Abstract

A relação entre γ PPAR (

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) expressão e alterações epigenéticas que ocorrem na patogênese colorectal-câncer é em grande parte desconhecido. Nós investigamos se

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é epigenetically regulada no cancro colorectal (CRC) progressão.

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expressão foi avaliada em tecidos CRC e emparelhado mucosa normal por western blot e imunohistoquímica e relacionados a parâmetros e sobrevivência clinicopatológicas dos pacientes.

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metilação do promotor foi analisada por metilação específicas de-PCR e seqüenciamento bissulfito.

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expressão e de metilação do promotor foram igualmente examinada também em linhas celulares derivadas CRC. Cromatina imunoprecipitação em condições basais e após o tratamento epigenética foi realizada juntamente com experimentos bater-down de fatores reguladores putativos. A expressão de genes foi monitorizada por imunotransferência e ensaios funcionais de proliferação celular e capacidade invasiva. A metilação de uma região específica do promotor está fortemente correlacionado com

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falta de expressão em 30% de CRCs primários e com um mau prognóstico do paciente. Notavelmente, o mesmo padrão de metilação é encontrado em

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-negative linhas celulares de CRC. epigenética tratamento com 5′-aza-2′-desoxicitidina pode reverter esta condição e, em combinação com a tricostatina A, dramaticamente re-activa a transcrição de genes e a actividade do receptor. silenciamento transcricional é devido ao recrutamento de MeCP2, HDAC1 e EZH2 que conferir assinaturas cromatina repressivas determinantes potencial proliferativo e invasivo um aumento de células, características que podem ser revertidos experimentalmente. Nossos resultados fornecem uma nova visão mecanicista em silenciamento epigenético de

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no CRC que podem ser relevantes como um marcador de prognóstico da progressão do tumor

Citation:. Pancione M, Sabatino L, Fucci A, Carafa V, Nebbioso A, Forte N, et al. (2010) epigenética silenciamento de proliferador de peroxissoma-Activated Receptor γ é um biomarcador para cancro colorectal progressão e evolução dos pacientes adversos “. PLoS ONE 5 (12): e14229. doi: 10.1371 /journal.pone.0014229

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 10 de julho de 2010; Aceito: 09 de novembro de 2010; Publicação: 03 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 pancione et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiada por doações da AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Câncer) para VC e L.A .; UE projeto para a LA Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Receptores de peroxissoma proliferador-ativado (PPAR) são factores de transcrição dependente do ligando pertencentes ao receptor da hormona nuclear superfamília [1]. Três diferentes isoformas de PPAR, α, β e γ foram isolados até agora, cada uma com um padrão distinto de expressão de tecido e capacidade de interagir com diferentes classes de compostos. Especificamente, a isoforma PPAR está implicada numa ampla variedade de processos fisiológicos [2]: que integra o controlo de energia, de lípidos e homeostase da glicose e desempenha um papel crucial na adipogénese, a resposta inflamatória e diferenciação de muitas células epiteliais [3]. Consistentemente, variações em

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expressão de genes ou mutações têm sido associadas com a tumorigénese [4] – [6]. No entanto, resultados contraditórios têm sido relatados até agora, elevando a questão de saber se o PPARy facilita ou suprime tumorigénese [7], [8]. Recentemente, temos mostrado que o câncer colorretal esporádico (CRCs) apresentam níveis de expressão PPAR reduzidos são significativamente associados com pior prognóstico dos pacientes; no mesmo tipo de tumores,

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foi demonstrado ser um factor de risco independente [9], [10], o que sugere a possibilidade de atingir este gene com drogas para aplicações clínicas [10]. Os mecanismos moleculares subjacentes

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regulação da expressão na progressão CRC ainda são desconhecidas [9].

É cada vez mais claro que, além de alterações genéticas, modificações epigenéticas contribuir para Tumorigênese [11] . regulação epigenética envolve modificações hereditárias que não mudam as sequências de DNA, mas fornecem camadas “extra” de controle para regular a organização da cromatina ea expressão gênica [12]. metilação anormal do DNA em sequências ricas em CpG, também conhecido como “ilhas CpG”, localizadas nas regiões promotoras de cerca de metade dos genes conhecidos, leva ao silenciamento epigenético da expressão do gene [11], [12]. Em CRC, extensa metilação de ADN foi detectado em vários loci, especificamente as regiões promotoras dos genes supressores de tumor (TSG), uma característica de um subgrupo de tumores que apresentam o chamado “CpG island methylator fenótipo” (CIMP) [13] . Outros eventos epigenéticos, como modificações de histonas repressivas, cooperar para estabelecer o silenciamento do gene estável. Um “código de histona” tem sido sugerido para fornecer uma assinatura em resíduos de aminoácidos específicos que se correlaciona com a expressão do gene activo ou reprimida [11], [12]. A relação entre a metilação do DNA e modificações de histonas parece ser mediada por proteínas de ligação de ADN de CpG de metilo, um membro dos quais MeCP2 desempenha um papel importante para estabelecer esta interacção [14]. DNA regiões metiladas, geralmente enriquecido em histonas modificadas, gerar um cromatina mais apertada onde o acesso de fatores de transcrição específicos para os seus locais de ligação cognato é muito prejudicada [12]. Como a metilação do DNA e o padrão de modificações de histonas em regiões promotoras de genes específicos estão associados com a iniciação e progressão do cancro, em particular no CRC esporádica, permanece por esclarecer [15]. Neste relatório, analisamos de cem e cinquenta e dois CRCs primárias e emparelhado mucosa normal, a fim de correlacionar

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variações de expressão mediada por eventos epigenéticos com a progressão do tumor e sobrevida dos pacientes. Nós estendemos a análise para linhas celulares derivadas CRC como um sistema para investigar os mecanismos moleculares subjacentes

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silenciamento devido a variações epigenéticas.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of Fatebenefratelli Hospital em Benevento. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análise posterior.

amostras tumorais

Cento e cinquenta e dois pacientes diagnosticados primária esporádica CRC e tratados cirurgicamente no Departamento de Cirurgia, Fatebenefratelli Hospital, Benevento, Itália, entre 1999-2004, foram investigadas neste estudo. Cinquenta e dois casos compreendem ambas as amostras líquidas de azoto snap-congelados, obtidos imediatamente após a ressecção cirúrgica e blocos de parafina. Cada amostra foi combinada com a mucosa aparentemente normal adjacente (a 20 cm de distância da massa tumoral) removida durante a mesma cirurgia. Nenhum dos pacientes tinha um histórico familiar de disfunção intestinal ou CRC, tinham recebido quimioterapia ou radioterapia antes da ressecção nem tinha tomado medicamentos anti-inflamatórios não esteróides em uma base regular. tratamentos pós-operatórios convencionais foram fornecidos para todos os pacientes, dependendo da gravidade da doença. As características clínico-patológicas dos pacientes investigados são relatados (Tabela 1). O follow-up estava disponível para todos os pacientes, com duração pós-operatório médio de 59,5 ± 26,5 meses. comprimento total de sobrevivência foi calculada a partir da primeira cirurgia. Os pacientes foram acompanhados prospectivamente até a morte ou o seu exame médico mais recente.

linhas celulares e 5′-aza-2′-desoxicitidina e Trichostatin Um tratamento

linhas celulares derivadas

Doze CRC foram utilizado neste estudo e foram obtidas da ATCC e foram cultivadas como sugerido. Para a desmetilação de ADN, as células foram tratadas com 1 uM ou 5 5′-aza-2′-desoxicitidina (AZA) durante 72 hs ou 300 nM de Tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) durante 24 hs, sozinho ou em combinação. Após os tratamentos, as células foram colhidas para o DNA, o RNA ou extracção de proteína.

extracção do ADN, tratamento bissulfito, a análise de metilação e sequenciação

O ADN genómico foi isolado a partir de tecidos congelados ou a partir de amostras embebidas em parafina usando um procedimento padrão [6], ou o kit de tecido FFPE (56404, Qiagen, Hilden, Alemanha), respectivamente. Um? G de cada amostra de ADN foi bissulfito modificado de acordo com o protocolo do fabricante (59104, Qiagen, Hilden, Alemanha). Ambos universalmente não metilado (59665) e CpGenome ADN universal metilado (59655, Qiagen, Hilden, Alemanha) foram utilizados em cada reacção de controlo não metilado ou metilado, respectivamente. A busca por conteúdo CpG no

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promotor foi realizada utilizando o software Methprimer acordo com a definição ilha CpG. Os iniciadores de PCR para a metilação de PCR específica (MS-PCR) foram concebidos utilizando o software Metil Iniciador expresso V1. Ambos não metilado (U) e metilado (M) conjuntos específicos de iniciadores foram concebidos com base na cadeia positiva do ADN convertido pelo bissulfito cobrindo as ilhas de CpG dentro de

região promotora PPARG

. MS-reacções de PCR foram realizadas utilizando o kit de EM-PCR (Qiagen, 59305, Hilden, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. Os produtos de PCR foram carregadas em não desnaturante 3% de géis de agarose, corados com brometo de etídio e visualizados sob um transiluminador de UV. As sequências dos iniciadores estão listados (Tabela S1). sequenciação de bissulfito (BS) foi realizada automaticamente a cabo no produto de amplificação de PCR obtido utilizando um conjunto de iniciadores contendo locais de CpG dentro das suas sequências e concebido em bissulfito modificado ADN (Applied Biosystems, Applera, Foster City, EUA).

chip e ensaio MEDIP

ensaios chip e amplificação q-PCR (Biorad, Hercules, EUA) foram realizadas como descrito [16]. Os iniciadores utilizados estão descritos (Tabela S1). MEDIP ensaio foi levado a cabo tal como recomendado pelo fornecedor (Diagenode, Liège, Bélgica). Os anticorpos criados contra: AcH3K9, H3K4me3, HDAC1 e MeCP2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), H3K27me3, (Millipore, Billerica, EUA), ARN de pol II e pol P-ARN II (Covance, Dallas, EUA), ZAC e IgG purificada (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA) foram utilizados em ensaios de chip.

transferência de Western e análise imuno-histoquímica

análise de transferência de Western foi realizada em extractos proteicos a partir de tecidos tumorais e na mucosa normal adjacente tomadas durante cirurgia e celulares de CRC linhas, como descrito anteriormente [6], [9]. A análise imuno-histoquímica em tumores e mucosa não-neoplásica distante foi realizada como descrito [9]. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-PPARy (E-8), anti-ZAC (H-253), anti-ERK 1/2 (MK1) e anti-p-ERK (E-4) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA); anti-caderina-E (610405) (BD Transduction Laboratories, Lexington, EUA); anti-MeCP2 (ab55538), anti-HDAC1 (ab19845) (Abcam, Cambridge, Reino Unido); anti-EZH2 (4905) (Cell Signaling, Boston, EUA); anti-β-actina (A5441) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA).

ensaios MTT e apoptose

As células foram semeadas em triplicado em 24 ou 96 poços e as placas do ensaio MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante, a 0, 24, 48, 72 e 96 horas após a atingir a confluência, como indicado. As curvas de crescimento foram estabelecidos tendo em conta os resultados médios obtidos em três experiências independentes. Para analisar quimio-sensibilidade a células agonistas PPAR foram tratados com 5 troglitazona? M (TZD). Ensaio de apoptose foi realizada por análise de citometria de fluxo (FCA) utilizando coloração com iodeto de propídio (PI). Resumidamente, após a incubação com TZD, as células foram colhidas e fixadas em etanol a 70% arrefecido com gelo /PBS e armazenadas a 4 ° C durante a noite. As células suspensas foram então lavadas com PBS, incubadas numa solução de PI para 15 min. a 37 ° C e imediatamente analisado com um FAC fluxo varredura citômetro (Becton Dichinson, San Jose, EUA).

ensaios de migração e invasão

Para o ensaio de cicatrização, as células foram colocadas em placas e cultivadas até à confluência de 60 mm. Depois de um 6 hs inanição longo de soro, uma ferida foi feita usando uma ponta de micropipeta para raspar as células. motilidade celular foi estudada após 24 e 48 horas, após as células a partir de diferentes campos do microscópio. Finalmente, a área ferida correspondente a cada ponto de tempo foi digitalizado e quantificada usando Metamorph Imaging System Software versão 6.0 para Microsoft Windows. Uma percentagem média do fecho da ferida foi calculado a partir de três experiências independentes. Para determinar a capacidade de invasão de um ensaio Transwell foi levada a cabo utilizando uma inserção de cultura de células de 24 poços, de poro de 8 um (3097, Falcon Becton Dickinson, EUA). Após a hidratação do matrigel no compartimento superior, as células foram semeadas e incubadas. Vinte e quatro e quarenta e oito hs depois as células da superfície superior do filtro foram removidas com um cotonete de algodão; aqueles sob foram fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com 0,2% de violeta cristal e contadas. A quantificação foi obtida por contagem de pelo menos 10 campos de potência mais baixos a partir de três experiências independentes.

extracção de ARN e semi-quantitativa de transcrição reversa-PCR

O ARN total foi isolado a partir de linhas de células e tecidos com Trizol com pequenas modificações (Invitrogen de Carlsbad, EUA). transcrição reversa-PCR (RT-PCR) foi realizada usando Super-script II (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e amplificação por PCR utilizando iniciadores específicos para

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. As condições de RT-PCR e os iniciadores utilizados foram previamente relatado [5]. Em todas as reações de PCR,

GAPDH

serviu como um controlo interno para a normalização. Os produtos amplificados foram corridos num gel de agarose a 2% e corado com brometo de etídio.

Plasmídeos e transfecções

O PPRE-TK plasmídeo repórter de luciferase dirigido, pcDNA3 transportando o tipo selvagem

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ADNc e as condições de transfecção já foram descritos [6]. Para os ensaios de gene re-activação, as células foram semeadas em placas de 6 poços, tratadas com AZA e TSA por si só ou em combinação e transientemente transfectadas com o plasmídeo repórter. Após 12 Hs, 1 iM TZD ou o veículo isoladamente foram adicionados ao meio. Quando indicado, GW9662, um antagonista seletivo PPAR, foi usado.

siRNA

Um vector retroviral PSM2C (clone ID VH2-203345) que transporta um DNA curto hairpin (shRNA, número de catálogo RHS1764- 9494331) para o direccionamento do mRNA de PPARy foi usada. células HT29 foram estavelmente transfectadas com o vector de shRNA-PPARy e os clones positivos seleccionados usando 1