Abstract

receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores da tirosina quinase (TKI), tais como gefitinib, ter sido provada a inibir eficientemente a proliferação de um subconjunto dos cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Infelizmente, a maioria do NSCLC expressando EGFR de tipo selvagem é principalmente resistente ao tratamento de EGFR-TKI. Aqui, mostra-se que a proliferação das linhas de células resistentes a gefitinib NSCLC H460 e A549 é reduzida pela molécula pequena SecinH3 que atenua indirectamente a activação do EGFR por inibição do cytohesins, uma classe de activadores recentemente descoberta EGFR citoplasmáticos. SecinH3 e gefitinib apresentou um efeito sinérgico antiproliferativa, que se correlacionou com uma profunda inibição da ativação da Akt e expressão survivin. Tratar os ratos portadores de xenoenxertos de H460 com SecinH3 mostrou o efeito antiproliferativo e pró-apoptótica de SecinH3 in vivo. Nossos dados sugerem que a segmentação do EGFR indiretamente inibindo seus ativadores citoplasmáticos, os cytohesins, tem o potencial de melhorar o tratamento dos cancros do pulmão resistentes principalmente EGFR-TKI

Citation:. Bill A, Schmitz A, König K, Heukamp LC, Hannam JS, Famulok M (2012) Anti-proliferativa Efeito da Cytohesin Inibição na resistentes a gefitinib células tumorais. PLoS ONE 7 (7): e41179. doi: 10.1371 /journal.pone.0041179

editor: Anna Maria Delprato, BioScience Project, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de maio de 2012; Aceito: 18 de junho de 2012; Publicação: 18 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Bill et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft ea Collaborative Reseach Centro 645 (SFB 645). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Schmitz e Dr. Famulok são co-proprietários de uma patente na pequena molécula cytohesin inibidores intitulado “O uso de inibidores cytohesin para a longevidade quimicamente indução” (WO2008058995, US 20100048594). Dr. Famulok é co-inventor de um pedido de patente intitulado “inibidores Cytohesin” (Pedido de Patente Europeia EP2286808 (WO2006053903). Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

introdução

a introdução do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), inibidores da tirosina cinase (TKI) para a terapia do cancro do pulmão de células não-pequenas (NSCLC) tendo mutações de activação do EGFR mudou o paradigma de tratamento a partir de uma quimioterápico a uma abordagem específica. Infelizmente, apenas 20 por cento dos adenocarcinomas do urso de pulmão mutações ativadoras do EGFR e são sensíveis a terapia alvo-EGFR. Além disso, os pacientes sob terapia de TKI alvo EGFR desenvolver resistência secundária durante a terapia. mutações no jogo EGFR um papel decisivo na resposta pelo tumor à terapia alvo EGFR. a activação de mutações, em particular nos exões 19 e 21, são preditivos para uma resposta inicial favorável ao EGFR-TKI [1], [2], [3]. Pelo contrário, a mutação da assim chamada posição gatekeeper na bolsa de ligação de ATP do domínio de cinase de EGFR, ou seja, a substituição da treonina 790 por metionina, torna as células resistentes a [4], [5], [6]. A mutação gatekeeper é a causa mais comum para o desenvolvimento de resistência de tumores responsivos secundário. A maioria dos CPNPC expressar EGFR de tipo selvagem e são, por conseguinte, principalmente resistente ao EGFR-TKI [7]. Cerca de 25% destes CPNPC suportar uma forma mutada do proto-oncogene Ras, Kras G61H ou G12V, e a presença desta mutação é um indicador quase inconfundível de resistência à terapia alvo EGFR [8]. No entanto, estudos in vitro utilizando siRNA mediada knock-down do EGFR indicam que a proliferação de células NSCLC expressando EGFR de tipo selvagem e o rolamento mutado KRAS ainda está dependente até certo ponto sobre o EGFR [9], [10], [11 ], [12] o que sugere que as células resistentes a EGFR-TKI não são totalmente independentes do EGFR e que, por conseguinte, visando a EGFR por outros que não inibidores da tirosina quinase pode levar a uma proliferação reduzida mesmo em células resistentes EGFR-TKI meios. Aqui, mostramos que o tratamento com linhas celulares de NSCLC SecinH3 expressando EGFR de tipo selvagem atenua a activação do EGFR e de sinalização, reduz a proliferação das células in vitro e in vivo, e os torna sensível à gefitinib EGFR-TKI. Como SecinH3 inibe activadores EGFR citoplasmática da família cytohesin [13] nossos dados sugerem que a segmentação do EGFR indirectamente pela inibição dos seus activadores podem representar uma abordagem promissora para o desenvolvimento de terapias alvo EGFR para a maioria dos CPNPC que não expressam o EGFR mutante.

Materiais e Métodos

Materiais

SecinH3, Secin16 e XH1009 foram sintetizados como descrito [14], [15], gefitinib foi comprado de Biaffin. H460 e A549 foram células de ATCC e cultivadas em RPMI 1640 (PAA) com soro fetal de vitelo a 10% (Lonza). A identidade das linhas celulares foi verificada no final do período experimental baseado na genotipagem de microssatélites por a linha celular ECACC Identidade Verificação de serviço. Os perfis STR combinados os perfis das linhas de células como depositado na ATCC e bancos de dados ECACC STR.

Ensaio de Proliferação

3 × 10

3 células por 96well foram semeadas em uma clara, placa de fundo plano 96well (TPP). Após 24 horas, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de inibidores ou os solvente (concentração final de DMSO 0,4%) em meio RPMI contendo 50 ng /mL de EGF ou de IGF-1 (Peprotech), respectivamente. O meio foi mudado diariamente durante 3 dias e a proliferação celular foi analisada com um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Promega) como descrito no protocolo do fabricante utilizando um Varioscan leitor de microplacas (Thermo Scientific). Todos os ensaios foram realizados pelo menos em triplicado. Para o cálculo da taxa de proliferação relativo, a absorvância média nas células tratadas com DMSO foi definido como 1.

Ensaio de Formação de Colónias

de crescimento ensaios clonogénicos foram realizados como descrito [16]. Resumidamente, 3000 células /poço foram semeadas em placas de seis poços, deixadas a aderir durante a noite e tratadas com as concentrações indicadas de composto ou DMSO durante 72 h. As células foram desalojadas, novamente plaqueadas em placas de seis poços e cultivadas durante 7 a 10 dias em meio de crescimento normal. As colónias foram coradas com 0,1% de Coomassie, ácido acético a 10%, metanol a 30% em PBS e analisadas utilizando um Odyssey de infravermelho próximo do scanner (LI-COR Biosciences).

Tumor de Xenoenxerto

Todos os animais procedimentos estavam de acordo com as leis alemãs de proteção aos animais e foram aprovados pela comissão de protecção animal local e as autoridades locais (Bezirksregierung Köln, Alemanha). Os tumores foram gerados por s. c. injecções de 5 × 10

6 H460 células em ratinhos nu /nu atimicos machos. Depois de ratos estabelecimento do tumor foram randomizados em dois grupos, controle (veículo) e ratos tratados com SecinH3. Os ratos foram tratados diariamente por i. p. injecções (100 ul SecinH3 2,5 mM em 50% /DMSO a uma solução de glucose a 50% isotónico ou apenas veículo). O volume do tumor foi medido diariamente e calculada usando a fórmula:

D

L

= diâmetro maior;

D

S

= diâmetro menor.

O ensaio TUNEL foi realizada de acordo com o manual do fabricante (ApopTag Além disso Peroxidase In Situ Apoptosis Kit, Merck Millipore).

clivado expressão da caspase 3 foi determinado por imuno-histoquímica fixadas com formalina e embebidos em parafina secções de tecido utilizando um anticorpo específico para a caspase 3 clivada (1:750, Cell Signaling Technology) após recuperação de antigénios, a pH 6, como descrito [17].

a, estruturas de os inibidores utilizados neste estudo. B – C, proliferação de A549 (B) e células H460 (C) foi determinado pelo ensaio de MTT na presença dos inibidores indicados. ***, P . 0,001 em relação às células tratadas com DMSO

Imunotransferência

As células foram privadas de soro durante a noite, na presença do inibidor indicado ou DMSO (concentração final de DMSO de 0,4 %). A médio e inibidores foram atualizados 1 h antes da estimulação. A estimulação foi de 5 min com 50 ng /mL de EGF ou de IGF-1, respectivamente. As células foram lisadas em tampão de lise (20 mM de Tris-Cl, pH NaCl a 7,5 /150 mM /EDTA 1 mM /EGTA 1 mM /2,5 pirofosfato de sódio mM /vanadato de sódio /1 mM mM β-glicerofosfato 1/1% de Triton X-100 ) suplementado com inibidor de protease misturar-HP (Serva). quantidades normalizadas de proteína foram separadas por 6% de SDS-PAGE e transferidos para nitrocelulose. Foram utilizados os seguintes anticorpos: pAkt (Thr473) (Cell Signaling Technology), pEGFR (Tyr1086) (Epitomics), pIRS1 (Tyr612) (Life Technologies), EGFR, survivin, p27 (SantaCruz Biotechnology), Hsc70 (Enzo Life Sciences). A detecção foi realizada em um scanner Odyssey utilizando anticorpos secundários marcados DyLight800 (Thermo Scientific)

-. B, proliferação de células H460 na presença de gefitinib ou SecinH3 sozinho ou na sua combinação foi determinada por ensaio de MTT (brometo de A) ou pelo ensaio de formação de colónias (B). Em A, os números de dar o valor relativo de proliferação com células não tratadas colocadas como 1. A proliferação assumindo um efeito aditivo de SecinH3 e gefitinib (esperado) é comparada com o valor encontrado nos experimentos (observada). Os valores observados abaixo dos valores esperados indicam sinergismo

A -. C, H460 células foram tratadas durante a noite com 1 gefitinib mM, 15 mM SecinH3 ou sua combinação. Uma, a expressão de p27Kip e survivina foi analisado por western blot. B, C, A avaliação estatística dos dados de Western blot mostrados em A. ** em B indica P 0,01 em relação aos controlos tratados com DMSO, bem como de células tratadas com gefitinib. *** Em C indica p 0,001 em relação aos controlos tratados com DMSO. n = 3.

A – D, as células privadas de soro foram estimuladas com EGF durante 5 min e sondados por western blot para a activação das proteínas indicadas. A, Western blot representativo. B – D, A avaliação estatística da fosforilação do EGFR (B), IRS1 (C), e Akt (D) em células H460 estimulada por EGF em presença de gefitinib, SecinH3, ou uma combinação de ambos os inhbitors. P indica a forma fosforilada, isto é activado, da proteína. Os sinais foram normalizados para o controlo de carga Hsc70. As barras de erro dão o padrão de erro. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p 0,001 em relação a células EGF-tratada com excepção das comparações que são especificados por colchetes

Estatísticas

os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM). As análises estatísticas foram realizadas com Prism (GraphPad Software) aplicar-se ANOVA com pós-teste de Tukey para os experimentos in vitro eo teste t para os xenotransplantes. As diferenças de médias foram consideradas significativas ao nível de significância de 0,05.

Resultados

Células NSCLC Expressando de tipo selvagem EGFR Responder a SecinH3

Embora as células NSCLC expressando EGFR de tipo selvagem não respondem a concentrações clinicamente relevantes de EGFR-TKI sua proliferação parece depender, até certo ponto sobre a sinalização do EGFR, como tem sido demonstrado por experiências de EGFR knockdown [9], [10], [11], [12]. Portanto, foi perguntado se a proliferação da linha de células A549 NSCLC, que expressa EGFR de tipo selvagem e com o KRAS mutação activadora G12S foi afectada pelo tratamento das células com SecinH3 (Fig. 1A). SecinH3 é um inibidor cytohesin [14], [15] e não inibe a actividade da tirosina cinase do EGFR directamente [13]. Cytohesins têm sido conhecidos como factores de troca de nucleótidos de guanina para as proteínas G pequenas da família IRA [18], mas foram recentemente mostrado para contribuir para a activação de EGFR [17]. O mecanismo de activação de EGFR mediada por cytohesin, que é ainda desconhecido em detalhe, envolve a interacção directa de cytohesins com o EGFR, é IRA-independente, e pode ser inibida por SecinH3. Quando as células A549 foram tratadas com o inibidor ou SecinH3 cytohesin relacionada Secin16 [19], foi observada uma redução dependente da concentração na proliferação (Fig. 1B). Em comparação com as células PC9 altamente viciados-EGFR que expressam um EGFR tendo uma deleção do exão 19 [20], a proliferação das quais foi completamente inibida a 15 uM SecinH3 [17], a redução na proliferação era menos pronunciada em células A549 que é de acordo com o menor dependência das células A549 em EGFR sinalização. A inibição não foi observada em células tratadas com o composto de controlo XH1009 que está estruturalmente relacionado com SecinH3 mas não inibe cytohesins [14]. Gefitinib utilizado na concentração de 1 uM terapêutico apenas marginalmente inibiu a proliferação de células A549. A actividade do gefitinib utilizado foi verificada por meio de tratamento da linha de células sensíveis a gefitinib PC9 [20] em que 100 nM gefitinib inibiu a proliferação das células quase completamente (dados não mostrados). Para excluir que o efeito de SecinH3 foi restrita a células A549 As experiências foram repetidas em células H460, uma linha celular que expressa também NSCLC EGFR de tipo selvagem, mas um KRAS mutante diferente, a saber, G61H (Fig. 1C). Como nas células A549, 15 uM SecinH3 resultou em cerca de 50% de redução de proliferação. Este valor encaixa razoavelmente bem para a concentração inibitória de metade do máximo de SecinH3 para a actividade catalítica de cytohesins purificada, que é de 10-12 uM [14].

SecinH3 e Gefitinib são sinérgicos

Tendo mostrado que SecinH3 atenuou a proliferação de células NSCLC resistentes a gefitinib foi perguntado se o tratamento com SecinH3 pode tornar as células que respondem a tratamento com gefitinib e, assim, actuam sinergicamente com este EGFR-TKI. Portanto, a proliferação de células H460 foi determinada por um ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT), na presença de 1 uM de gefitinib e concentrações crescentes de SecinH3 (Fig . 2A). Para cada combinação de inibição esperada para Bliss independência dos dois compostos foi calculada pelo método do produto fraccionada [21] e comparado com o grau de inibição observada [22]. Para todas as três combinações testadas, foi encontrado um efeito sinérgico de gefitinib e SecinH3. O ensaio de MTT determina indirectamente a proliferação medindo a actividade metabólica da população de células. Para obter uma prova adicional e mais directa para a inibição da proliferação de um ensaio de formação de colónias foi realizada (Fig. 2B). Também neste ensaio, a combinação de SecinH3 com gefitinib foi mais eficiente do que cada inibidor sozinho.

A, H460 células foram tratadas durante a noite e com 0,5 uM AG1024, 15 uM SecinH3 ou sua combinação privadas de soro. Após estimulação com IGF-1 durante 5 minutos o estado de fosforilação das proteínas indicadas foi analisado por western blot. Os gráficos resumem 3 experiências, as barras de erro dão o padrão de erro. *, P 0,05, **, P 0,01, ***, p 0,001 em relação às células tratadas com IGF1 excepto para estas comparações os quais são especificados por suportes. B, proliferação de células H460 na presença dos inibidores indicados foi determinado por ensaio MTT. Os números de dar o valor relativo de proliferação com células não tratadas colocadas como 1. A proliferação se um efeito aditivo do SecinH3 e gefitinib é assumida (esperado) é comparada com o valor encontrado nos experimentos (observada). Os valores observados abaixo dos valores esperados indicam sinergismo. ***, P . 0,001

A inibição do EGFR em células de sinalização dependentes de EGFR é conhecido por resultar na paragem do ciclo celular e para levar à indução de apoptose. Tal como marcadores substitutos para a paragem do ciclo celular e apoptose, determinou-se a expressão do inibidor p27Kip1 progressão do ciclo celular e a survivina inibidor de apoptose (Fig. 3A). O tratamento das células com SecinH3 ou gefitinib resultou numa diminuição da survivina (Fig. 3B) e um aumento na p27Kip1 (Fig. 3C), respectivamente. Este efeito foi mais pronunciado em células tratadas com ambos os inibidores.

A expressão de ambas as proteínas, p27Kip1 e survivina, é regulada por sinalização de Akt a fosforilação de Akt foram analisados ​​em resposta a estimulação por EGF de células (Fig. 4A). Considerando que a fosforilação induzida pelo EGF do EGFR e do substrato do receptor da insulina proteína adaptadora 1 (IRS1) foi drasticamente reduzida por gefitinib (Fig. 4B, C) a fosforilação de Akt não foi (Fig. 4D), indicando que a sinalização de Akt estava inalterada em células H460 tratadas com gefitinib. Em contraste, SecinH3 teve um efeito inibidor sobre a menos EGFR e fosforilação IRS1 mas mostrou uma inibição substancial sobre a activação de Akt. Por conseguinte, a combinação de SecinH3 e gefitinib resultou na quase completa inibição da fosforilação de todas as três proteínas. Estes dados indicam que o efeito antiproliferativo de tratamento /gefitinib SecinH3 combinada é devido à inibição eficaz do EGFR -. Do eixo de sinalização de Akt

Os ratinhos portadores de xenoenxertos subcutâneos H460 foram tratados com SecinH3 por injecções intraperitoneais diárias. Um, o volume do tumor foi determinada todos os dias. No dia 9, o experimento teve de ser interrompido porque o volume do tumor nos animais controle ultrapassou 1 cm

3. B, a distribuição dos volumes do tumor no dia 9. C – D, o grau de apoptose foi analisada em secções de tumores no dia 9. C, o número de núcleos fragmentados foi determinada por coloração TUNEL. D, clivado, isto é activado, a caspase-3 foi detectada por imunohistoquímica. secções de tumor representativos são mostrados. 5 × e 40 × indicam a ampliação da objetiva. Para todos os gráficos, médias e erros padrão são mostradas (N = 14). *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p . 0.001

SecinH3 Reduz sinalização dependentes de IGF1R e proliferação

Além do EGFR, o factor de crescimento 1 do receptor de tipo insulina (IGF1R) é um regulador principal da activação de Akt e a diafonia entre IGF1R e EGFR ou membros da família de EGFR, tais como Her2 foi classificado como um mecanismo de resistência a drogas de segmentação de EGFR ou HER2 em várias tipos de câncer [16], [23], [24], [25], [26]. Como SecinH3 inibe a sinalização a jusante do receptor de insulina [15], [27], que partilha características chave com IGF1R sinalização testámos se o tratamento das células com H460 SecinH3 resultou na activação reduzida do IGF1R – via de sinalização de Akt (Fig. 5A). Em concordância com os resultados obtidos para o receptor de insulina, a autofosforilação do IGF1R não foi reduzida por tratamento SecinH3, mas aumentou. No entanto, a activação de Akt e IRS1 foi substancialmente reduzida. A inibição da activação de Akt não foi observado após tratamento com gefitinib. O aumento em fosforilação do IGF1R após tratamento com gefitinib e SecinH3 está de acordo com observações anteriores de que a inibição das EGFR resulta em activação aumentada do IGF1R, [16], [22], [25], [26]. Em seguida, pediu SecinH3 se reduziu a proliferação na presença de IGF-1 (Fig. 5B). De facto, a proliferação foi reduzida após tratamento SecinH3 e a redução foi sinérgica com o inibidor do IGF1R AG1024. A combinação de gefitinib e AG1024 também mostrou um efeito sinérgico antiproliferativa embora de forma menos pronunciada do que a combinação de SecinH3 e gefitinib.

SecinH3 Crescimento Retards de H460 xenoenxertos in vivo

Depois de ter mostrado que SecinH3 reduz a proliferação do tipo EGFR-wild células NSCLC in vitro foi perguntado se o crescimento do tumor seria inibido também in vivo. Portanto, os ratinhos nus portadores de xenoenxertos subcutâneos H460 foram tratados por injecções intraperitoneais diárias de SecinH3. O tratamento com o crescimento do tumor significativamente retardado SecinH3 (Fig. 6A). Quando os ratinhos foram sacrificados após 9 dias de tratamento significativamente mais pequenos tumores foram observados no grupo tratado com SecinH3, em comparação com o grupo tratado com solvente (Fig. 6B). Em secções histológicas dos tumores de TUNEL coloração revelou um aumento da taxa de apoptose nos animais tratados (Fig. 6c), que também se tornou evidente pelo caspase-3 coloração (fig. 6D). Em resumo, os nossos dados mostram que SecinH3 in vitro e in vivo reduz a proliferação de células NSCLC expressando EGFR de tipo selvagem.

Discussão

Neste relatório, nós mostramos que as células NSCLC exibindo resistência primária contra a gefitinib EGFR-TKI de responder ao tratamento com SecinH3, que inibe o EGFR indirectamente por segmentação seus activadores citoplasmáticos da família cytohesin. Este resultado inesperado pode aparecer porque a resistência contra a gefitinib pode ser interpretado como a independência de sinalização de EGFR. Esta é, no entanto, não é o caso. O tratamento com ARNsi específico-EGFR de diferentes linhas de células EGFR-TKI resistentes NSCLC expressando EGFR de tipo selvagem resultou numa proliferação reduzida das células [9], [10], [11], [12] o que indica que a resistência de EGFR-TKI e EGFR independência não são, pelo menos, sempre equivalentes. Por conseguinte, tem sido mostrado que o EGFR contribui para a sobrevivência de células cancerosas ser independente da sua actividade de cinase [28]. Estes dados indicam que o EGFR-quinase inibida ainda é capaz de activar as vias que estimulam a proliferação ou inibir a morte celular de sinalização. Em suporte desta hipótese é a observação de que a inibição do EGFR erlotinib induz por heterodimerização do EGFR com o IGF1R, o qual activa o IGF1R e a sua sinalização a jusante, incluindo cinases AKT [16]. Cytohesins foram mostrados para interagir directamente com o EGFR e, desse modo, influenciar a sua conformação [17]. Como uma conformação particular do EGFR, o dímero assimétrica, é um pré-requisito para a activação da quinase [29], a modulação de conformação de EGFR tem sido implicado na activação do EGFR por cytohesins, um processo que é inibido por SecinH3. Como o tratamento das células com H460 SecinH3 resultou num aumento da fosforilação do IGF1R uma função semelhante de cytohesins durante a activação do IGF1R por o EGFR pode ser excluída. Aparentemente, SecinH3 inibe a sinalização pela IGF1R activada por EGFR a jusante do receptor. Este resultado está em total acordo com as observações anteriores de que SecinH3 não afectam a activação do receptor de insulina, mas inibiu a sinalização a jusante do receptor ao nível do receptor de insulina proteína adaptador de substrato-1, resultando na activação de Akt reduzida [15], [27], [ ,,,0],30]. Assim, a actividade anti-proliferativa em células de SecinH3 NSCLC resistente EGFR-TKI pode ser explicado pelo seu efeito inibidor em ambas dupla, EGFR e do IGF1R de sinalização, que podem impedir as células de iludir a inibição do EGFR por um aumento da sinalização do IGF1R. Nós gostaríamos de salientar que os nossos dados não excluem a possibilidade de que o efeito anti-proliferativo sinérgica de SecinH3 com gefitinib pode resultar de SecinH3 afectar a sinalização por RTKs além do IGF1R. Em particular, a amplificação do receptor de factor de crescimento de hepatócitos de c-Met [31] e a presença da proteína de fusão EML4-Alk [32] ter sido relacionada com a resistência de EGFR-TKI. A ativação destes RTK por cytohesins tem, no entanto, ainda não foram investigados e, portanto, no momento, não sei se a sinalização por estes RTKs pode ser afetada por SecinH3.

activação melhorada do IGF1R tem sido reconhecido como um dos principais causa da resistência contra as terapias alvo-EGFR em células cancerosas de origem diferente. inibição Assim, em experiências in vitro mostraram combinada de IGF1R e actividade de EGFR para reduzir a proliferação de células de tumor sinergicamente [16], [23], [24], [25], [26]. Infelizmente, estes resultados não foram traduzidos em ensaios clínicos, onde, até agora, as terapias de combinação aplicação EGFR e IGF1R segmentação terapias falharam em mostrar melhorias significativas sobre a terapia única [33], [34]. As razões para estes resultados decepcionantes são atualmente desconhecida, mas pode estar no entendimento incompleto dos detalhes moleculares da interação entre EGFR e sinalização IGF1R que impede a selecção racional dos pacientes que podem se beneficiar de terapia combinada. Mutações que prever a resposta a terapia-alvo, assim como para o EGFR, não foram relatados para o IGF1R [35] e pode, portanto, não ser usado para seleccionar os pacientes. Num estudo clínico em busca de biomarcadores que predizem beneficiar de EGFR combinado /IGF1R inibição KRAS mutante foi identificado [36]. Em estudos in vitro mostraram, no entanto, dados contraditórios sobre o efeito anti-proliferativo de inibição combinada do EGFR e do IGF1R em células H460 KRAS mutado. Considerando que um estudo não encontrou sinergismo [25] outro estudo fez [16]. No nosso estudo, um sinergismo fraco de gefitinib e AG1024 enquanto que foi encontrado mais forte sinergismo foi encontrado para combinações de qualquer um destes compostos com SecinH3. Estas discrepâncias destacar a noção de que a inibição de alvos idênticos por diferentes inibidores ou estratégias de inibição podem conduzir a diferentes resultados biológicos. Assim, as abordagens que não dependem de inibição directa de EGFR e IGF1R actividades de quinase, mas têm como alvo estes receptores indirectamente através dos seus moléculas activadoras ou adaptador pode fornecer uma compreensão mais completa destas vias de sinalização e, assim, proporcionar alvos ainda não reconhecidos para novas abordagens terapêuticas.

Reconhecimentos

Agradecemos Y. Aschenbach-Paul, A. Florin e U. Rommerscheidt-Fuss para assistência técnica.