Abstract

Os biomarcadores são necessários para abordar overtreatment que ocorre para a maioria dos pacientes com câncer de próstata que não iria morrer da doença, mas recebem tratamento radical . Uma possível barreira à descoberta de biomarcadores que seja a natureza policlonal /multifocal de tumores da próstata, bem como do tipo de célula heterogeneidade entre as amostras do paciente. Tumor-adjacente estroma (microambiente do tumor) é menos afectado pela alteração genética e pode, portanto, produzir biomarcadores mais consistentes em resposta à agressividade do tumor. Para este fim, em comparação Affymetrix perfis de expressão gênica em estroma perto do tumor e identificou um conjunto de 115 conjuntos de sondas para a qual os níveis de expressão foram significativamente correlacionados com o tempo de colocação recaída. Também comparamos pacientes que quimicamente recaída logo após prostatectomia ( 1 ano) e pacientes que não recaída nos primeiros quatro anos após a prostatectomia. Foram identificados 131 diferencialmente expressos conjuntos de sondas de microarray entre estas duas categorias. 19 conjuntos de sonda (15 genes sobrepostos entre as duas listas de genes com

p Art 0,0001). Foi desenvolvido um classificador baseado em PAM por uma formação sobre amostras contendo estroma perto tumor: 9 amostras rápidas recaída do paciente e 9 amostras indolentes paciente. Em seguida, testamos o classificador em 47 amostras diferentes, contendo 90% ou mais do estroma. O classificador previu o status de risco de pacientes com uma precisão média de 87%. Este é o primeiro classificador de prognóstico baseado no microambiente do tumor geral. Estes resultados indicam que o microambiente do cancro da próstata apresenta alterações reprodutíveis úteis para prever os resultados para os pacientes

citação:. Jia Z, Rahmatpanah FB, Chen X, W Lernhardt, Wang Y, X-Q Xia, et ai. (2012) muda de expressão no estroma do câncer de próstata Predict Relapse subsequente. PLoS ONE 7 (8): e41371. doi: 10.1371 /journal.pone.0041371

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de maio de 2012; Aceito: 20 de junho de 2012; Publicação: 01 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de parceiros Estratégicos de Saúde para avaliação do câncer de Assinaturas (Specs) Consortium concessão U01 CA1148102 e National Cancer Institute Detecção precoce Research Network (EDRN) Consortium U01 concessão CA152738. Este trabalho também foi apoiado por uma Universidade da Califórnia de Irvine Award Faculdade Desenvolvimento de Carreira (ZJ), uma concessão do Chao Família Comprehensive Cancer Center na Universidade da Califórnia de Irvine (ZJ e DAM). Além disso, este trabalho foi apoiado em parte pelo Departamento de Defesa congressionally Directed programas de investigação médica conceder W81XWH-08-1-0720, e por uma Universidade da Califórnia de Irvine Institute for Cancer Research Training Grant Fellowship (T32CA009054 do Instituto Nacional do Câncer) ( FR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. MM e DM são co-fundadores e WL é CEO da Proveri Inc. YW é funcionário da AltheaDx Inc. Este não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o câncer de próstata é o câncer masculino mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de morte por câncer em homens nos Estados Unidos [1]. Cada ano em os EUA, existem cerca de 230.000 novos casos de câncer de próstata e cerca de 195.000 prostatectomies radicais são realizadas [2]. No entanto, alguns pacientes podem ser salvas por estes tratamentos, porque apenas uma minoria dos casos morrerão da doença se não tratada. O número necessário para tratar de salvar uma vida útil estimada em dois estudos foi de 12-15 [3] e até 48 [4]. Numerosos nomograms e métodos de previsão relacionadas foram criados com base em variáveis ​​clínicas no momento do diagnóstico, mas, até à data, essas ferramentas têm fornecido aconselhamento limitada em relação à qual os pacientes abrigam doença agressiva que requer tratamento radical possivelmente seguido por terapia adjuvante e que os pacientes podem ser adequados para um programa de vigilância ativa mais conservadora [5] – [9].

enormes esforços têm sido investidos no desenvolvimento de biomarcadores para o prognóstico de câncer de próstata com ênfase em recursos do componente epitelial do tumor em amostras retrospectivas. No entanto, alguns biomarcadores aceitos e clinicamente empregadas têm sido desenvolvidos. Um obstáculo para a descoberta de biomarcadores pode ser o tipo de célula-heterogeneidade e a natureza policlonal /multifocal das alterações genéticas acumuladas no momento do diagnóstico [10] – [13]. Em contraste, as exposições microambiente do tumor muito mutações mais limitadas e perda de heterozigosidade (LOH) [14], mas podem responder a sinais parácrinos de tumor nas proximidades. Tem sido mostrado que o microambiente dos casos seleccionados exibem alterações histológicas distintas denominadas “estroma reactivo” com perfis de expressão distintos que se correlacionam com o resultado pobre [15], [16]. De facto, demonstramos que estroma associado ao tumor sem levar em conta subtipo possui perfis de expressão única quando comparado com estroma normal. Utilizou-se essas alterações de expressão de genes para desenvolver um classificador que pode diagnosticar com precisão a presença de tumor em casos de cancro da próstata, mesmo que as amostras utilizadas para a análise não contêm tumor reconhecível [13]. Esta abordagem tem potencial clínico para resolver centenas de milhares de biópsias ambíguas realizados em os EUA a cada ano, o que vai melhorar muito a gestão da doença e salvar vidas. Da mesma forma, as informações de diagnóstico útil foi obtido a partir de examinar o estado de metilação dos genes GSTP1 e APC em biópsias de próstata iniciais negativas [17]. A expressão diferencial e perfis epigenética no estroma associado a um tumor em relação ao estroma normal pode reflectir respostas a factores parácrinos estroma do tumor, bem como outras influências. Se a qualidade e quantidade de tais respostas se correlacionam com os resultados clínicos tais como os fenótipos indolente ou agressivo, então a resposta estroma de tumor nas proximidades pode ser útil para derivar uma regra geral para o prognóstico. Outros pesquisadores observaram essas diferenças no cancro da mama [18]. Neste estudo, testou-se esta hipótese através da comparação de perfis de expressão génica entre amostras estroma entre os pacientes com resultados conhecidos diferentes, independentemente da histologia, e a identificação 115 conjuntos de sondas para a qual os níveis de expressão estão significativamente correlacionados com os tempos-a-recaída. Nós também comparou os perfis de expressão entre um subconjunto de amostras do estroma de pacientes que sofreram recidiva rapidamente e amostras do estroma de pacientes que não apresentaram recidiva após mais de quatro anos. Foram identificados 131 sonda conjuntos que tinham expressões alteradas. Havia 19 conjuntos de sonda (15 genes únicos) em comum entre essas listas de genes dois. Em seguida, um classificador derivado 15-gene. A precisão global foi de 87% quando o classificador foi testado em 47 amostras de testes independentes. análise de caminho e estudos Gene Onto- indicado estes 15 genes são significativamente enriquecidas para genes que estão envolvidos em processos relacionados com a apoptose. Estes estudos apoiaram a possibilidade de que o estroma é uma base prática da avaliação de risco.

Materiais e Métodos

cancro da próstata amostras de pacientes e Análise de Expressão

Nossa conjuntos de dados GSE8218 e GSE17951, que são publicamente disponíveis na expressão gênica Omnibus (GEO) do banco de dados, são baseados em amostras de tecido congelado após prostatectomia obtidos por consentimento informado usando protocolos IRB-aprovados e HIPPA conformes. Todos os tecidos foram coletadas no momento da cirurgia e escoltado à patologia para revisão acelerada, dissecção, e encaixe congelamento em nitrogênio líquido. Dados de acompanhamento clínico foi assimilado pelo programa UCI SPECS e mantidos em um banco de dados relacional. O ARN para a análise da expressão foi feita directamente a partir de tecido congelado seguinte dissecção de outubro (Composto temperatura óptima de corte) preparados a partir de blocos de amostras congeladas rapidamente com a ajuda de um criostato. Estroma a partir de amostras de tumor de suporte foi preparado a partir do tecido OCT-embutido que foi montado num criostato por decapagem de uma linha entre o tumor e estroma com um escalpelo e, em seguida, preparação de secções congeladas que aparecem como duas peças uma das quais é de tumor estroma adjacente, tal como descrito em [13]. Antes de perfeição do presente método, alguns estroma foi preparado por dissecação mão de tecido congelado com um bisturi. A fim de evitar a contaminação, o método exigido mão deixando um espaço entre o tumor e estroma de 0,5-1,0 mm e o estroma resultante é denominado “próximo” do estroma.

para análise de expressão de 50 microgramas (10 microgramas de tecido de biopsia ) do total de amostras de RNA foram processados ​​para hibridação com GeneChips Affymetrix (GSE17951: U133 mais 2,0 plataforma; GSE8218: plataforma U133A). Para estes dois conjuntos de dados, as distribuições para os quatro tipos de células principais [células tumorais epiteliais, células do estroma, células epiteliais da hiperplasia prostática benigna (BPH), e as células epiteliais das glândulas císticas dilatadas] foram estimadas em até quatro patologistas, cujas estimativas . foi calculada a média, como descrito [19], [20]

Conjunto de dados GSE25136 (plataforma U133A), que consiste em 79 casos portadores de tumores ( 10% de células tumorais), foi desenvolvido independentemente e usado como um conjunto de teste. A distribuição do tipo de célula de este conjunto de dados foi estimada usando CellPred, um

in silico

método para determinar a percentagem de amostras de tumor com base nos valores de expressão para as assinaturas de vários genes que são invariantes com parâmetros de patologia cirúrgica de tumores de Gleason e estágio (disponível em https://www.webarraydb.org/webarray/index.html) [20]. Note-se que a distribuição do tipo de célula de conjuntos de dados GSE8218 e GSE17951 foram fornecidos por até 4 patologistas [19], ao passo que a distribuição do tipo de célula do registo de dados GSE25136 foi estimada pela

in silico

método [20].

Métodos estatísticos

a normalização foi realizada através de múltiplos conjuntos de dados usando os ~22,000 conjuntos de sondas em comum a todos os dados define. Primeiro, os dados definidos GSE8218 foi quantil-normalizados utilizando a função ‘normalizeQuantiles’ da rotina limma [21]. Conjuntos de dados GSE17951 e GSE25136 foram então quantil-normalizado referenciando os dados normalizados definidos GSE8218 usando uma função modificado “REFnormalizeQuantiles ‘que está disponível no site da SPECS (https://www.pathology.uci.edu/faculty/mercola/UCISpecsHome. html) [22]. O pacote de limma Bioconductor foi utilizado para detectar genes expressos diferencialmente. Análise Previsão para Microarrays (PAM [23]), implementado em R, foi usado para desenvolver um classificador baseada em expressão a partir dos conjuntos de treinamento e, em seguida aplicada aos conjuntos de teste sem mais alterações.

Resultados

Gene Expression associada ao risco

Dois métodos foram utilizados para definir genes diferencialmente expressos no estroma de casos de alto e baixo risco. Curto tempo de sobrevida livre de doença (DFS) é um indicador comumente usado de agressividade [24] – [26]. Primeiro, definimos casos agressivos de câncer de próstata como aqueles pacientes que apresentaram recidiva da doença dentro de 1 ano após a prostatectomia, e os casos indolentes (ou menos agressivas) como aqueles pacientes que quer recidiva depois de 4 anos após a cirurgia ou que não recaída e tiveram pelo menos 4 anos de follow-up dados disponíveis. Com base nestes critérios, foram identificadas 40 amostras rápida recaída do paciente contendo estroma pura que estavam perto do tumor e 9 amostras de pacientes com doença indolente contendo estroma pura que estavam perto de tumor a partir de dados definidos GSE8218. Destes matrizes foram selecionados aleatoriamente 8 amostras de recaída do paciente rápidos e 7 amostras de doentes indolentes como os conjuntos de treinamento e compararam os perfis desses dois grupos usando limma expressão. Genes com

P

valores 0,05 e dobre mudança 1,6 (ou sobre-regulada ou regulada para baixo) foram identificados e utilizados para desenvolver um classificador PAM. O classificador resultante foi subsequentemente testado contra as amostras de doentes que não tinham sido utilizados para a formação (32 amostras de pacientes de recaída rápidos e 2 amostras indolentes paciente). Este processo foi repetido 1.000 vezes e 3.625 conjuntos de sondas foram selecionados pelo menos uma vez em cada 1.000 vezes com base em critérios de

p

valores 0,05 e dobre as alterações 1.6. A sensibilidade média e especificidade do processo de validação cruzada foram 69% e 82%, respectivamente. Um total de 131 conjuntos de sondas foram seleccionados pelo PAM nada menos que 500 vezes para fora das 1.000 iterações.

Em segundo lugar, a fim de identificar conjuntos de sondas associados com uma classe mais ampla de valores de risco, o conjunto de dados GSE8218 novamente foi usado para identificar conjuntos de sondas que se correlacionam com o tempo de sobrevida livre de doença, incluindo pacientes que sofreram recidiva entre um e quatro anos após a cirurgia. Conjunto de dados GSE8218 incluiu 49 amostras do estroma puros de 49 pacientes que foram submetidos a reincidência do câncer de próstata após a cirurgia. Note-se que as 49 amostras do estroma utilizados para análise de correlação não são idênticos às 49 casos estroma utilizados para recaída rápida

vs.

Comparação indolente que consistem em 44 casos recidivantes (em comum com os casos usados ​​para análise de correlação) e 5 casos não-recidiva. Foram analisadas as 49 amostras do estroma de caso de recaída por uma análise de correlação e identificou 115 conjuntos de sondas DFS-associados por meio de análise de correlação de Pearson com coeficientes de correlação 0,46 e

p

valores 0,001). coeficientes de correlação de Pearson para esses 115 conjuntos de sondas variam de -0,46 para -0,61 ou 0,46-0,69. Diferentes genes relevantes doença de progressão, além daqueles encontrados em casos de recidiva precoce e tardia (131 genes acima) foram assumidos para ser descoberto nesta etapa de identificação de gene porque os casos médio risco (tempo de recaída entre 1 ano e 4 anos) foram incluídos.

Houve 19 conjuntos de sondas comum entre os 131 conjuntos de sondas identificadas por análise PAM permutado e os 115 conjuntos de sondas identificados a partir da análise de correlação. Um estudo de simulação mostrou que a chance de observar 19 sobreposição entre selecionados aleatoriamente 131 conjuntos de sondas e 115 conjuntos de sondas a partir de uma base de 22.000 conjuntos de sondas é 0,0001. Assim, estes 19 conjuntos de sondas sobrepostas (um número maior do que aleatório) representam acordo significativo entre dois conjuntos de casos não-idênticos, utilizando diferentes métodos de análise. Os 19 conjuntos de sondas comuns, os quais representam 15 genes únicos, são listados na Tabela 1. Exemplo parcelas de expressão destes conjuntos de sondas

vs. Of the DFS tempo são mostrados na Figura S1.

desenvolvimento classificador e testes com conjuntos de dados independentes.

Os 19 sobrepostas conjuntos de sondas foram usadas para desenvolver um classificador. A partir de 40 amostras de câncer de recaída rápida da primeira etapa contendo estroma perto do tumor, foram selecionados 9 amostras com os menores tempos de DFS, que foram combinados com todas as 9 amostras contendo estroma perto tumor indolente para formar um conjunto de treinamento. Foram utilizados os 19 conjuntos de sondas identificados no passo anterior como PAM [23] de entrada para desenvolver um classificador com base nessas amostras de formação 18. O status observada dos casos de treinamento como caso agressivo ou indolente caso foi especificada. Todos os 19 conjuntos de sondas foram retidos pelo processo de otimização PAM com uma precisão de treinamento final de 88,9% (Tabela 2).

Um mapa de calor (Figura S2) ilustra que os 194 genes (a combinação do 131 conjuntos de sondas identificadas por análise PAM e os 115 conjuntos de sondas identificados a partir da análise de correlação) apresentaram perfis distintos entre os casos de recaída rápida e casos indolentes nas amostras de 18 formação do estroma. A trama vulcão (Figura S3) ilustra que alguns dos conjuntos de sondas têm grandes alterações dobrar e baixos valores de p. Os 115 conjuntos de sondas têm 19 conjuntos de sonda (15 genes únicos) em comum com os 131 conjuntos de sondas identificados a partir da análise PAM permutado. A trama vulcão na Figura S3 mostra que estes 19 conjuntos de sondas estão entre os conjuntos de sondas mais promissoras que têm as maiores mudanças dobrar e menores valores de p.

A fim de proporcionar um teste objetivo do classificador prognóstico, 47 independente foram empregadas amostras de teste, incluindo 36 amostras de conjunto de dados GSE8218 e 11 amostras de conjunto de dados GSE17951 (não usados ​​no treinamento) para testes. A sensibilidade de 88,1% e uma especificidade de 80% foram observados produzindo a precisão média foi de 87% (Tabela 2,

Test

). O valor global preditivo positivo (VPP) eo valor preditivo negativo (VPN) do teste com base nas 47 amostras independentes foram 97,9% e 44,4%, respectivamente.

A fim de testar ainda mais se o 15-gene classificador prognóstico geralmente se aplica a toda a gama de resultados e não se limita à sobrevivência selecionado específico seleccionado para treino na primeira etapa, foram testadas 19 amostras (não incluídas no treinamento) de pacientes que tanto sofreram recaídas entre o ano 1 e no ano 4 após a cirurgia ou não recaída, mas tinham menos de 4 anos de dados de acompanhamento. Estas 19 amostras incluiu 9 amostras de tumor do estroma perto e 10 amostras com tumor (tumor 10%). A análise de Kaplan-Meier indicou que o gene da 15-classificador prognóstico dicotomizados estas amostras ambíguas em dois grupos distintos com riscos significativamente (

P

= 0,02). Estas observações indicaram que a combinação de um método de formação seleccionado com base na sobrevivência em combinação com um método de correlação, que utilizou a gama disponível de tempos de sobrevivência livre de doença produziu um classificador com resultados precisos quando aplicado a um grupo de teste independente. Uma representação de Kaplan-Meier dos resultados dos ensaios para as amostras de teste 47, em combinação com os resultados das análises destas amostras do estroma 19 mediana de risco é resumido na Figura 1. Estes resultados renderam uma probabilidade de separação chance de as classificações previstas com um

p

= 0,0018.

Para medir a importância da sonda 19 define classificador, fizemos uma experiência com base em conjuntos de genes selecionados aleatoriamente. Foram selecionados aleatoriamente 19 conjuntos de sondas, de entre todos os 22,283 conjuntos de sondas e reran o treinamento e teste, como descrito acima. Este processo foi repetido aleatório 1.000 vezes. As médias das características de funcionamento são apresentados na Tabela 2. Apenas 7% dos 1000 classificadores aleatórios teve um desempenho igual ou melhor do que o classificador de prognóstico.

Nós também verificado se incluindo informações clínicas, tais como Gleason Scores, tumor palco e PSA pré-operatório acrescentou valor prognóstico para o classificador. Nós usamos essas três variáveis ​​em combinação com os 19 conjuntos de sondas como entrada PAM e deixe PAM selecionar as melhores características de previsão. Nenhuma dessas três variáveis ​​foram escolhidos pelo PAM. Além disso, foram analisados ​​65 casos (18 casos de formação e 47 casos de teste da Tabela 2) usando um multivariada de Cox de regressão, onde a idade, soma Gleason, TNM e PSA pré-operatório são comparados com a previsão feita pelo nosso classificador. Apenas previsão classificador (

p

= 0,0005) e TNM (

p

= 0,0383) foram significativamente associados com a sobrevivência. O resultado indica que a assinatura gene tem melhor valor preditivo e adiciona valor preditivo para variáveis ​​clínicas e patológicas conhecidas.

análise de amostras Stroma Longe do tumor e tumor amostras com baixas quantidades de Stroma

A 19 conjuntos de sonda (15 genes) formar uma assinatura prognóstico específico para estroma perto do tumor. Para examinar se o classificador 15 gene estendido para estroma que está longe de tumor primário, nós testamos o classificador em 9 amostras do estroma indolentes 8 dos quais são

longe

do tumor primário, tomada de um contralateral zona para o local do tumor. A precisão ou especificidade foi de apenas 11,1% (dados não mostrados). Assim, quando estroma é testada a partir de posições remotas com uma baixa probabilidade de ser afetada por fatores parácrinos tumorais, uma resposta estroma representado pelas alterações desses 15 genes de expressão não foi detectada em contraste com tais mudanças detectáveis ​​no estroma perto do tumor. Para verificar se o classificador 15 do gene foi insensível às grandes quantidades de contaminação de tumor, que testou em 117 amostras de portadores de tumores ( 10% de células tumorais com média de 48,5% do componente de tumor) em três conjuntos de dados (GSE8218, GSE17951 e GSE25136) com uma precisão global de 41%. No entanto, quando o classificador foi testado em amostras que contêm 9 10% de células tumorais, a precisão foi de 89% (Tabela 2). Assim, para a utilização clínica do ensaio, será importante para provar estroma, que fica ao lado, mas livre de células tumorais.

Análise de função para os genes Classificador

Foram analisados ​​os sonda 19 conjuntos (15 genes) usando a ferramenta de bioinformática DAVID [27]. Os 15 genes são significativamente enriquecidos em genes associados com apoptose e à morte celular (p 0,001 e Benjamin marcar 0,05) (Tabela 1, em negrito e /ou itálico). Analisou-se ainda mais os 194 genes (a combinação dos 131 conjuntos de sondas identificadas por análise de PAM e os 115 conjuntos de sondas identificadas a partir de análise de correlação), utilizando um instrumento de análise de via MetaCore (GeneGo Inc.). O sistema de filtragem de MetaCore ajudou a limitar a busca aos genes que foram identificadas em tecidos específicos, por exemplo, o tecido da próstata. Os genes filtrados foram usados ​​para construir as vias de sinalização. As vias estatisticamente significativas tinha de satisfazer o FDR 0,05 e múltiplos genes ( 2) significativamente associados com as vias biológicas. Para a análise dos 194 genes, usamos ‘músculo + doença biomarcador suave’ e ‘neoplasias prostáticas transcrição “como parâmetros de filtragem. Os resultados da análise de caminho MetaCore estão listadas na Tabela S1.

Discussão

Nós já mostrou que existem centenas de mudanças de expressão gênica significativas entre estroma tumoral adjacente e estroma normal que foram utilizados para desenvolver uma alta precisão específicas do estroma Classificador de diagnóstico para detectar a presença de tumor-com base na expressão de ARN de estroma sozinho [13]. Estas mudanças de expressão específica de estroma são susceptíveis de ser devido à reacção de estroma para os mediadores parácrinos derivadas de tumor, bem como um possível “efeito de campo”. Aqui temos a hipótese ainda que possam existir diferenças de expressão entre o estroma de tumores indolentes e agressivos, que poderiam ser utilizados para prognóstico clínico. Para testar esta hipótese, comparamos os perfis de expressão gênica entre as amostras de tumor do estroma adjacente de pacientes que experimentaram amostras estroma rápida recaída e tumorais adjacentes de pacientes que não tiveram recaída ou para os quais a recidiva levou muitos anos. 40 amostras de estroma de recaída rápida e 9 amostras de estroma casos indolentes foram submetidas a um processo de permutação para identificar genes expressos diferencialmente. Em cada um dos 1.000 iterações /resample, foram utilizados 31% das amostras do estroma (8 em 40 amostras rápidas estroma recaída e 7 de 9 amostras do estroma indolentes) para treinamento e utilizarem as amostras do estroma restantes para o teste. Devido ao fato de que tínhamos pequeno número de amostras para o treinamento, foram selecionados pequenos, mas semelhantes números (8 e 7) para cada iteração, a fim de dar espaço para reamostragem (análise permutada). As vantagens para este regime são três vezes. Primeiro, foi uma análise equilibrada em cada resample. Em segundo lugar, esse regime é robusta para potenciais amostras de ‘más’ desde amostras ruins podem ser excluídos em muitas combinações resample. Em terceiro lugar, esse regime pode aumentar dramaticamente a base de detecção (de um total de 3625 sondas foram identificados por 1.000 resamples). No entanto, só selecionados 131 conjuntos de sondas que foram identificados mais de 500 vezes nos 1.000 iterações para reduzir a chance de identificações falsas. Também identificamos 115 conjuntos de sondas de que os níveis de expressão em estroma tumoral adjacente são significativamente correlacionados com os tempos de sobrevida livre de doença dos pacientes que se submeteram à recidiva da doença. Os 19 conjuntos de sondas comuns (15) de genes únicos estas duas listas de genes significativas foram usados ​​para desenvolver um classificador baseado em PAM, que tinha uma precisão média de 87%, quando foi testado em 47 amostras de tumores do estroma adjacentes independentes.

recentemente, foi relatado que no câncer de mama qualquer conjunto de 100 genes ou mais seleccionados aleatoriamente tem uma chance de 90% a ser significativamente associada com o resultado, e as assinaturas mais publicados não são significativamente mais associado com o resultado de preditores aleatórios [ ,,,0],28]. A fim de resolver este problema, geramos classificadores aleatórios com base no

amostras

formação mesmos e os 1.000 conjuntos de conjuntos de 19 sondas seleccionadas aleatoriamente e testado esses classificadores aleatórios com o

amostras de teste mesmo

como usado para testar a definir prognóstico Stroma Classificador 19-sonda. O número médio de conjuntos de sonda selecionada pelo PAM nos 1.000 conjuntos aleatórios é de 3,7 que se presume ser um ruído. Isso é para qualquer conjunto escolhido aleatoriamente de 19 conjuntos de sondas, um pequeno número de conjuntos de sondas seria correlacionando com o /baixo status de alto risco por coincidência, o que explica por que a precisão média de formação de classificadores aleatórios foi ~ 70%. No entanto, esses classificadores aleatórios não iria trabalhar para conjuntos de teste independentes. Pelo contrário, os 19 conjuntos de sondas foram identificados através de ambas as abordagens rigorosas; portanto, eles são potencialmente marcadores prognósticos gerais que se aplicam a outros conjuntos de teste. A comparação favoreceu o nosso classificador 15 gene (19 sonda set) sobre esses classificadores gerados por processos aleatórios (Tabela 2).

Uma série de genes aqui identificados para o desenvolvimento classificador têm sido observadas em outros estudos de expressão do RNA em o estroma de tecido da próstata. Comparou-se o total de 227 conjuntos de sondas ou 194 genes únicos identificados aqui com conjuntos de sondas específicas do estroma anteriormente identificadas em três estudos como úteis para o diagnóstico. Existem 2 genes em comum (PROM1, GPM6B) com os 339 conjuntos de sondas utilizadas para desenvolver o nosso classificador de diagnóstico [13]; 3 genes (SEL1L3, KRT19 e KRT7) em comum com os 119 genes diferencialmente expressos gene de Joesting

et al.

[29], e 3 genes (NKX3-1, TPD52 e GALNT3) em comum com os 44 genes que foram diferencialmente expressos entre estroma associado a um tumor e de estroma não tumorais a partir de 5 pacientes [30]. Estas observações indicam que as assinaturas prognósticos em estroma são em grande parte diferente das assinaturas de diagnóstico no estroma.

Em um estudo recente, um LOH /desequilíbrio alélicas (AI) varredura do genoma de DNA foi realizado para identificar LOH /AI quente /pontos frios no epitélio da próstata, ou no estroma da próstata, ou em ambos, que identificou 156 genes associados a fenótipos clínico-patológicas, incluindo recaída [14]. Quatro genes (C7, SLPI, HOXB13, PDCD10) são compartilhados com os nossos 194 estroma genes prognósticos com um

p valor

de 0,08. Assim, a expressão do gene de alguns genes que identificamos como de potencial valor prognóstico pode ser alterado devido a alterações genotípicas e são de particular interesse futuro, mas a maioria dos genes foram identificados ainda não mostrar tal associação.

A subconjunto das amostras mais agressivas no nosso estudo terá estroma reactivo, o que tem sido demonstrado que se correlacionam com resultado pobre [15]. Assim, foram comparados os 194 genes expressos de estroma que encontrámos uma correlação com os resultados de 1150 genes que foram diferencialmente expressos entre o subgrupo “estroma reactivo” de amostras de cancro da próstata e do estroma distantes dos mesmos 17 pacientes [15]. Dez genes (RABEP1, ZNF263, MCCC2, SLC4A4, TP53, KPNA6, PTPRF, CDH1, SCNN1A e CD24) foram em comum entre os estudos (

p

value = 0,1312, por um teste baseado em simulação). Outro estudo recente identificou 36 marcadores prognósticos também especificamente extraídas estroma reactivo [16]. Além disso, as amostras de teste apresentaram substancial do tumor presente, deixando em aberto a possibilidade de que alguns genes foram expressas diferencialmente entre o epitélio do tumor de tumores alta e baixo risco. Apesar destas diferenças no desenho experimental, quatro genes (NKX3-1, FOLH1, AGR2, HOXB13) são em comum com os nossos 194 estroma genes prognósticos com um

valor p

de 0,0001, indicando um acordo substancial. Além disso, todos os quatro produtos de genes estão bem documentados biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para cancro da próstata [31] – [35]. Estes genes será de particular interesse em estudos futuros.

Foram analisadas as funções biológicas para os prognósticos 19 conjuntos de sonda (15 genes) (Tabela 1) usando o software DAVID e MetaCore. Os resultados indicaram que 7 genes conhecidos (GADD45B, CDKN1A, NLRP1, ErbB3, YWHAE, TNFSF10 e eIF5A) estão relacionadas à apoptose e 6 genes conhecidos (CDKN1A, NLRP1, ErbB3, YWHAE, TNFSF10 e eIF5A) estão relacionadas à morte celular, com 6 em comum. Isto é intrigante com base em nossa especulação de diálogo tumor-estroma que favorece a progressão do tumor. Talvez, tumores agressivos sinais parácrinos fornecer um mecanismo para obrigar o estroma circundante se submeter a remodelação processos apoptóticos e /ou para facilitar o crescimento e invasão tumoral [36] seguido de transição epitelial-mesenquimal [37], [38]. Evidências de experimentos independentes no nível molecular é necessária para apoiar esta hipótese.

Foram analisados ​​ainda os 194 genes (a combinação dos 131 conjuntos de sondas identificadas por análise PAM e os 115 conjuntos de sondas identificados a partir da análise de correlação) usando um software via MetaCore. O resultado da análise de caminho usando ‘+ doença músculo liso biomarcador “como um parâmetro de filtração indicou que este conjunto de 194 genes são significativamente enriquecidos em genes associados com’ neoplasias da próstata transcrição ‘. Os sete genes associados com esta descrição foram NCOA3 (TRAM-1), c /EBP (CEBP), NR77 (NR4A1), NK31 (NKX3-1), P53 (TP53), KL5 (KL5), CEBPD. Além disso, 3 genes STAT1, ErbB3, P21 (CDKN1A) foram encontrados para ser associado com “regulação neoplasias prostáticas de progressão através do ciclo celular” e 1 STAT1 gene está associado a ‘neoplasias prostáticas resposta inflamatória “. análise de caminho usando ‘músculo liso + doença como um parâmetro de filtragem indicou que 67 dos 194 genes são conhecidos por ser significativamente associada a doenças da próstata e 66 desses 194 genes são conhecidos por ser significativamente associada com neoplasias prostáticas (Tabela S1) de que 59 estão em comum entre as duas listas. Além disso, a maioria destes 194 genes também estão associados a outros cancros, tais como tumores colorectais, neoplasmas da mama e neoplasias pulmonares, indicando estes genes podem ser geralmente envolvidas em vias relacionadas com o cancro. A análise via também mostrou que uma parcela significativa desses 194 genes interagem com fatores de transcrição, como P53, SP1, FOXO3a, AR, BCL6, STAT5A, STAT5b, C-Jun, NRF2, MyoD e STAT1, que desempenham um papel crucial no cancro desenvolvimento e progressão. Por exemplo, fator de transcrição SP1 está funcionalmente associado com 94 genes da lista de genes 194 (Figura S4).