Abstract

Objectivo

LC-MS /MS fosfo-proteômica é uma tecnologia essencial para ajudar a desvendar os eventos moleculares complexas que levam ao e propagar câncer. Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho fosfo-proteômica global para determinar a atividade de vias de sinalização e alvos da droga no tecido do cancro do pâncreas para aplicação clínica.

Métodos

Os peptídeos resultantes de digestão tríptica de proteínas extraídas de tecidos congelados de adenocarcinoma ductal pancreático e pâncreas de fundo (n = 12), foram marcadas com etiquetas de massa em tandem (TMT 8-plex), separado por cromatografia de permuta catiónica forte, em seguida, foram analisados ​​por LC-MS /MS directamente ou primeiro enriquecido para fosfopéptidos usando IMAC e TiO

2, antes da análise. Na casa, as plataformas de bioinformática comerciais e freeware foram utilizados para identificar eventos biológicos relevantes do conjunto de dados complexos.

Resultados

de 2.101 proteínas identificadas, 152 demonstrou diferença significativa em abundância entre o tumor e não tecido tumoral. Eles incluíram proteínas que são conhecidos por ser regulada para cima no câncer de pâncreas (por exemplo mucina-1), mas a maioria eram novos marcadores candidatos, como HIPK1 MLCK. Dos 6,543 fosfopéptidos únicas identificadas (6,284 únicos sítios de fosforilação), 635 mostraram regulação significativa, particularmente aqueles a partir de proteínas envolvidas na migração celular (factores de troca de nucleótidos de guanina de Rho MRCKα) e formação de adesões focais. sites de ativador de fosforilação em Fyn, AKT1, ERK2, HDAC1 e outros alvos da droga foram encontrados para ser altamente modulada (≥2 vezes) em diferentes casos destacando seu poder preditivo.

Conclusão

Aqui nós fornecemos informação crítica que nos permite identificar os eventos moleculares comuns e únicas provável que contribuem para o câncer em cada caso. Tais informações podem ser usadas para ajudar a prever um tratamento mais bespoke adequado para um caso individual

Citation:. Britton D, Zen Y, Quaglia A, Selzer S, Mitra V, Lößner C, et al. (2014) Quantificação do cancro do pâncreas Proteome e Phosphorylome: Indica eventos moleculares contribuindo provavelmente ao câncer e Atividade de alvos de drogas. PLoS ONE 9 (3): e90948. doi: 10.1371 /journal.pone.0090948

editor: Jon CD. Houtman, da Universidade de Iowa, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de agosto de 2013; Aceito: 05 de fevereiro de 2014; Publicação: 26 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Britton et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Todos os trabalhos realizada neste estudo foram financiados conjuntamente pelo Instituto de Estudos de fígado do Hospital Kings College e Proteome Sciences plc. Os financiadores não empregou os cientistas e médicos que desempenharam papéis-chave no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar, e preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Temos os seguintes interesses. Este estudo foi parcialmente financiado pela Proteome Sciences plc, o empregador de David Britton, Stefan Selzer, Vikram Mitra, Christopher Lößner, Stephan Jung, Gitte Böhm, Peter Schmid, Petra Prefot, Claudia Hoehle, Sasa Koncarevic, Malcolm Ward, Hans Dieter Zucht e Ian Pike. Todos os funcionários da Proteome Sciences plc (exceto recém-recrutado Vikram Mitra) detêm ações ou opções em Proteome Sciences plc. Proteoma Ciências também produzem os reagentes TMT usados ​​neste estudo e estes reagentes estão agora licenciadas para distribuição pela Thermo Fisher Scientific. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

fosforilação de proteínas é um processo comum modular a atividade de proteínas supressores oncogénicos e de tumores [1] – [3]. Em muitos casos, os resultados de fosforilação em mudanças de comutação do tipo da função da proteína, devido à modulação da dobragem de proteínas, afinidade para o substrato, estabilidade, e da actividade dos seus substratos, por sua vez, afectam as vias de sinalização que controlam a proliferação celular, migração, diferenciação e apoptose, desregulação os que contribuem para o fenótipo do cancro [4]. O câncer de pâncreas é uma das neoplasias malignas mais agressivas com uma sobrevida mediana de 6 meses. Uma proporção significativa dos pacientes são diagnosticados em estágio avançado, onde opções terapêuticas são muito limitados [5]. Como é o caso de outros tipos de cancro, a terapia de direccionamento molecular é promissor para o tratamento de cancro avançado ou recorrente pancreático [6]. Embora uma variedade de drogas que alvejam moleculares estão disponíveis na última década e muitos outros também são esperados nos próximos anos, um avanço ainda é necessária para a previsão de efeitos de drogas e selecção de drogas. Por exemplo, sorafenib, um inibidor de multi-cinase actua sobre o receptor do factor hiperactivo de crescimento endotelial vascular, do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas e Raf, provou ser eficaz em alguns doentes com carcinoma hepatocelular avançado [7], mas que não pode actualmente prever o seu efeito sobre um paciente individual antes de iniciar o tratamento. Para superar essas dificuldades, parece crucial para estabelecer uma abordagem analítica para ajudar a selecção de drogas, onde a expressão ea atividade de múltiplos alvos de drogas são exaustivamente avaliados numa base caso-a-caso. Fosforilação é um evento chave modulando a atividade da proteína, portanto, medição da fosforilação de proteínas é um indicador útil do estado de activação.

Existem centenas de alvos de drogas anti-câncer e proteínas sinalizadoras oncogênicos que são relevantes para a seleção terapêutica, portanto, medindo expressão e status de ativação de todos usando o ouro análise atual padrão, imuno-histoquímica (IHQ), não é viável. A este respeito, IHC mantém um papel como uma ferramenta de validação. microarrays da proteína de fase reversa (RPMA) têm limitações devido a um repertório de anticorpos limitado e pouca especificidade /reactividade cruzada. Além disso, tecnologias da genómica baseada não permitem medições de sinalização fosfoazotados. A cromatografia líquida – espectrometria de massa em tandem (LC-MS /MS) com base proteomic abordagens foram desenvolvidas para quantificar e identificar milhares de proteínas e os seus locais de fosforilação [8], [9]. Neste estudo nós desenvolvemos um fluxo de trabalho fosfo-proteômica baseada LC-MS /MS (SysQuant) para superar muitas das dificuldades técnicas e bio-informática envolvidos na quantificação efetivamente expressão e atividade das proteínas de sinalização, muitos dos quais são alvos de drogas, pelo uma grande escala global ou sistema no tecido tumoral. Nós comparamos congelado tecido ressecado (tumor contra o fundo não-tumor) a partir de doze casos de pâncreas adenocarcinoma cabeça ductal e aumento da taxa de transferência utilizando isotopólogos repórter de íon de TMT, resultando em reagentes de 8 complexos e, portanto, a capacidade de executar oito amostras simultaneamente [10], [11]. eventos moleculares susceptíveis de contribuir para o câncer foram identificados comum a todos os casos, porém alguns foram único para um caso individual ou subgrupo. Há também pareceu haver uma relação entre o tempo de recorrência e o agrupamento de casos após a análise de componentes principais das razões T /NT de fosfopéptidos. análise fosfopeptídeo usando SysQuant pode identificar novos alvos terapêuticos e também ajudar a estratificar pacientes em diferentes regimes de tratamento com base no estado de activação de vias de sinalização e alvos de drogas conhecidas.

Materiais e Métodos

Aspectos éticos e de investigação protocolo foi aprovado pela Comissão BioBank do Instituto de Estudos do fígado, Hospital Kings College (Referência No. 08 /H0704 /117). Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para usar suas amostras de tecido para a pesquisa. Doze casos de pâncreas adenocarcinoma cabeça ductal foram selecionados (Tabela S1 nas Tabelas S1). informação clínica não confidencial adicionais, tais como o estágio do tumor, sexo e recorrência pode ser visto em cada caso nas Tabelas S2 S3 nas Tabelas S1. amostras de tecido de tumor (T) foram retirados das massas de tumor pancreático, enquanto não tumoral (NT) das amostras eram de pâncreas de distância a partir da massa do tumor. Todas as amostras de tecidos foram congelados dentro de 30 minutos de ressecção cirúrgica e armazenados [a -80 ° C] até que a análise por SysQuant (tempo médio de armazenamento [18,5 meses] variam [4-28 meses]. T contra o NT foram comparados usando SysQuant e experimental detalhes estão descritos no documento Métodos S1. em resumo, isto envolveu a extracção de proteínas a partir de amostras de tecido (quantidades ug utilizados para cada amostra são apresentadas na Tabela S4 nas Tabelas S1), digestão com tripsina das proteínas em peptídeos, rotulagem TMT 8-Plex de péptidos (tumoral e não tumoral do tecido a partir de 4 casos por TMT 8-Plex) seguido de mistura para formar uma única mistura de amostra 8-Plex (ver Tabela S5, nas Tabelas S1). Cada amostra de TMT 8-Plex foi então dividida em três independente alíquotas, cada uma das quais foi ainda dividida em 12 fracções de permuta catiónica forte (SCX) cromatografia (Tabela S6, nas Tabelas S1). O primeiro conjunto de 12 fracções de SCX foram então analisadas directamente por LC-MS /MS usando dados duplicados aquisição dependente corridas seguidas por uma terceira corrida usando o tempo rejeição dependente de todas as características identificadas nas corridas 1 2. Os outros dois conjuntos de 12 fracções enriquecidas foram primeiro para fosfopéptidos utilizando a cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) ou TiO

2 (Tabela S6, nas Tabelas S1). As fracções enriquecidas 24 fosfopéptido resultantes foram também analisados ​​por LC-MS /MS. No total, 108 separadas corre LC-MS /MS foram realizadas para cada amostra TMT 8-Plex. Dados de espectrometria de massa em bruto foram pesquisados ​​contra a UniProtKB de banco de dados /Swiss-Prot humano utilizando Mascot e Sequest (via Proteome Discoverer). partidas espectro Peptide (PSMs) foram rejeitados se identificou apenas com baixo nível de confiança (≥5% FDR), mostrou ≤75% pontuação fosfo-RS probabilidade, e teve que faltam canais de quantificação (por exemplo, nem todos os picos para as tags isobáricos visíveis no espectro). valores de intensidade bruto de etiquetas isobáricas de PSMs que passam filtros foram utilizados para quantificação, mas primeiro normalizados utilizando soma-incrustação (como mostrado na Figura S1) para reduzir o potencial de polarização experimental /sistemática. Log

2 rácios foram calculados a partir intensidades tag isobáricos, mostrando a regulação entre T sobre NT para cada caso. Um log T /NT fosfopeptídeo

2 rácio é o log T /NT mediana

2 relação de todos os PSMs únicas para essa sequência peptídica específica. Um registo de T /NT proteína

2 rácio é o log T /NT mediana

2 proporção de todos os péptidos não-fosforilados únicas únicos para essa proteína específica. Um t-teste de dois lados (de uma amostra de teste de localização), foi usado para calcular os valores de p. Os valores de p foram plotados contra o registro

rácios de 2 T /NT em parcelas Volcano para identificar peptídeos significativamente regulamentados. Ao nível da proteína, foram adicionados anotação usando GO-termos, KEGG-vias e informações drugbank e proteínas também foram mapeados para vias utilizando recursos como Davi e STRING. Na anotação fosforilação nível do site usando PhosphoSitePlus foram adicionados, incluindo papel funcional e biológica /patológica conhecida do sítio de fosforilação. Mínimos Quadrados Parciais análise discriminante (PLS-DA) foi usado para modelar e investigar o conjunto de dados multivariada para identificar outliers e grupos de todos os peptídeos intensidades tag isobáricos de cada filtro que passam PSM, bem como log

2 relações T /NT (fosfopeptídeos ) de todos os braços do fluxo de trabalho (IMAC, TiO

2 e não-enriquecido). O fluxo de trabalho SysQuant, combinando a preparação da amostra fosfo-proteômica, análise LC-MS /MS, e bioinformática análise, foi utilizada para identificar eventos moleculares importantes acreditamos contribuir para o cancro pancreático nos casos analisados ​​aqui.

Resultados e Discussão

Todos os péptidos identificados pela Sequest e Mascot neste estudo foram exportados de Proteome Discoverer e podem ser vistos no zip arquivos S1, S2 e S3. Ficheiro S1 contém todos os péptidos (fosforiladas e não fosforiladas) identificados a partir das amostras em TMT 8-Plex-1, Ficheiro S2 contém todos os péptidos identificados a partir de amostras em TMT 8-plex-2, e S3 ficheiro contém todos os péptidos identificados a partir de amostras em TMT 8-Plex-3. Estes arquivos zip Suplementares exibir informações detalhadas incluindo Sequest Xcorr, mascote íons pontuação, Dm [ppm], os valores de q Percolator, e outras informações importantes. Os dados destes excel documentos foram inseridos em ferramentas de bioinformática in-house para identificar eventos biologicamente relevantes.

No total, foram identificados 6,543 sequências fosfopeptídeos únicos (6,284 sítios de fosforilação originais), de 2.101 proteínas (Tabela 1). peptídeo Figura 1 mostra identificados distribuição (fosforilada e não fosforilada) ao longo de todos os três braços (não-enriquecido, TiO

2, IMAC) do fluxo de trabalho SysQuant para cada TMT 8-plex. A Figura 1 também ilustra o número de péptidos detectados no total para todas as três repetições de análise (depois de combinar diferentes números de fracções), em cada uma e todas as amostras de TMT 8-plex. Quando os resultados a partir de cada um dos componentes paralelos (TiO

2, IMAC, não enriquecido) são comparadas as vantagens de uma abordagem combinada de enriquecimento e múltiplas repetições analíticos (incluindo a utilização da lista de rejeição tempo dependente), são aparentes. O maior número total de fosfo-péptidos foi visto usando IMAC enriquecimento que representou 79% de todas as fosfopeptídeos únicos identificados. No entanto, o TiO

2 fracções identificada exclusivamente cerca de 19% do total que seria dispensada utilizando uma estratégia única enriquecimento fosfo-péptido (Figura 1: TMT 8-Plex-ALL: A). O mesmo é verdadeiro para os três ensaios analíticos realizados em cada amostra. Se uma execução dependente de dados único foi realizada apenas 20.318 peptídeos originais são vistos (Figura 1: TMT 8-plex-ALL: D). A segunda corrida dependente dos dados acrescenta 5.868 peptídeos, enquanto o uso do tempo lista de rejeição dependente no prazo de 3 permitido mais 3257 péptidos a ser identificado em geral. Coletivamente (executar 2 3) o que representa um adicional de 45% sobre o funcionamento 1 sozinho e 31% do número total de péptidos únicos. É importante salientar os peptídeos identificados no terceiro prazo são geralmente de menor abundância. Também ilustram (Figura S2) o número de fosfopéptidos únicas e não-fosfopéptidos identificados em cada ficheiro em bruto, a partir de cada fracção SCX, em cada braço do fluxo de trabalho (não-Enrich, TiO

2, e IMAC), de cada TMT amostra 8-Plex (TMT 8-Plex-1, 2, 3)

diagramas de Venn demonstrar o número de.; A: sequências únicas fosfopeptídeo, B: sequências não fosfopeptídeo únicas e C: número total de sequências de péptidos únicos identificados no TiO

2, IMAC, e /ou braço não enriqueça do fluxo de trabalho SysQuant, em todos os três TMT amostras de 8-plex no total (TMT 8-plex-ALL) e individualmente por TMT 8-plex (TMT 8-plex 1, TMT 8-plex 2, TMT 8-plex 3). D: demonstra o nível de sobreposição observamos para identificações de peptídeos de corrida analítica 1, corrida analítica 2 e corrida analítica 3 (incluindo o tempo de lista de rejeição dependente compilados a partir de identificações de corrida 1 e 2)

.

dos 6543 fosfopeptídeos identificadas, 5409 eram quantificáveis. Devido ao grande número de fosfopeptídeos quantificáveis ​​estes devem ser vistos em um arquivo excel separado (S4 arquivo), e não como parte do documento principal. Ficheiro S4 mostra as sequências de fosfopéptido, os resíduos fosforilados e o nome de proteína e o número de acesso UniProt ao qual pertence o péptido. Arquivo S4 também exibe todas as informações quantitativas e estatísticas relativas às fosfopeptídeos no tumor versus não-tumoral de todos os casos, e também dá informações anotação incluindo efeitos funcionais conhecidos do evento de fosforilação. Esta informação foi extraído a partir da base de dados PhosphositePlus e pode ser observada em colunas BM-CP. Arquivo S4 também fornece informações funcionais relativos à proteína, informações extraídas dos termos GO (colunas CQ-DC) e alvos de drogas se essas proteínas são conhecidas (colunas DD-DG) extraídos da base de dados do Banco de Drogas. Para informações adicionais sobre a abundância relativa de proteína e níveis fosfopeptídeo normalizadas (fosfopeptídeo normalizada para nível de proteína) referem-se a arquivo S5. A abundância relativa de fosfopéptidos em tumoral contra o tecido não tumoral irá mudar de caso para caso, principalmente devido a alterações no nível da proteína fosforilada expressão ou devido à actividade modulada das quinases e fosfatases que induzem ou invertendo a fosforilação do substrato de proteína, respectivamente. Em S5 Ficheiro que normalizar a abundância relativa de um fosfopéptido para a abundância relativa da respectiva proteína. abundância relativa de proteína é calculado utilizando apenas péptidos não-fosforilados, por conseguinte, há casos em que não são capazes de levar a cabo a normalização, devido à ausência de péptidos não-fosforilados para algumas das proteínas.

PLS-DA

o primeiro componente principal (PC1) mostra a variabilidade introduzida devido aos três diferentes braços do fluxo de trabalho. Estes três braços IMAC, TiO

2 e proteína total (isto é não-enriquecido), como mostrado na Figura 2A e Figura S3, ter separado as variáveis ​​em 3 grupos separados. O círculo preto sólido na Figura 2A representa o espaço T2 hotelling com base em 95% de confiança. PC1 explica 13,6% da variância total no conjunto de dados. A segunda Componentes Principais (PC2) ilustra a variabilidade introduzida por diferentes TMT canais de 8-plex. Esta variabilidade destaca principalmente o paciente a variância paciente, que é 10,56% da variância total no conjunto de dados. A variação entre a classe, ou seja Tumor (T) vs não tumorais (NT), é mostrado pela terceira componente principal (PC3) que explica 14,36% da variância total no conjunto de dados. Figura 2B e Figura S4 mostra o agrupamento de variáveis ​​em dois grupos separados, ou seja, T e NT. As diferenças entre os diferentes braços do fluxo de trabalho também afectou PC3, que é ilustrado pelo agrupamento de TotalProtein péptidos (não enriquecido) num único agrupamento na Figura 2B. Só paciente 12 não apresentaram diferenças em T, em comparação com NT acordo com a Figura 2B. Os PLS bi-parcelas demonstrar que não havia valores extremos neste conjunto de dados, como mostrado no gráfico Hoteling T2-Range (Figura S3). PLS confirmou que o experimento foi bem sucedido e que existem diferenças significativas entre T e NT. As diferenças entre os três braços diferentes de existir o fluxo de trabalho, mas TiO

2 e IMAC têm uma correlação quase iguais. Juntos PC1, PC2 e PC3 explicar 38,52% da variância total no conjunto de dados. A variação remanescente no conjunto de dados pode ser atribuído aos efeitos mistos de variabilidade analíticos e biológicos

A:. PC1 e PC2 trama pontuação dos dois primeiros componentes principais que descrevem 13,6% (PC1) e 10,6% (PC2) de da variância total dos dados (matérias-tag intensidades isobáricos de cada filtros PSM passagem definido). O círculo representa o espaço T2 hotelling com base em 95% de confiança. B: PC2 e PC3 trama pontuação dos próximos componentes principais que descrevem 10,6% (PC2) e 14,4% (PC3) da variância total dos dados. C: PC1 e enredo pontuação PC2 dos dois primeiros componentes principais que descrevem 25,8% (PC1) e 19,3% (PC2) da variância total dos dados (log mediana

2 relações T /NT de todos os fosfopeptídeos quantificáveis ​​em cada caso ). Aqui também exibir o tempo de recorrência em meses, para cada caso, após a cirurgia

Além de investigar matérias intensidades tag isobáricos em T NT espécimes para identificar outliers e grupos, PLS-DA também foi usado para investigar o log

2 relações T /NT de todos os fosfo-péptidos (mediana de IMAC, TiO

2, não-enriquecido), em cada caso, como mostrado na Figura 2C. Uma relação sutil entre o agrupamento de casos eo tempo de recorrência parece sair, no entanto terá de ser aumentada antes de chegar a quaisquer conclusões finais o número de repetições biológicas. Dito isto, é interessante observar casos 14 e 9 agrupados de perto e ambos os casos experimentaram recorrência muito cedo aos 2 e 5 meses após a cirurgia, respectivamente. Casos 10 e 8 também agrupados, mas longe de todos os outros casos. Caso 10 apresentaram recidiva em 31 meses e caso 8 não tinha nenhum sinal de recorrência até 23 meses pós-cirurgia. Casos 4, 12, 1, 7, 5 e 13 agrupadas e estes mostraram recorrência entre 10 a 21 meses após a cirurgia. Curiosamente caso 6, que ainda é o de mostrar a recorrência, também agrupados com os casos que revelaram recorrência em 10 a 21 meses. Caso 11 não fez de grupo com quaisquer outros casos.

expressão da proteína significativamente regulada

Foi determinada a abundância relativa de proteínas no tumor, em comparação com o tecido não-tumoral, usando log mediana

2 T /NT rácios dos péptidos não fosforilada únicas para cada proteína como substitutos para calcular a abundância relativa das proteínas respectivas. A um teste t unilateral foi utilizado para calcular os valores de p e estes foram plotados contra o registro

2 relações T /NT em um terreno vulcão para detectar significativa (Log

2 T /NT≥0.3 ou ≤-0,3 e p≤0,05) regulamentos sobre todos os casos (Figura 3A). No total foram 152 proteínas significativamente regulada com base no Registo

2 t /NT≥0.3 ou ≤-0,3 e p £ 0,05 (Ficheiro S6_Sheet ‘Pro_TvNT ou 0.3_p 0,05). A Tabela 2 apresenta as 12 proteínas mais significativamente upregulated em tumor em comparação com tecido não-tumoral, e também fornece uma descrição de qualquer função conhecida de cada proteína ou associação com câncer [13] – [31]. Superexpressão de mucina-1 é freqüentemente associada com câncer e também encontramos mucina-1 a ser significativamente regulada para cima no tecido tumor pancreático. Curiosamente, encontramos proteínas-regulada mais significativo do que mucina-1, alguns dos quais podem revelar-se marcadores mais específicos de câncer de pâncreas, talvez até mesmo novos alvos terapêuticos, por exemplo, proteína cinase que interage com um homeodominio (HIPK1). HIPK1, o que era elevado no tumor em comparação com não-tumoral em todos os casos (log médio

2 T /NT = 1,00; p = 1,59 E -04), é uma de quatro HIPK serina /treonina quinases conhecidas por interagirem com e regular a actividade de numerosas proteínas celulares, incluindo vários factores de transcrição e co-factores, [33], [34] [32]. HIPKs têm sido implicados no controle de uma variedade de vias celulares a regulação de diversos processos, incluindo a resposta a danos no ADN, especificação de tecidos, e proliferação [34].

terrenos vulcão que mostram -log

10 Os valores de p em relação ao log

2 relações T /NT para; A: abundância de proteína relativa (determinada a partir de log não-fosfopeptídeo mediana

2 relações T /NT), B: fosfopeptídeos medida no IMAC, C: TiO

2, D: e no braço do fluxo de trabalho SysQuant não-enriquecido . círculos vermelhos apontam proteínas significativamente modulados (log

2 relações T /NT ≥ 0,3 ou ≤-0,3 e valores de p ≤ 0,05) e fosfopeptídeos (log

2 relações T /NT ≥0.75 ou ≤-0,75 ep -Valores ≤0.05). E: é um diagrama de Venn que ilustra a distribuição dos 635 fosfopeptídeos entre os três braços do fluxo de trabalho que foram significativamente modulada

Para entender melhor os processos biológicos e vias de sinalização KEGG diferentes entre tumor. e não-tumoral foram selecionados os números de acesso de todas as proteínas significativamente modulados e carregados-los para o recurso DAVID Bio-informática. A via de sinalização de Adesão Focal KEGG foi mais significativamente afetadas dando uma pontuação Benjamini de 1.0E-3. proteínas de adesão focal significativamente modulados incluído; Talin-1, Filamin-A, Filamin-B, Filamin-C, Vinculina, fibronectina, Zyxin, e da cadeia leve da miosina quinase, o músculo liso (Figura 4 arquivo S6_Sheet; FA lamellipodium). Talina-2, quinase de adesão focal 1 (FAK1), proteína fosfatase um regulador 12A subunidade foram também proteínas de adesão focal e significativamente modulada, mas só pode ser visto no ficheiro S6, uma vez que estes proteínas não foram quantificáveis ​​em alguns casos, e a Figura 4 mostra apenas proteínas quantificável em todos os casos (por exemplo, não N /a). Todas estas proteínas de adesão focal, excepto FAK1, foram significativamente regulada para cima no tumor versus não-tumoral sugerindo aumento do tamanho e /ou a frequência de adesões focais em células dentro do tumor. adesões focais são conhecidos por desempenhar um papel na migração de vários tipos de células [35], [36], [37]. Durante a migração das adesões focais podem ancorar células à matriz extracelular após a formação de projeções celulares ou saliências; tais como pseudopodium, filopodium, e lamellipodium [37]. As proteínas de adesão focal vinculina e cadeia leve da miosina de cinase, também são conhecidos por estar envolvidos na formação de lamelip�ios e promover a motilidade celular. Na Figura 4 Listamos proteínas conhecidas para ser envolvido na formação de projeções de crescimento e adesões focais, visto ser significativamente modulada e mensurável em todos os casos. A membrana plasmática abrangendo receptores da matriz extracelular (integrinas) são componentes essenciais das adesões focais no entanto, não observamos modulação estatisticamente significativo de qualquer expressão de integrina, mas foi observada a modulação significativa da fosforilação integrina, como discutido mais tarde. O conjunto de adesões focais também envolve a activação de Rho sinalização, bem como a contractilidade induzida por miosina [37]. A Figura 4 também mostra Miosina 9, 10, 11, e 14 foram significativamente elevados em tumores comparada com o tecido não tumoral

Todas as proteínas nesta figura foram mostrados para ser associado com os termos GO ‘lamellipodium’ ‘Adesão focal “e também demonstrou ser significativamente (p £ 0,05) a montante ou a jusante regulados em tumores comparada com o tecido não tumoral e quantificáveis, em cada caso (por exemplo, todas as proteínas que contêm NA para qualquer caso foram excluídos da tabela). Log

2 rácios T /NT dos péptidos não-fosforilados a partir de cada proteína foram utilizados como substitutos para calcular a abundância relativa das proteínas respectivas. Log

2 relações T /NT dos peptídeos não-fosforilados foram em média mais de três braços do fluxo de trabalho (IMAC, TiO

2, não-Enrich).

papéis funcionais de quatro proteínas na figura 4 (proteína de domínio LIM e SH3 1, moesina, Palladin, e PDZ e LIM proteína do domínio 7) já foram discutidos na tabela 2, mas alfa-actinina-4 (ACTN4) é uma proteína que se liga à actina com várias funções em diferentes tipos de células. Em células não musculares, encontra-se ao longo dos feixes microfilamentosas e aderentes do tipo junções, onde está envolvido na ligação da actina à membrana. Acredita-se a ser envolvidas em processos metastáticos como Li Fu et al [38] demonstraram que a sobre-expressão de ACTN4 em combinação com 67 LR está associada com a progressão esofágico carcinoma de células escamosas (CICAc). Eles demonstraram que ACTN4 foi expresso diferencialmente em tecido CICAc em comparação com tecidos normais, e que os níveis de expressão foram ACTN4 progressivamente aumentada de fase I a III. correlação clínico-patológico usando TMA revelou que a superexpressão de ACTN4 foi significativamente associada com estágio avançado do tumor (P = 2.6e-2) e metástases linfonodais (P = 4.9E-02) [38]. Plectina também tem sido proposta como um biomarcador do cancro, especialmente para cancro pancreático [39]. Embora, normalmente, uma proteína citoplasmática, plectina é expressa na membrana celular no adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) e pode, portanto, ser utilizados para direccionar células do PDAC [39]. Nosso estudo confirma que ambos os biomarcadores de câncer são significativamente mais expressa no tumor em comparação com o tecido não-tumoral em doentes com cancro pancreático (log mediana

2 T /NT = 0,29 e p-value = 3.33ee-02 para ACTN4 e log médio

2 T /NT = 0,32 e p-valor = 1.63E-03 para plectina).

Catenina é necessário para a formação de adesão célula-célula Delta-1 (adherens junções) através da sua interacção com a cauda citoplasmática de clássicos e tipo cadherins II. Catenina Delta-1 também modula as actividades da família Rho de GTPases RhoA (, Rac e Cdc42), sugerindo que, juntamente com outros substratos Src, catenina Delta-1 regula a dinâmica de actina. Assim, a delta-catenina 1 é o principal regulador da formação adherens junção, e provavelmente participa na regulação do equilíbrio entre o adesivo e fenótipos celulares motilidade [40]. Aqui observamos diminuiu significativamente os valores do catenina delta-1 em tumores comparada com o tecido não tumoral (log médio

2 T /NT = -0,29 e p-valor = 1.34E-02). Ao considerar o importante papel que catenina delta-1 desempenha na formação /manutenção de junções aderentes entre as células epiteliais, e considerando a diminuição observada na expressão e fosforilação desta proteína que sugere que estes acontecimentos podem contribuir para a dissociação das células epiteliais, portanto, epiteliais para mesenquimal . em câncer pancreático

de particular interesse é descobrir de que cadeia leve de miosina quinase (MLCK) é significativamente sobre-expressos em tumores em comparação com o tecido não-tumoral (log mediana

2 T /NT = 0,5 p value = 2.95E -02). MLCK é uma Ca

2 cinase de proteína + /dependente de calmodulina-que regula uma variedade de funções celulares, tais como, contracção muscular e a migração celular, através da fosforilação de proteínas da cadeia leve da miosina. Uma vez que a migração de células tumorais é um passo chave na disseminação do tumor, a miosina-quinase de cadeia leve (MLCK) pode ser considerada como um alvo terapêutico para a prevenção da disseminação do tumor. De facto, a activação e expressão MLCK foram encontrados para ser positivamente relacionada com a propensão metastática. Além disso, os inibidores da MLCK foram mostrados para diminuir a capacidade de invasão de células cancerígenas diferentes [41]. Curiosamente casos 14, 9, 4 e 13 têm níveis mais altos de MLCK e três dos quatro destes casos também demonstram recorrência muito cedo (2 meses, 5 meses, 10 meses, o mais longo, com 21 meses de reincidência, respectivamente) . Talvez esses quatro casos se beneficiariam de terapia com inibidor MLCK se estratificação dos pacientes foram baseados em alta expressão do alvo da droga no tumor versus não-tumor. Caso 10 apresentaram os menores níveis de MLCK em tumor comparação não-tumor correlacionando com este caso que mostra o tempo mais longo antes de recorrência de 31 meses. MLCK também desempenha um papel na sinalização de p38 MAPK uma via que demonstra um aumento da actividade em vários dos tumores neste estudo, como discutido mais tarde.

Observando o aumento da expressão da miosina no tecido tumoral, é também de particular interesse como MYH9 (log médio

2 T /NT = 0,29 e p-value = 5.93E-03), MYH10 (log mediana

2 T /NT = 0,23 e p-value = 2.18E-02), MYH14 (log médio

2 T /NT = 0,35 e p-valor = 2.03E-02) são todos miosinas celulares que são essenciais para a citocinese, a forma da célula, e funções especializadas, tais como a secreção e capeamento. Durante espalhando estas três células, desempenham um importante papel na reorganização do citoesqueleto, a formação de contactos focais (na parte central, mas não as margens de células espalhamento), e MYH10 induz extensão lamellipodial enquanto esta função é mecanicamente antagonizada por MYH9, que se acredita causar retração lamellipodial.