas chinensis Coptis medicina, foi encontrado para ter anti atividades -tumor. No entanto, os mecanismos subjacentes não foram completamente elucidados. Nosso estudo demonstrou que berberin inibiu o
in vitro
e
in vivo
crescimento, a migração /invasão de células CRC, através de atenuar os níveis de COX-2 /PGE
2 de expressão, seguinte, reduzindo a fosforilação de JAK2 e STAT3, bem como a expressão de MMP-2 /-9. Nós clarificado que o aumento da COX-2 /PGE
2 a expressão compensar a actividade repressora da Berberin na sinalização JAK2 /STAT3, e um inibidor de JAK2 AZD1480 bloqueou o efeito de COX-2 /PGE
2 em MMP- 2 /-9 expressão. Em resumo, Berberin inibida CRC invasão e metástase através de down-regulação da COX-2 /PGE
2 JAK2 /STAT3 via de sinalização
Citation:. Liu X, Ji Q, Ye N, Sui H, Zhou L, H Zhu, et ai. (2015) Berberina inibe a invasão e metástase de células de câncer colorretal via COX-2 /PGE
2 JAK2 Mediada /STAT3 via de sinalização. PLoS ONE 10 (5): e0123478. doi: 10.1371 /journal.pone.0123478
Editor do Academic: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN
Recebido: 10 de dezembro de 2014; Aceito: 18 de fevereiro de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015
Direitos de autor: © 2015 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81303103, 81473478, 81303102), Ciência e Tecnologia da Comissão, de Xangai Município (13ZR1461000, 14140901402) e Programa de Shanghai Comissão Municipal de Educação (13CG47, 13YZ045). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias humanas mais comuns, ocupando o terceiro lugar para a incidência de câncer no mundo [1]. Actualmente, a cirurgia é a primeira escolha para o tratamento de CRC, mas a taxa de metástase de tumor pós-cirúrgico continua a ser elevado, em resultado da invasão e da migração de células de CRC para o tumor em torno tecidos e órgãos distal [2-3]. Assim, bloquear a célula CRC de metástase é uma estratégia importante da terapia do cancro.
Berberin, um alcalóide isolado a partir de Coptischinensis medicina tradicional chinesa, tem propriedades anti-inflammary, efeitos anti-infecciosos e tem sido utilizado para tratar a diabetes e hipertensão [4-6]. Mais recentemente, berberin se verificou ter actividade anti-tumoral, afectando através de MMP-2 /-9 expressão [7-8], mas o mecanismo molecular subjacente permanece elusiva.
Estudos anteriores mostraram que, sobre- expressão de COX-2 se correlaciona com CRC tumorigénese, não só que promovem a proliferação de células tumorais e inibem a apoptose, mas também melhorar a angiogénese tumoral, a ligação de células de tumor, bem como a migração /invasão [9]. A prostaglandina E2 (PGE
2), o principal produto catalisada da COX-2 a partir de ácido araquidónico, desempenha um papel fundamental na tumorigénese CRC [10]. JAK2 /via de sinalização da STAT3 é persistentemente activados no CRC,-se-que regula os níveis de expressão de genes a jusante, tais como MMP-2 /-9 resultando num aumento da migração de células de cancro /invasão e metástase do tumor [11-12]. Embora as evidências coletadas na próstata, câncer de pulmão e cholangiocarcinoma atestada uma estreita associação entre COX-2 /PGE
2 e /STAT3 vias de sinalização ativadas JAK2 [13-15], tal correlação e sua importância na CRC ainda precisam ser elucidadas . O nosso estudo investigou o mecanismo do efeito inibitório de berberin em CRC invasão e metástase, e revelou um papel significativo de JAK2 /STAT3 e COX-2 /PGE
2 sinalização nestes processos.
Materiais e métodos
cultura de células e reagentes
O câncer colorretal humano células SW620 e LoVo foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA, EUA). células SW620 foram cultivadas em L-15 de células de média e LoVo em meio F12K suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 g /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, a 37 ° C, 5% de CO
2, e alta umidade. Berberina foi adquirida a Aldrich-Sigma (St. Louis, MO, EUA), ADZ1480, um inibidor de JAK2, a partir Selleck (Houston, TX, EUA). Para
In vitro
estudos, Berberina foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e congelado em alíquotas a -80 ° C. Para
In vivo
experiências, Berberina foi suspenso em água, suplementado com 0,5% de carboximetilcelulose de sódio (CMC-Na) e armazenadas a 4 ° C. Além disso, DMSO e CMC-Na foram usadas como controlo de veículo no todo o nosso estudo. Os anticorpos contra a COX-2, P-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9, β-actina, e a anti-IgG de coelho-HRP de cabra, anti-IgG de ratinho-HRP de cabra foram adquiridos de Sinalização celular (Beverly, MA, EUA).
os casos clínicos
amostras e carcinoma colorectal Humanos da correspondência não-tumores amostras de tecido do cólon foram coletados no momento da ressecção cirúrgica no Hospital Shuguang, Xangai Universidade de Medicina tradicional chinesa. Toda pesquisa envolvendo seres humanos foram aprovados pelo Comitê de Shuguang Hospital, Universidade Shanghai de Medicina Tradicional Chinesa de Ética, e todas as investigações clínicas foram realizados de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Todos os pacientes fornecidos “consentimento informado por escrito” para participar neste estudo.
ensaios de viabilidade celular
células CRC Humano (5 × 10
3) foram semeadas em placa de 96 poços em 100 meios de cultura ul, depois da fixação, foram tratados com berberin em dosagens de 0, 5, 10, 20, 40 e 80 uM. Aos 24, 48, 72 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi medida utilizando CCK-8 kit (Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, CCK-8 reagente foi adicionado em células e incubou-se durante 4 horas, a absorvância (DO) foi quantificada por 490 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm. A viabilidade celular = (ODN-OD
0) /(ODC-OD
0) × 100%, OD
0:. branco, OCD, controle sem tratamento, ODN, berberin tratada
mouse modelo de xenotransplante
Homem BALB /C camundongos nus, idade de 4-6 meses, pesava 18 ± 2 g, foram adquiridos da SLAC Lab animal Co., Ltd (Xangai, China, licence no. SCXK 2012-0002) , e mantidos em condições sem agentes patogénicos para os estudos. Todo o trabalho dos animais foram realizados de acordo com o uso e cuidados Comitê Institucional animal da Universidade de Shanghai de Medicina Tradicional Chinesa, e toda a pesquisa foram aprovados pelo Shanghai Comissão Animal Care Medical Experimental e de acordo com a provisão e Recomendação Geral da Administração chineses Animais Experimentais Legislação. Tal como descrito anteriormente [16], as células de CRC (1 × 10
6, em 0,2 mL de PBS) foram injectadas subcutaneamente para os flancos de ratinhos nus para iniciar o crescimento do tumor. Quando os tumores atingem um tamanho médio de 100 mm
3, os ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (6 ratinhos por grupo): Grupo 1 ratos: controlo (CMC-Na); os grupos 2, 3, 4: berberin tratadas por gavage oral a 50, 100, 200 mg /kg /d, respectivamente; grupo 5: injectados intraperitonealmente com 5-FU, 50 mg /kg /2d. O peso corporal dos animais e os dois diâmetros perpendiculares (a e b) foram registrados a cada 2 dias e o volume do tumor (TV) foi estimada como: TV = ab
2/2. Os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas de tratamento e os tumores foram excisados e pesados. A taxa de inibição de tumor foi calculada como: (1-peso médio do tumor de ratos tratados /peso médio do tumor de ratinhos de controlo) x 100%. Enquanto isso, o sangue foi colhido para análise de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST), creatinina (CT), urea nitrogen (ONU), utilizando o kit ELISA (Bogoo, Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante.
modelo de ratinho CRC metástase pulmonar
metástases pulmonares experimentais de CRC foram induzidos por injecções de uma suspensão de células isoladas de células de CRC (1 × 10
6 em 0,2 mL de PBS) na veia lateral da cauda de nua ratos, os quais foram distribuídos aleatoriamente por 5 grupos de tratamento, tal como descrito nos estudos de xenoenxerto [17]. Os ratos foram sacrificados após 4 semanas de tratamento, os órgãos de pulmão foram excisados, fixados por formalina e embebidos em parafina, para posterior análise.
Histologia e imuno-histoquímica (IHQ)
Os órgãos e tumor foram removidas, fixadas com formalina, embebidos com parafina e seccionados [18]. O IHC de COX-2 e P-STAT3 foi realizada nas secções 5-um utilizando anticorpos de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). As imagens foram analisadas e quantificadas para o valor total de densidade óptica (IOD) para a positividade IHC por Image Pro-plus 6.0 Software.
Ensaios
migração e invasão celular
A 24 poços transpoço placa (tamanho de poro de 8 mm, Corning, NY, EUA) foi utilizado para medir a capacidade migratória e invasiva de cada linha celular, como descrito anteriormente [19]. As células BF foram tratados por berberin durante 48 horas antes de serem tratadas com tripsina e semeadas para dentro da câmara Transwell superior (2,5 x 10
4) em 1% de meio de cultura FBS, com a câmara inferior contém meios 600 ul com 15% de FBS e 10 ug /ml de fibronectina. Vinte e quatro horas mais tarde, as células migradas foram fixadas pelo álcool a 95%, coradas por coloração com violeta de cristal, analisados por microscópio (Ti-E, Nikon, Tokyo, Japão). Para o ensaio de invasão, 100 ul de matrigel diluída (100 ug /ml, BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) foi primeiramente adicionado até ao fundo da câmara de Transwell, o seguinte procedimento foi o mesmo como a análise de migração, excepto para as células invasoras serem analisados após 48 horas.
análise Western blot
a lise celular, extracção da proteína e as análises de mancha ocidental foram realizados como previamente descrito [20]. As amostras de proteína (20 ug) foram sujeitas a electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio a 10%, transferidas para uma membrana de polyvinylidenedifluoride. As membranas foram bloqueadas em 5% de tampão de leite em pó sem gordura (10 mmol /L de Tris, pH 7,5, 100 mmol /l de NaCl, 0,1% de Tween 20), antes de serem incubados com anticorpos primários e secundários posteriores, e auto fotografado. Os dados obtidos das experiências de Western blot foram analisados pela Bio-Rad Quantity One 1D software de análise (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).
Luciferase Reporter Assay
Usando o nosso protocolo estabelecido [ ,,,0],21], pGL3-basic-COX-2 promotor e um vector de controlo pRL-SV40 foram transfectados em células de CRC. Vinte e quatro horas após a transfecção, várias doses de berberin foram adicionados sobre as células durante mais 48 horas. Em seguida, as medições de pirilampo e
Renilla
actividades de luciferase em lisados celulares foram realizadas utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, EUA). Os dados foram apresentados como a razão entre a actividade de luciferase do pirilampo para
Renilla
actividade da luciferase em cada amostra realizada em triplicado ± DP.
ELISA
Depois de ser tratada com várias concentrações de berberin durante 48 horas, as células de CRC foram re-semeadas em placas de 24 poços (5 x 10
4 em 0,5 ml de meio de cultura). Quarenta e oito horas mais tarde, os meios condicionados foram colhidos, centrifugados (3000 rpm durante 10 min), e medido para PGE
2 a concentração, utilizando um kit de ELISA (Bogoo, Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante.
Over-expressão e knockdown de células COX-2 gene
CRC foram transfectadas com o os pIRES2 controle de vetor usando Lipofectamine 2000 reagente (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), após pIRES2-COX-2 ou o instruções do fabricante, e os que sobre-expressam de forma estável a COX-2 ou de células de controlo do vector foi seleccionado com neomicina (G418, 1 mg /ml). Para shRNA silenciamento de genes mediada por células CRC foram Lipofectamine 2000 transfectadas por plasmídeos Pfu-GW-ARNi contendo sequências de siRNA específicos de COX-2: 1: 5-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3, 2: a sequência de encriptação 5-GCAGATGAAATACCAGTCTTT-3, ou: as células transfectadas 5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3, e foram seleccionados com neomicina. A eficiência de silenciamento de genes foi determinada por quantitativa PCR em tempo real e Western blot.
extracção de ARN e a análise quantitativa em tempo real
O ARN total foi extraído utilizando Trizol (Takara Bio Inc., Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando PrimeScriptTM RT-PCR kit (Takara Bio Inc., Dalian, China). As seguintes sequências de iniciadores foram utilizados para amplificação por PCR: a COX-2 humana para a frente: 5 ‘GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3′, e reverso: 5’-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3 ‘; a sonda TaqMan: 5’-FAM-TGGCAGGGTTGCTGGTGGTAG GA-3-TAMRA -3 ‘(Shine Gene, Xangai, China); GAPDH para a frente: 5’-CCACTCCTCCACCTTTGA C-3 ‘, e reverso: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′; sonda TaqMan: 5’-FAM-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3 (Shine Gene, Xangai, China) ‘. PCR em tempo real foi realizada nos Applied Biosystems 7300 Sistema usando Premix Ex Taq (Takara Bio Inc, Dalian, China).
A análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS (versão 18) software, os dados foram apresentados como médias com desvio padrão (SD), ea comparação estatística foi realizada utilizando o teste t de Student, one-way análise de variância, teste de Mann-Whitney ou teste de Kruskal-Wallis.
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultado
1.Berberin inibiu o crescimento celular e migração /invasão do CRC in vitro e in vivo
o primeiro testado o efeito inibitório de berberin em tumores de xenoenxerto estabelecidos de linhas celulares de CRC humanos SW260 e LoVo em ratinhos. Como mostrado na Fig 1A e 1B, berberin induziu uma taxa de inibição de tumor de 25,83% e 30,66% em tumores LoVo e SW620, respectivamente. Além disso, os ratinhos tratados berberin não alteraram o peso corporal e as funções hepáticas e renais mantiveram-se normais (Fig S1 e S1 Tabela), sugerindo que não houve toxicidade do composto na concentração testada. A seguir, demonstrou que berberin reprimido
In vitro
crescimento de células destas duas linhas celulares de CRC, com uma IC50 de 54,41 uM para SW620 e 78,66 uM para LoVo, às 48 h pós-tratamento (Figura 1C). Nós indicou ainda que berberin diminuiu as metástases do pulmão de células de CRC em um modelo de rato induzida injecção na veia da cauda, de um modo dependente da dosagem do fármaco (Figura 1D).
In vitro
transpo� estudos confirmaram que berberin, em concentrações de droga de 10, 20 e 40 mM, pode efetivamente comprometida a capacidade das células CRC para migrar e invadir (Fig 1E).
A. Berberin inibe o crescimento do tumor de xenoenxerto de CRC. Subcutaneamente tumores implantados de linha celular SW620 CRC e LoVo foram tratados com o controlo, 5-FU, e 3 doses de berberin durante 28 dias. Os volumes de tumor de diferentes grupos de ratinhos foram registados e apresentados. tumores B. xenoenxertos excisadas dos ratinhos tratados com drogas e duração indicados no A. C. Berberin diminui a viabilidade celular CRC
in vitro
. células SW620 e LoVo foram tratados com concentrações variáveis de berberin para 24, 48 e 72 h. O valor médio ± SE a partir de 5 repetições foi mostrado. D. Berberin diminui a metástase do pulmão de células de CRC em ratinhos. Os ratinhos portadores SW620 e LoVo metástases do pulmão de células foram tratados com dosagens berberin variável indicada. Painel superior: representante HE manchado seções do pulmão do rato com CRC metástase celular focos. painel inferior: número de CRC pulmão focos de metástase no controle e berberin camundongos tratados. E. Berberin inibe a migração e invasão de células CRC. migração celular e os resultados do ensaio de invasão de linhagens celulares de CRC SW620 e LoVo, tratada com berberin ou controle. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. Os bares e barras de erro representam as médias ± SE, e
P
-valor foi calculado usando um independente
t
-teste. **
P Art 0,01, controle vs tratados;
##
P Art 0,01, controle vs tratados
2.Berberin regulada para baixo os níveis de COX-2 e PGE2 expressão em células CRC
.
a seguir, investigou os mecanismos subjacentes para a inibição da migração de células CRC /invasão de berberin. Começamos pela constatação de que em células SW620 e LoVo, os níveis de COX-2 e PGE expressão
2 foram atenuadas por berberin de uma forma dependente da dose de droga (Figura 2A, 2B e 2D). Estes dados foi confirmada por um ensaio de repórter de luciferase do promotor de COX-2, o que indica que a actividade da COX-2 do promotor foi reprimido por berberin (Fig 2C). Para apoiar a nossa hipótese, realizamos COX-2 sobre-expressão e experimentos knockout, mostrando que o aumento dos níveis de proteína COX-2 up-assinalada a capacidade migratória /invasiva das células CRC enquanto o knockout gene COX-2 pelo construto shRNA atingido a efeito oposto (figura 2E). Além disso, a adição da PGE
2, o produto a jusante catalisada da COX-2, também aumentado o grau de migração e invasão de células de CRC (Figura 2F).
. e B. Os extractos de células SW620 e LoVo tratados com berberin nas concentrações indicadas, durante 48 horas foram analisadas para a COX-2. C. células SW620 e LoVo foram transfectadas com um constructo repórter de COX-2 e um TK
Renilla
construir (para a transfecção de controlo /carga) durante 24 h, tratadas com as doses indicadas de berberin por mais 48 h, e foram lisadas e submetidas a vaga-lume e
Renilla
medições da actividade da luciferase. As barras mostram indução de dobra em relação ao controlo sem tratamento (média ± SE). D. Os níveis de PGE
2 em células SW620 e LoVo tratados por doses indicadas de berberin durante 48 h foram medidos por ELISA (média ± SE). migração celular e invasão de CRC são afectadas por: E. A sobre-expressão ou knockdown do gene de COX-2; F. PGE
2. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. Os bares e barras de erro representam as médias ± SE, e
P
-valor foi calculado usando um independente
t
-teste. **
P Art 0,01, controle de migração vs tratados;
##
P
. 0,01, controle de invasão vs tratados
3.Berberin inibida JAK /sinalização STAT3 em células CRC
A fim de delinear o mecanismo do seu efeito inibitório sobre a migração de células CRC /invasão, nós interrogado a influência de berberin em vias de sinalização celular. Encontramos berberin diminuiu significativamente os níveis de fosforilação das proteínas JAK e STAT3 (pJAK2 e pSTAT3) em células CRC (Fig 3A). Em comparação, utilizando um inibidor de JAK2 (AZD1480), que semelhante revogada a pJAK2 e pSTAT3, resultando em níveis de migração /invasão celular humedecidas de células de CRC (Fig 3B e 3C).
. Os extractos de células SW620 e LoVo tratados com berberin nas concentrações indicadas, durante 48 horas foram analisados por pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 e beta-actina (como controlo de carga). B. JAK blocos AZD1480 inibidor JAK2 sinalização /STAT3. Os extractos de células SW620 e LoVo tratados com AZD1480 (5 uM) foram analisados para a expressão de pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 e beta-actina. C. AZD1480 inibe a migração e invasão de células CRC. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. Os bares e barras de erro representam as médias ± SE, e
P
-valor foi calculado usando um independente
t
-teste. **
P Art 0,01, controle de migração vs tratados;
##
P Art 0,01, controle de invasão vs tratados
níveis
4.Elevated expressão de COX-2 e pSTAT3 correlacionados com a invasão tumoral e metástases em humanos primário. análise CRC
imuno-histoquímica (IHQ) de amostras de CRC primárias ilustrado que os níveis de COX-2 e de expressão pSTAT3 foram significativamente mais elevados em tecidos de CRC em comparação com os tecidos normais adjacentes (Fig 4A e quadro 1). Como pode ser visto nas Tabelas 2 e 3, há uma forte correlação entre a presença de COX-2 ou pSTAT3 com o grau de diferenciação, grau de invasão e metástase, e estadiamento de Duke. De COX-2 e positividade pSTAT3 no IHC não se correlacionou com a idade do paciente, sexo e tamanho do tumor. A sobrevivência foi significativamente maior em pacientes que expressam COX-2 de baixa contra os COX-2-altos, mas nenhuma associação entre os níveis pSTAT3 e tempo de sobrevida do paciente (Fig 4B).
A. Exemplos de amostras de tumor coradas CRC para a COX-2 e pSTAT3 são mostrados. B. Os níveis de expressão de COX-2 e pSTAT3 não se correlacionam com a sobrevivência dos pacientes com CCR.
5.COX-2 /PGE2 regulamentado JAK2 /sinalização STAT3 CRC em células
próxima sobre-expressa a proteína da COX-2 em células LoVo e SW620 CRC através de transfecção, e encontrou níveis aumentados de pJAK2 e pSTAT3, e diminuição dos níveis de expressão de MMP-2, MMP-9, que são transcricionalmente regulados a jusante de sinalização de JAK2 /STAT3; Por outro lado, a construção de shRNA mediada por COX-2 gene knockdown teve o efeito oposto (Figura 5A e 5B). A adição da PGE
2 ligando para as células de CRC activado significativamente a sinalização JAK2 /STAT3 e a expressão de MMP-2 /-9 (Fig 5C e 5D). Com base nestes dados, a hipótese de que activado COX-2 /PGE
2 eixos aumentada JAK2 /via de sinalização STAT3, regulado para cima os níveis de MMP-2 /-9 expressão, levando ao aumento do potencial metastático de células CRC.
A. e B. Os extractos de células SW620 e LoVo transfectadas com COX-2 sobre-expressão ou construto shRNA foram analisados para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 e beta-actina. C. e D. Os extractos de células SW620 e LoVo tratados com PGE
2 por períodos indicados foram analisados para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 e beta-actina.
6.Berberin inibiu a invasão de células CRC e metástases através reprimindo a COX-2 /PGE2 /JAK2 /STAT3 sinalização eixo
Com os nossos dados mostrando berberin inibição da COX-2 /
2 expressão e JAK2 PGE /STAT3 sinalização, bem como de COX-2 /PGE
2 regulação via JAK2 /STAT3, a hipótese de que o mecanismo de efeito inibidor do berberin em CRC invasividade e o potencial metastático foi sua influência negativa sobre o eixo de sinalização de COX-2 /PGE
2-JAK2 /STAT3. Para testar esta teoria da nossa, nós tratamos as células CRC usando AZD1480 inibidor JAK2, e encontrou a expressão de MMP-2 /-9 foi “desatrelada” da COX-2 e PGE
2, ou seja, nem sobre-expressão de COX-2 nem adição de ligando PGE
2 pode aumentar os níveis de proteína de MMP-2 /-9 (Figura 6A e 6C). Por outro lado, com AZD1480 bloqueando a sinalização de JAK2 /STAT3, berberin não teve efeito sobre a MMP-2 /-9 níveis de expressão (Fig 6B e 6D).
. e B. Os extractos de células SW620 tratados com AZD1480 durante 2 h, transfectadas com COX-2 sobre-expressão de um construto para 24 h, tratada com berberin (40 uM) durante 48 h, foram analisadas para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP -2, MMP-9 e beta-actina. C. e D. Os extractos de células SW620 tratados com AZD1480, durante 2 h, tratada com berberin (40 uM) ou PGE
2 (5 uM), durante 48 h, foram analisadas para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP- 2, MMP-9 e beta-actina.
Discussão
capacidade de invasão e metástase, características dos tumores malignos, são as principais razões pelas quais as terapias contra o câncer contra CRC falhar. Portanto, encontrar novos medicamentos anti-tumorais de metas de metástase parece ser plausível para aumentar a taxa de sobrevivência de pacientes com CCR. Sendo cada vez mais utilizado na clínica, medicina tradicional chinesa (MTC) tem sido provado ser uma importante opção terapêutica alternativa para CRC, além de cirurgia e quimioterapia [22]. Com o acúmulo de evidências demonstrando que TCM é muito eficaz o tratamento de cancros, é cada vez mais importante e necessário estudar os mecanismos subjacentes às actividades anti-tumorais de TCM e seus componentes. Berberin, um alcalóide isolado a partir de TCM erva coptis chinensis, tem sido demonstrado que têm eficácia anti-tumoral no tratamento de CRC, do fígado, da mama, próstata e pulmão [23-27]. Em nosso estudo, nós apresentamos
in vitro
e
in vivo
dados que delineiam berberin induzida inibição do CRC crescimento celular, a migração /invasão e metástase, além disso, nós exploramos o mecanismo sublinhado.
estudos anteriores demonstraram que a COX-2, o enzima que limita a taxa de catalisar a conversão de ácido araquidónico para PGE
2, sobre-expressa em tecidos tumorais de várias malignidades, incluindo CRC. À medida que o efector a jusante de COX-2, PGE
2 promove a angiogénese de tumores, crescimento celular, migração /invasão e evasão imune. Portanto, PGE
2 continua a ser um factor-chave de desenvolvimento de neoplasias. A evidência epidemiológica tem sugerido que a longo prazo, tendo rotina de inibidor de COX-2, tais como NSAID (drogas anti-inflamatórias não esteróides) pode diminuir de 50% de incidência CRC [28-29]. Os nossos resultados mostraram que berberin inibiu os níveis de COX-2 e PGE expressão
2 em células de CRC, de acordo com os dados de Singh et al encontrado nas células de melanoma tratadas com berberin [30]. Assim, vai berberin ser tão eficaz quanto os AINE para reduzir CRC incidência? Este será um tema muito interessante para os estudos futuros, especialmente sobre o mecanismo pelo qual berberin obras em células CRC.
via de sinalização JAK2 /STAT3 é persistentemente ativada no pulmão, câncer de mama e no CRC [31-32 ]. Sob condições fisiológicas normais, JAK2 /STAT3 via de sinalização é transitoriamente activadas. Os factores de crescimento e citoquinas se ligam aos seus receptores na superfície da célula para activar JAK2, que por sua vez fosforila o resíduo tirosina 705 (Tyr705) da proteína STAT3 para a activar (pSTAT3). pSTAT3 forma homodímeros ou heterodiers, transloca-se para o núcleo, transactiva os níveis de ciclina D1, VEGF e MMP-2 /-9 genes [33-36], cujos produtos de proteína estão envolvidas na regulação do crescimento de células de tumor, apoptose, angiogénese expressão e metástases. Já foi demonstrado pelos estudos em câncer de nasofaringe e da doença diabética que berberin bloqueados JAK2 /STAT3 sinalização [37-38], e nossa de dados atual foi acrescentado um outro pedaço de evidência afirmar o efeito inibitório do berberin em JAK2 activação /STAT3, bem como a expressão dos seus genes alvo a jusante de MMP-2 /-9 em CRC -. esta é provavelmente parte do mecanismo biológico do efeito anti-tumor de berberin
Uma vez que os nossos dados proposto que berberin impactado tanto a COX-2 /PGE
2 e JAK2 /STAT3 vias de sinalização, investigamos ainda mais os níveis de proteína de COX-2 e pSTAT3 em amostras de CRC primários, e interrogado qualquer associação e ligação regulamentar entre estes 2 jogadores importantes. Consistente com a observação de uma estreita associação de outros pesquisadores entre COX-2 /PGE
2 e JAK2 /STAT3 percursos na próstata, câncer de pulmão e cholangiocarcinoma [13-15] sinalização, descobrimos, em tecidos humanos CRC, valor superior activada de COX-2 e pSTAT3, que significativamente correlacionados uns com os outros, e em geral, ambos foram associadas a um maior grau de capacidade de invasão de tumores e metástases. Próximo nossos estudos in vitro descobriu que a COX-2 /PGE
2 regulamentada migração celular /processo de invasão CRC através de sinalização JAK2 /STAT3, e sobre-expressão de COX-2 e PGE
2 reverteu a ação inibitória da berberin em JAK2 /STAT3 activação ea mobilidade da célula cancerosa. Além disso, revelou que AZD1480, um bloqueador de JAK2 /inibidor da activação da STAT3 [39-40], desengatada da COX-2 /PGE
2 e berberin de afectar os níveis de MMP-2 /-9 expressão. Estas descobertas de nos iluminou a COX-2 /PGE
2-JAK2 /STAT3 cascata de sinalização como o alvo da droga para berberin para mediar o seu efeito sobre CRC capacidade de invasão e metástase. Em resumo, berberin reduz a COX-2 /PGE
2 níveis, por sua vez arrefece activação JAK2 /STAT3, levando a uma diminuição da expressão de genes alvo a jusante de MMP-2 /-9, resultando em menor capacidade de invasão e metástase em CRC (Figura 7 ). Este relatório de nós tem prestado um importante conjunto de dados pré-clínicos para o futuro ampla utilização de berberin no tratamento CRC.
PGE2, o principal produto catalisado de COX-2 a partir do ácido araquidônico, pode ligar-se ao EP receptor na membrana da célula, activando deste modo a JAK2, seguido pela phorphorylating da STAT3 no local a Tyr705. A activada de p-STAT3 forma o homo-ou heterodimeros, que transloca para o núcleo, ligam-se ao gene alvo a jusante de MMP-2, MMP-9, e acelerar a progressão do tumor. A inibição da via da COX-2 /PGE 2 mediada JAK2 /STAT3 sinalização, poderia ser um dos mecanismos do efeito inibitório de berberin na invasão e metástase em cancro colo-rectal.
Informação Apoiando
S1 FIG. Berberin inibe o crescimento CRC celular e metástase.
O peso corporal dos camundongos, controle
vs
berberin grupo. O tratamento com berberin tem pouco efeito sobre o peso corporal do rato. Não houve diferença significativa entre os animais tratados com berberin na dose de 200 mg /kg por dia e os animais do grupo controle. Os dados apresentados como médias ± DP. amostras de fígado B. representativos de ratos de controlo e berberin foram processados e coloração pela HE. Os resultados apresentados são representativos de três experimentos independentes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123478.s001
(TIF)
S1 Table. Efeito da berberin sobre as funções hepáticas e renais (significa ± SD)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123478.s002
(DOC)