Abstract

Ácido hialurônico ligado 1 (HAPLN1), que foi mostrado para ser altamente expressa em mesotelioma pleural maligno (MPM) , foi detectado no soro utilizando um método de imprinting superfície electroquímica. Em primeiro lugar, o método de detecção foi optimizado utilizando albumina de soro bovino (BSA) como um modelo de proteína para imitar as condições óptimas requeridas para imprimir a HAPLN1 proteína de peso molecular semelhante. BSA foi impressa no eletrodo de ouro com grupos terminais hidroxilo tióis alcanos, que formaram uma monocamada auto-montada (SAM) em torno de BSA. O analito (BSA) foi então removido por lavagem e a sua marca (cavidade vazia com memória de forma) foi usada para a detecção de BSA numa solução, utilizando o método de potencial de circuito aberto electroquímica, nomeadamente potenciometria. Os factores considerados para optimizar as condições incluem o tempo de incubação, concentração da proteína, limite de detecção e o tamanho de eléctrodo. Matriz de dessorção a laser assistida por ionização-tempo de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) foi usada para confirmar a selectividade de impressões. Com os parâmetros de controle imprinting obtidos, HAPLN1 foi impresso em duplicado e a detecção de HAPLN1 cravado foi realizado com sucesso no soro

Citation:. Mathur A, Blais S, Goparaju CMV, Neubert T, Passo de H, Levon K ( 2013) Desenvolvimento de um biossensor para a detecção de mesotelioma pleural Cancer Biomarcador Usando Imprinting Surface. PLoS ONE 8 (3): e57681. doi: 10.1371 /journal.pone.0057681

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de maio de 2012; Aceito: 28 de janeiro de 2013; Publicação: 13 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mathur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado por uma bolsa de exército (W911NF-09-1-0499) para a detecção de patógenos Potentiomeric. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma possível cura do câncer seria mais provável se a doença pode ser detectada cedo para otimizar os procedimentos terapêuticos. Extra-celular da matriz (ECM) tem a sua importância não só para o suporte físico de diversas células mas também em interacções célula-célula, a sinalização celular e processos de reparação celular. Portanto proteínas da MEC apresentam-se um alvo de monitorização potencial refletindo as mudanças em curso. Se as mudanças ocorrem devido à presença de uma doença, como o cancro, a detecção destas alterações seria uma divulgação presuntivo de cancro antes de quaisquer sintomas aparecerem. Como um exemplo, a enzima heparanase [1], uma endo-beta-glucoronidase, é uma enzima multifuncional que influencia as principais etapas do desenvolvimento de numerosos tipos de cancros, tais como gástrica [2], não-pequenas do pulmão [3], esofágica [4] , cabeça e pescoço [5], de mama [6] e pâncreas [7] cancros como exemplos.

cliva heparanase sulfato enzimaticamente heparina e com serinoproteinases e metaloproteinases desempenha um papel crucial na remodelação da matriz extracelular associada tanto com in situ tumores de crescimento e a invasão relacionados com as metástases de células cancerosas. A forma enzimaticamente inativa de heparanase foi mostrada para afectar a sinalização celular, e aumentando, assim, o crescimento do cancro, com a regulação positiva da expressão de vários genes de [8]. biomarcadores comerciais para monitorar a atividade induzida mesotelioma-amianto são mesothelin e mesothelin solúvel peptídeo relacionado (SMRP). Osteopontina (OPN) e CA125 foram igualmente relacionados com a actividade heparanase ligada ao câncer, além de ácido hialurônico, TRA e ferritina. Os eventos ECM remodelação pode, certamente, ser um alvo para diagnóstico dos estágios iniciais de invasão do cancro [9], bem como alvos para tratamentos anti-cancerosos. O ácido hialurónico (hialuronano, hialuronato, HA) é uma linear, muito elevado peso molecular de glicosaminoglicano, é uma das proteínas mais abundantes ECM. HA tem sido demonstrado que existe em níveis elevados no colo-rectal, do epitélio do ovário, e cancros da mama [10] – [12] e também inibição do crescimento do tumor foi evidenciado quando motivos de ligação a HA foram afectados [13]. HA superexpressão é muito dependente do CD44, assim que a regulação do crescimento do cancro de bexiga, invasão e angiogênese foi comprovada a ocorrer através do CD44 por HA sintase-1 expressão [14]. À medida que a expressão de HA parece ser claramente elevada no aparecimento de cancro, não é surpreendente que Ivanova et al mostraram que também proteína HAPLN1, o que ajuda a ligar proteoglicanos a um núcleo de HA, tem sido mostrado para ser elevados em células de cancro.

mesotelioma pleural maligno é uma neoplasia rara causada pela exposição ao amianto, que tem um mau prognóstico. Cartilagem HAPLN1 proteína ligação está sendo estudada como um biomarcador candidato, encontrou a ser sobre-expressos em fase de mesotelioma 1 juntamente com uma osteopontina biomarcador de câncer altamente expresso (OPN1) localizado no mesmo conjunto de genes [15]. Os imunoensaios são comumente usados ​​para a detecção de biomarcadores de cancro, como eles apresentam uma selectividade superior, mas pode ser demorado e caro. As características biológicas de marcadores como heparanase enfatizar a importância de conceber métodos eficazes de custo, permitindo a detecção precoce de tais biomarcadores no soro e tecidos, tanto para fins de diagnóstico e prognóstico, bem como para monitorar tratamentos de câncer.

Também detecção de concentração muito baixa de tais biomarcadores com testes ELISA é difícil. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas tecnologias, que são rápida e muito sensível para detectar baixas concentrações de biomarcadores. O diagnóstico precoce irá proporcionar mais tempo para o tratamento de câncer, o que é crucial para salvar uma vida. polímeros imprimidos moleculares estão sendo consideradas como um substituto adequado para sistemas baseados em anticorpos como biossensores, devido a melhor estabilidade e capacidade de reutilização das superfícies bio-reconhecimento [16]. Biossensores são compostos por dois componentes, elemento receptor de bio e de componentes de transdução de sinal. Uma superfície de bio-receptor feita com polímeros imprimidos moleculares seria duas ordens de magnitude mais barata, então anticorpos. Como o preço do polímero tiol alcano hidroxilado custaria cerca de US $ 0,2-0,6 mg

-1 em comparação com anticorpos, que variam de acordo com o alvo. Os anticorpos gerados para o direcionamento de proteínas HAPLN1 humano custaria cerca de US $ 900 a $ 1000 mg

-1. Mesmo baixa densidade de tais anticorpos em cartuchos de imunoafinidade têm preço mais elevado do que os polímeros impressos moleculares, custando entre US $ 10 a US $ 100 mg-1. Preço elevado de anticorpos HAPLN1 aumentar o custo dos kits HAPLN1 ELISA disponível no mercado a US $ 10 /teste. Considerando um chip sensor de ouro revestidas impressas (1cm x 1 cm) custaria cerca de US $ 1,2 /teste e pode ser usado repetidamente por vários ensaios ao contrário de anticorpos, que não podem ser reutilizados.

Em nosso estudo pretendemos desenvolver uma ferramenta para a detecção precoce de biomarcadores. moléculas de proteína alvo co-adsorvido sobre a superfície do eléctrodo de ouro com os tióis e que em conjunto formam uma monocamada bem embalado. A remoção das moléculas de proteína a partir das cavidades forma de cunho SAM e o grupo de cabeça hidroxilo funcional dos tióis proporcionar especificidade para a cavidade. A complementaridade em tamanho, forma e hidrofobi fornece afinidade para a mesma molécula, que foi impressa.

O eléctrodo estampado é então usado para testar o modelo em tampão usando potenciometria. Como a molécula de proteína carregada em tampão de liga-se às cavidades que altera o potencial do eléctrodo de detecção. Síntese da superfície do cunho é simples e não requer qualquer tecnologia dispendiosa para a preparação. É uma antiga, mas promissora tecnologia, que tem vindo a desenvolver com os desafios que tem enfrentado no passado.

Em 1930, um cientista soviético MV Polyakov demonstrado que o gel de sílica preparados na presença de um aditivo solvente mostrou preferido de ligação com o mesmo solvente [17]. Linus Pauling e Frank Dickey publicado em 1949 que a sílica mostra especificidade para corantes impressas na superfície [18]. Grande avanço na impressão molecular teve lugar em 1972, quando Gunter Wulff preparados polímeros orgânicos imprimidos moleculares utilizando a abordagem de ligação covalente, que pode diferenciar entre enantiômeros de ácido glyceric [19]. Wulff et al. utilizou uma abordagem, que se tornou o mais famoso para estudos de impressão molecular durante os anos 70 até que uma outra teoria foi introduzido em 1981 por Mosbach e colegas de trabalho. Criaram impressões moleculares baseados na ligação com o modelo [20] não-covalente. Era a simplicidade desta abordagem que provocou uma explosão em 90 com polímeros de impressão molecular. Temos utilizado abordagem de ligação não covalente introduzido por Wulff et al. para imprimir o biomarcador HAPLN1 utilizando grupos funcionais hidroxilo em tióis que formam interacções fracas com a proteína e um molde bem justa em torno do mesmo. Isto proporciona uma maior especificidade para a cavidade, fazendo assim a remoção do HAPLN1 da cavidade mais fácil. As condições imprint foram otimizados para potenciometria utilizando BSA (66 kDa) proteína (Figura 1), devido à sua semelhança em tamanho, com biomarcador de câncer HAPLN1 (65 kDa). Foi testada a especificidade das cavidades gravadas, utilizando MALDI-TOF, através da realização de testes para mostrar que uma proteína relativamente menor mioglobina (17 kDa) não se liga a BSA impressões.

(A-C) Inserção da proteínas dentro do SAM. (D) lavagem. (E-F) Ligação da proteína de analito de BSA, a hemoglobina como um controlo não específico.

Materiais e Métodos

Princípio de detecção potenciométrica

Em nossa tecnologia, temos utilizado potenciometria para a detecção de HAPLN1 alvo analito. Um potenciómetro mede a diferença de potencial entre um eléctrodo de referência (Ag /AgCl) e o eléctrodo de trabalho. Analito se liga à superfície de bioreceptor sobre o eléctrodo de trabalho numa solução tampão, que resulte numa alteração na diferença de potencial entre os dois eléctrodos. Esta alteração é então medido pelo sistema. íons biomacromolecular menores não resultar em uma tensão que se mantenham em equilíbrio com o eletrólito.

Os fortes resultados de resposta de tensão da macroions ligação via extensa ligação de hidrogênio macromolecular em torno da marca no eletrodo de trabalho (chip de silício revestido de ouro ), um grande HAPLN1 recombinante biomacromolecule, 65 proteína tamanho kDa reúne com tióis, que formam uma organizada, densa SAM ao redor do analito. Os tióis têm a tendência para a auto montar sobre a superfície de ouro, como o grupo enxofre na extremidade da cauda de tióis forma uma ligação enxofre-metal com ouro [21]. SAM organizado é um importante “selante” contra interferrents e pinholes para corrente parasita. A macromolécula é então lavada a partir da superfície, que resulta na formação de cavidades. O eléctrodo estampado actua como o elemento bioreceptor do biossensor. Assim eléctrodo estampado funciona com mesmos princípios que os eléctrodos selectivos de iões comercial, que têm um ionóforo específico para reconhecer o ião analito. Mostramos que potenciometria pode ser utilizado com uma boa sensibilidade e selectividade para detectar o cancro biomarcador alvo na solução tampão e em soro cravado. A resposta electroquímica obtido com esta técnica é devido à mudança potencial após a ligação da proteína modelo. A alteração no potencial é medido em relação a uma referência eléctrodo de Ag /AgCl [22], [23].

Os materiais necessários para a medição electroquímica

Albumina de Soro Bovino (BSA) a partir de sangue bovino ( Mw = 66,3 K), mioglobina do músculo esquelético equina (Mw = 17,6 K), 11-mercapto-1-undecanol (97%) (tiol), etanol absoluto, o metanol, o isopropanol e foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). HAPLN1 Humana (64,68 kDa) ORF de comprimento completo (AAH57808, 1-354 a.a.) proteína recombinante com GST-tag no N-terminal foi adquirido de Abnova Corporation (noz, CA), e armazenados a -80 ° C. Todas as proteínas e os produtos químicos foram usados ​​tal como recebidos. Dois tipos de eléctrodos foram utilizados como o eléctrodo de detecção: o ouro (50 nm) por pulverização catódica bolacha de silício revestido (1 centímetro x 2 cm) e eléctrodos de ouro (2 mm

2) comprado de Basi (West Lafayette, IN). As medições potenciométricas foram efectuadas em 10 ml de PBS 1X em frasco de 20 ml de vidro, equipado com um agitador magnético. Quando diluídas para uma concentração 1X, solução salina tamponada com fosfato 10 X adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) produzir uma concentração de tampão fosfato de 0,01 M e uma concentração de cloreto de sódio 0,154 M com pH 7,4. O sistema de dois eléctrodos consistiu de um Ag /AgCl como o eléctrodo de referência e de silício revestido eléctrodo de ouro chip de ouro, como o eléctrodo de trabalho. Os potenciais do eletrodo de trabalho contra o eletrodo de referência foram medidos com um potenciômetro Accumet AR15 comprado de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) e EMF 16 canais Electrochemical interface comprado de Lawson Labs (Malverin, PA):

Materiais necessários para MALDI TOF

placa alvo ouro foi comprado de Bruker Daltonics (Billerica, MA). solução de TA (0,1% de ácido trifluoroacético /acetonitrilo, 02:01, vol:vol) e ácido sinapinico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) para a preparação da matriz para imobilizar a proteína ligada à superfície da placa do alvo . Bruker Autoflex MALDI-TOF Bruker Daltonics comprado de (Billerica, MA) foi usada para determinar a especificidade da proteína de ligação aos respectivos marcas na superfície da placa do alvo. Tape resistente a produtos químicos PTFE moldável (Teflon) foi comprado de CS Hyde empresa (Lake Villa, IL). azoto gasoso foi fornecido pela Presto-O-Vendas e Serviços (LIC, NY).

Fabrication BSA Sensor

Os chips de silício foram limpos por ultra-sons na água deionizada, metanol e isopropanol. Os chips de silício foram deixadas a secar durante a noite e, em seguida, revestidos com ouro descarga eléctrica. Os chips de ouro revestidas foram então lavadas com água desionizada e seca com azoto gasoso puro. Do mesmo modo os eléctrodos de ouro foram limpos com 0,1 e 0,05 micra de alumina e em seguida sonicada com água de s ionizada para remover quaisquer partículas de alumina ligados. Uma vez que as proteínas desnaturadas de solução não-aquosa e tióis apresentam baixa solubilidade em proteínas de soluções aquosas foram dissolvidos em água de s ionizada enquanto que tióis foram dissolvidos em etanol absoluto. Comprometer soluções mistas de 19:01 e 18:02 (etanol water:) com concentração de tiol final de 0,1 mM e 0,2 mM foram preparadas em recipientes de vidro limpos e comparativamente estudado para conseguir uma boa solubilidade de tióis e evitar a precipitação de proteínas. O eléctrodo de ouro revestido é então mergulhado dentro da solução misturada para formar o auto-montados monocamada de proteína e tiol. O espaço de cabeça do recipiente é cheio com gás inerte de azoto e coberta com parafilme. O tempo de incubação do chip na solução mista foi variada para uma melhor superfície impressa. O chip de ouro é então completamente enxaguados com água desionizada para remover a proteína ligada. Também diferentes concentrações de proteína de 30 ug /ml, 10 ng /mL e 1 ng /ml foram usadas para formar as marcas e os resultados de ligação foram comparados. Os eletrodos preparados foram então usados ​​para verificar a resposta de ligação com concentrações variáveis ​​de BSA em solução tampão.

Preparação de impressões sobre MALDI-TOF-alvo placa

Com excepção da superfície contendo 384 poços, no resto do placa alvo de ouro (8 cmx12.5 cm) foi coberto com fita adesiva Teflon não reactivo. A superfície alvo de ouro foi limpa com etanol e água de s ionizada. fluxo controlado de gás inerte de azoto foi usada para secar a superfície do alvo. A solução A foi preparado com uma mistura 19:01 de 16,17 mg de mioglobina (i.e. 1,7? M) em 540 ml de água desionizada e 0,22 g de 11-mercapto-1-undecanol (i.e. 2 mM) em 540 ml de etanol absoluto. Esta solução foi formada para criar impressões de mioglobina em uma metade da placa alvo de ouro. A solução B continha 19:01 razão de mistura (etanol water:) de 16,17 g de albumina de soro bovino (i.e. 0,432 uM) dissolvido em 540 ml de água desionizada e 0,22 g de 11 mercapto1-undecanol (i.e. 2 mM) em 540 ml de etanol absoluto. Esta solução foi preparada para criar impressões BSA na outra metade da placa alvo de ouro. Metade da placa Au foi imerso em solução A durante 12 horas a co-absorção da proteína e tiol, após o que foi seco com azoto gasoso puro. Da mesma forma a outra metade da placa alvo de ouro é imerso na solução B durante 12 horas e secou-se com gás azoto puro. As concentrações de proteína e tiol foram mantidos mesmo que o utilizado para a impressão em eletrodo de ouro por potenciometria. As cavidades que são complementares com as proteínas de modelo foram criados na monocamada, removendo as moléculas de proteínas por meio de lavagem repetida com água de s ionizada. Solução C foi preparado com uma mistura equimolar de 1 ng /ml de BSA e mioglobina em 540 ml de água desionizada. Esta solução foi formado para ligação a dois tipos diferentes de cavidades na superfície do ouro placa proteína alvo ensaio. Wells sobre a superfície do alvo foram divididos em quatro quadrantes (Figura 2) e poços em linha I (1-24) a P (1-24) foram mergulhadas durante 10-15 minutos em solução C. A superfície foi enxaguada cuidadosamente e deixada seque com gás nitrogênio. Em seguida, 1 ml de matriz de SA é adicionado ao alvo e deixa-se secar. Bem na linha A (1-24) a H (1-24) foram usadas para estudos de controle. A placa-alvo foi então utilizado para análise MALDI- TOF.

Colunas (1-12) para mioglobina e colunas (13-24) para sites de imprinting BSA. Linhas I a P foram imersas na solução de analito C contendo ambas as proteínas de analitos.

Fabrication HAPLN1 Sensor

proteína HAPLN1 é mais expresso na maioria dos casos desta doença e, portanto, ser considerado como um potencial biomarcador para detecção de câncer. Em um recipiente de vidro limpo de 20 ug de HAPLN1 (64,68 kDa) da proteína foi dissolvida em 10 ml de água deionizada (ou seja, 0,03 mM) e 4 mg de 11-mercapto-1-undecanol foi dissolvido em 10 ml de etanol (isto é, 0,1 mM) . A solução mista é formada, através da dissolução de ambas as soluções na proporção de 19:01 (water: etanol), de tal modo que a concentração final de tiol na solução torna-se 0,1 mM. Três eléctrodos de ouro A, B e C foram imersas na solução durante 12 horas e, em seguida, os eléctrodos foram enxaguadas cuidadosamente com água desionizada para remover a proteína ligada à superfície.

resposta do sensor para HAPLN1 cravado amostras de soro

HAPLN1-impressos também foram usadas para uma resposta potenciométrico para o biomarcador cancro cravado no soro. A solução estoque 100 nM em 1:08 de soro e tampão proporção foi preparada por diluição de 100 uL de soro humano, com 650 ul de solução de 1X PBS e com 250 ul da solução comercial de 102 ug /mL HAPLN1 (ou seja, um total de 25,5 ug de HAPLN1). A concentração HAPLN1 na solução de estoque foi, em seguida, 6,5 ug /ml (100 nM). 10 ul de solução foi utilizada para a titulação em 10 ml de tampão PBS, e a mais elevada concentração de proteína é de 10

-9 M. padrões restantes foram preparadas através da manutenção da mesma taxa de diluição (1:08) do soro em tampão mas analito concentração foi reduzida dez vezes com seriais de 6,5 ug /ml (100 nm) solução cravado padrão.

Resultados

Otimização de parâmetros para BSA Sensor

As moléculas de proteína BSA foram imprimido com o grupo hidroxi terminal tióis alcano sobre a superfície de ouro. Como tióis formar uma monocamada organizada com o tempo sobre a superfície de ouro que é crucial para estudar o tempo de incubação do chip de silício revestido de ouro no interior da solução de proteína-tiol para alcançar impressões estáveis. Nesta experiência a concentração de BSA na solução de mistura foi de 30 ug /ml e a Figura 3a mostra o efeito do tempo de incubação sobre a estabilidade das impressões. Três eléctrodos foram preparados por manter as fichas para dentro da solução durante 2, 6 e 12 horas. A solução mista neste experimento tinha uma proporção de 18:02 (etanol water:) com 0,2 11 mM mercapto1-undecanol. Todas as medições foram feitas em tampão fosfato salino (pH 7,4) numa solução de 10 ml. Um aumento logarítmico potencial foi observada com o aumento da concentração de BSA em tampão de apenas com o eléctrodo, a qual foi incubada durante mais de 12 horas. Os resultados indicaram que as impressões mais estáveis ​​foram formadas quando o chip foram mantidos na solução durante 12 horas. As experiências foram em seguida conduzidos para optimizar as condições para realizar impressões proteína estável. A resposta potenciométrica foi estudado variando a concentração de BSA impressa no eléctrodo para formar as cavidades. Nesta experiência dois eléctrodos foram preparados utilizando duas concentrações diferentes de 30 ug /mL e 1 ng /ml de BSA em soluções mistas de proteína e tiol.

. Efeito do tempo de imersão de 2 horas (___), 6 horas (…) e 12 horas (—). B. Efeito da concentração de proteína de 30 ug /mL (▴, x) e 2 ng /mL (◊, △). C. Efeito da concentração de proteína de 10 ng /mL (□) e 1 ng /mL (▴) e controlos no SAM única (x, ◊).

Estas soluções misturadas foram preparadas com um 19 :1 rácio (etanol water:) possuindo uma concentração final de 11 mM-mercapto-1-undecanol 0,1. O tempo de incubação foi mantida a 12 horas, tal como isto foi mostrado para suportar a formação das impressões mais estáveis.

Tal como mostrado na Figura 3b, um aumento logarítmico da mudança no potencial tem lugar com o aumento da concentração de proteínas . A resposta de eléctrodo preparado com 30 ug /ml de concentração de proteína de impressão é muito mais elevado em comparação com o outro eléctrodo preparado com uma menor concentração de proteína de impressão. Isto demonstra que o número de cavidades formadas na superfície aumenta à medida que mais proteína é adsorvida na superfície. O ponto isoeléctrico de uma proteína é definido como o pH ao qual a carga líquida na superfície de uma proteína é zero. Uma vez que as moléculas de BSA tem um ponto isoeléctrico de 4,7 que têm uma carga líquida negativa de uma solução tampão com pH 7,4. Como moléculas carregadas mais ligar-se a superfície do eléctrodo que leva a uma alteração drástica do potencial. Os resultados foram repetidos com sucesso para confirmação. Figura 3b, também demonstram um potencial mais elevado mudança com uma razão de 19:01 (etanol water:) quando comparada com uma proporção de 18:02 a partir da Figura 3a. Este resultado indica que mais cavidades são formadas como a concentração de tiol na solução é reduzida. Para downscale o processo de preparar e eléctrodos mais sensíveis, baixas concentrações de imprinting de 1 ng /ml e 10 ng /ml foram seleccionados com base nos dados experimentais anteriores. As experiências foram conduzidas com eléctrodo de ouro de área de superfície muito menor (2 mm

2). O eléctrodo de trabalho foi preparada numa proporção 19:01 (etanol water:) com uma concentração final de 11 mM-mercapto-1-undecanol 0,1. Como mostrado na Figura 3c mostra o eléctrodo uma boa resposta a ligação de 15-20 mV, com concentrações muito baixas de BSA quando comparado com uma resposta de ligação baixa de 2-4 mV observada com eléctrodos de controlo preparadas que têm apenas o SAM na sua superfície.

Validação usando MALDI-TOF

Nesta experiência 1 ul de matriz foi colocada no topo de cada cavidade da placa de Maldi impressa e deixou-se secar. software de análise de placa Maldi com um algoritmo para coletar dados com uma velocidade de varrimento de 2000 a laser shot /s para cada local em um poço foi selecionado. Uma vez que metade dos 384 poços na placa foram impressas MALDI BSA e a outra metade com a proteína mioglobina, aleatoriamente cinco poços foram seleccionados a partir de poços de mioglobina impressa e semelhante cinco foram seleccionados a partir da BSA imprimido poços, para ensaiar a proteína ligada às cavidades. Como mostrado na Figura 4, o símbolo de três caracteres m /z no eixo dos x é usado em espectroscopia de massa para denotar a quantidade adimensional, formada pela divisão da massa de um ião em unidades de massa atómica unificados pela sua número de carga.

A. Mioglobina poços impressos e B. BSA impressa poços.

Y-axis mostrar a intensidade do sinal, mas em vez de usar contagens por segundo (cps), o procedimento comum é relacionar a intensidade a abundância relativa com um uso, se um padrão interno. Tal como mostrado na Figura 4a mioglobina, que tem um peso molecular de 17 kDa foi observada para ser ligado a poços única mioglobina impressos como um pico aparece a 17 kDa para cada poço e não mioglobina foi observado nas cavidades de BSA, como mostrado na Figura 4b. BSA foi observado para ser de muito grande peso molecular nestas condições ionização.

HAPLN1 Sensor

Após os estudos BSA para otimizar as condições exigidas para imprimir biomacromolecules, HAPLN1 impressa eletrodos foram fabricados para baixa concentração detecção do biomarcador. Três eléctrodos impressos foram estudadas para verificar a resposta após a detecção. Duas experiências independentes mostram uma drástica 25 mV mudança no potencial em concentrações muito baixas HAPLN1 de 10

-12 M como o HAPLN1 foi titulada numa solução tampão (Figura 5A). Como um controlo, BSA também foi titulado sob as mesmas condições que mostram um muito baixo potencial de resposta a concentrações elevadas de BSA. O experimento foi então realizado em soro com uma concentração HAPLN1 cravado. Figura 5b mostra que o eletrodo impresso tem uma deriva alta no soro, mas mostra uma notável mudança potencial em 10

-9 concentração M de HAPLN1 no soro.

A. HAPLN1 ligação a impressões HAPLN1 (dois experimentos independentes), a resposta de controle BSA para impressões HAPNL1. solução de soro analito B. cravado HAPLN1 para HAPLN1 impressões.

Discussão

A detecção de biomarcadores de câncer com um baixo custo e fácil de usar método é importante para o monitoramento contínuo de múltipla marcadores. HAPLN1 é um exemplo de importância crescente no campo, como, por exemplo, Nelson et al [24] Recentemente, completou uma análise de transcriptoma em vascular arterial (BEC) e células endoteliais linfáticas (LEC) e a análise de agrupamento mostrou a expressão do gene claramente diferenciado para CEBs e LECs . HAPLN1 foi segunda maior gene expresso em tumores como LECs e ter a vantagem de estas moléculas aumentar o potencial metastático, a expressão elevada HAPLN1 observado podem conduzir a novos tratamentos terapêuticos para a metástase do cancro para os nódulos linfáticos. tecnologia de impressão molecular bidimensional tem sido utilizado com sucesso para imprimir e detectar pequenas moléculas [25] – [29], mas como péptidos macromoléculas imprinting permaneceu uma tarefa difícil. macromoléculas biológicas, como proteínas têm alto peso molecular e, portanto, seu grande tamanho dificulta a adsorção sobre a superfície e a remoção da marca ready-made [30] – [33]

O grande número de sítios de ligação e funcional. grupos na superfície da proteína pode aumentar os problemas relacionados com a ligação não específica de proteínas com impressão molecular (MIP) que conduzem a fraca selectividade [34]. Por isso, é importante para optimizar todos os parâmetros e as condições requeridas para manter a estabilidade de grandes estruturas tais durante todo o processo de impressão. Foram selecionados proteína BSA (65 kDa) para o processo de otimização devido ao seu tamanho semelhante ao biomarcador de câncer candidato HAPLN1. Na Figura 3A e a Figura 3b impressões mais estáveis ​​são formados com tempo de incubação de 12 horas e um aumento da resposta quando ocorre mais moléculas alvo são impressas em 30 ug /ml em comparação com 1 ng /ml de concentração. Condições semelhantes foram usados ​​por Wang et al [35] para mostrar como impressões formadas com proteínas de diferentes tamanhos são altamente específicos ao respectivo eletrodo de marca usando a detecção potenciométrica. técnica MALDI TOF tem sido utilizado como um novo método no nosso trabalho para confirmar a especificidade do sítio cunho, ficou também demonstrado por detecção potenciométrica. A Figura 4 mostra mioglobina proteínas ligam-se especificamente às suas cavidades impressas e não às cavidades de BSA. Acreditamos que, desde proteínas mioglobina são muito menores em tamanho (17 kDa) em comparação com BSA, mioglobina não caberia no molde BSA e, portanto, não ligando para maiores cavidades BSA. Os resultados de especificidade de BSA não pôde ser confirmada com MALDI-TOF, devido à baixa sensibilidade do equipamento com as proteínas de elevado peso molecular. Temos usado a detecção potenciométrica para otimização de cavidades com BSA e para detecção de HAPLN1 em tampão e no soro cravado. Os resultados na Figura 5A mostram 25 mV resposta de HAPLN1 para HAPLN1 eléctrodo impresso em comparação com baixa resposta de proteína em tampão de BSA e foram obtidos resultados semelhantes em soro cravado. Embora nos mostram a resposta potenciométrica obtido é específico para a proteína impressas e é um resultado da proteína de ligação, uma compreensão clara não existe actualmente para o sinal electroquímico (mudança de potencial) induzida por adsorção de proteínas. Vários mecanismos têm sido sugeridos incluindo por Thompson et al. Ele propõe fatores, o que pode contribuir para uma mudança na função de trabalho [36] de ouro quando a proteína se liga a superfície de ouro e, assim, mostrar como a mudança na função de trabalho resulta em mudança de potencial de superfície. Em experimentos futuros pretendemos ainda verificar especificidade de proteína HAPLN1 ligação a cavidades imprint por tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) e também para obter dados clínicos para validação.

Conclusões

Os nossos dados demonstram a uso de SAM formando alcanotióis hidroxilados solúveis em água para imprimir biomacromolecules. BSA foi mostrado ser uma proteína modelo eficaz para optimizar os parâmetros de controlo, como a concentração de proteína, a proporção dos componentes moleculares, e o tempo de incubação do chip para downscale o processo de impressão para a detecção de concentrações baixas de proteínas. Impressão molecular biossensor com base foi construída com sucesso a reconhecer maligno pleural HAPLN1 biomarcador cancro do mesotelioma e demonstrou alta sensibilidade, detectando baixa concentração de biomarcador em solução de soro /tampão. O sensor mostrou um limite de detecção de concentrações picomolares com um tempo de resposta de 2-5 minutos. O baixo custo do sensor baseia-se na ausência de anticorpos monoclonais dispendiosos, moléculas adicionais de rotulagem e na simplicidade da medição de potencial de circuito aberto, com um potenciómetro, que também é muito fácil de utilizar (similar ao medidor de pH).