Abstract

ensaios de Fase III do crescimento anti-insulina como receptor do factor-1 (IGF1R) figitumumab anticorpo no cancro do pulmão de não pequenas células pacientes (NSCLC) foram interrompidas devido à falta de benefício de sobrevivência . Investigou-se a inibição do receptor de insulina altamente homóloga (IV) em adição ao IGF1R seria mais eficaz do que a inibição do IGF1R sozinho a prevenir a proliferação de células NSCLC. Sinalização através do IGF1R e IR no NSCLC linhas de células A549 e Hcc193 foi estimulado por uma combinação de IGF1, IGF2 e a insulina. Ele foi inibida por anticorpos que bloqueiam o ligando de ligação, αIR3 (IGF1R) e IR47-9 (IV), e por os inibidores de cinase ATP-competitivos molécula pequena de tirosina AZ12253801 e NVPAWD742 que inibem tirosina quinases tanto de RI e do IGF1R. O efeito dos inibidores foi determinado por um ensaio de proliferação independente de ancoragem e por análise da fosforilação de Akt. Em Hcc193 células a redução na proliferação celular e fosforilação de Akt devido ao anticorpo anti-IGF1R foi reforçada pela inibição mediada por anticorpos da IR enquanto que em células A549, com um IV relativamente baixos: razão de expressão do IGF1R, não foi. Em cada linha de células de proliferação e fosforilação de Akt foram mais eficazmente inibida por AZ12253801 e NVPAWD742 do que por combinada αIR3 e IR47-9. Quando o IGF1R sozinho é inibida, a sinalização desimpedido através do IR pode contribuir para a proliferação de células NSCLC continuou. Conclui-se que pequenas moléculas inibidoras de segmentação tanto o IR e do IGF1R mais eficazmente reduzir a proliferação de células NSCLC de uma forma independente do IR:. Relação de expressão do IGF1R, proporcionar uma base racional terapêutico para o tratamento desta doença

citação: Vincent EE, Elder DJE, Curwen J, Kilgour e, Hers I, tavare JM (2013) Segmentação células não-pequenas células do cancro do pulmão pela dupla inibição do receptor de insulina e a Insulin-like growth factor-1 Receptor. PLoS ONE 8 (6): e66963. doi: 10.1371 /journal.pone.0066963

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de fevereiro de 2013; Aceito: 14 de maio de 2013; Publicação: 24 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Vincent et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho descrito foi financiado por subvenções do Conselho de Investigação médica e da AstraZeneca para JMT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Jon Curwen e Elaine Kilgour, são funcionários da AstraZeneca e acções próprias em AstraZeneca. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

câncer

pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo com Non-Small-Cell Lung carcinoma (NSCLC), correspondendo a aproximadamente 80% de todos os casos. A taxa geral de sobrevivência de cinco anos na Europa é de 8% [1] e a sobrevida média após o diagnóstico é de 4-5 meses se não tratada [2]. quimioterapia padrão em NSCLC fase avançada fornece apenas uma melhora marginal na sobrevida global, no entanto inibidores da tirosina-cinase EGFR melhorar a sobrevida de pacientes portadores de mutações ativadoras no gene EGFR [3]. Outros alvos terapêuticos promissores em NSCLC incluem quinase anaplásico linfoma (ALK), desacetilação da histona (HDAC) e do sistema [4].

O sistema IGF desempenha um papel crucial na regulação IGF (fator de crescimento semelhante à insulina) do metabolismo energético e crescimento [5]. Existem dois receptores parentais no sistema do IGF que são activas na sinalização; o IGF1R e o receptor de insulina (IR), ambos os quais existem como homodímeros compreendendo dois receptores ‘meio’. Devido à elevada homologia de sequência em que também estão presentes como receptores híbridos formados por uma metade do receptor da insulina e um receptor de IGF1 metade em células que expressam ambos os genes de receptores de [6], [7]. O IR e o IGF1R são activados pela insulina e IGF-1, respectivamente, no entanto, um terceiro ligando, IGF-2, liga-se tanto o IGF1R e uma variante de splicing da chamada IR IR-A [8]. Um terceiro receptor, IGF2R, não tem propriedades de transdução de sinal conhecidas e serve como um receptor de eliminação para IGF-2 [9]. proteínas de ligação ao IGF (IGFBPs 1-6) também tem um papel importante a desempenhar na regulação da concentração de ligando livre e a exposição de um ligando ao seu receptor [10]. No soro, a maioria do IGF-1/2 de circulação é complexado com IGFBP3. Isto protege os factores de crescimento contra a degradação, mas também pode inibir a sua ligação aos receptores [11]. Quando activada por ligação do ligando dos receptores iniciam a transdução do sinal através da sua actividade de tirosina-quinase de cascatas a jusante, tais como o /RAF via de Ras /MAPK e PI3K /Akt. Estas vias são responsáveis ​​pela regulação processadores como o desenvolvimento fetal, o crescimento dos tecidos e no metabolismo [12].

Como um regulador central de crescimento e sobrevivência, a desregulamentação do sistema IGF é comum em cancro humano (revisto em [13 ]. o excesso de autócrino /produção parácrina de IGF-1 e IGF-2 e /ou baixos níveis de IGFBP3 estão associados com um risco aumentado de cancro de vários tipos de cancro incluindo cancro da mama [14], do endométrio [15] e na bexiga [16]. Os estudos nessa área têm investigado primariamente o papel do IGF1R. Inibição do IGF1R utilizando anticorpos inibidores resulta numa redução considerável na proliferação de linhas de células de tumor [17] e verificou-se ser hiperactiva em cancros incluindo próstata [18], da mama [19 ..], cólon [20] e do carcinoma da vesícula biliar [21] o corpo de evidência é tal que levou à investigação de inibidores de IGF1R em mais de 70 ensaios oncológicas [22] Estes inibidores caem em duas classes; anticorpos monoclonais segmentação o domínio extracelular e inibidores de tirosina-quinase de moléculas pequenas de ATP-competitivos concebidos para inibir selectivamente o IGF1R através da IR mas possuindo actividade contra ambos os receptores.

Preocupações que co-inibição do IV por pequenas moléculas inibidores de quinase IGF1R teria consequências metabólicas indesejáveis ​​levaram-se a anticorpos monoclonais IGF1R-selectiva sendo favorecido para o desenvolvimento e uso em ensaios clínicos. No entanto, tem sido conhecido durante algum tempo que a insulina pode estimular o crescimento de linhas celulares de cancro humano [23] – [26], e que 80% dos cancros da mama sobre-expressam o IV em comparação com o tecido normal da mama [27]. Além disso, a expressão da isoforma fetal da IV, IV-A, é elevada em várias malignidades humanas e, em contraste com os sinais mediados por RI-B, que têm um efeito predominantemente metabólica, IV-A tem um efeito predominantemente proliferativa [ ,,,0],28]. Zhang et ai demonstraram que a regulação negativa da IV inibiu a metástase de células do cancro da mama num modelo de ratinho atímico [29], e investigações recentes começaram a avaliar o benefício de dupla inibição do IGF1R e IR em modelos de osteossarcoma [30] e na carcinogênese neuroendócrina pancreática [31]. Em cada caso, a IV contribuiu para o efeito de sobrevivência de células do sistema de IGF e a progressão do tumor de vários estágios reforçada no sistema neuroendócrino pancreático. Estes estudos sugerem um papel para a IR na tumorigénese.

em NSCLC o envolvimento do sistema do IGF é suportada por uma série de estudos. O IGF1R é frequentemente expressa [32] – [34], e baixos níveis de IGFBP3 alta IGF-1 e estão associados com maior risco e aumento da gravidade do câncer de pulmão [35], [36]. IGF1 tem efeitos mitogénicos em algumas linhas celulares de NSCLC [37], [38], e IGF2 derivadas de fibroblastos promove o crescimento de células NSCLC in vivo [39]. Daí em NSCLC foi fundamentado que o IGF1R pode ser um alvo terapêutico viável. Num estudo de fase II de NSCLC avançado, o tratamento de primeira linha com o figitumumab IGF1R monoclonal completamente humanizado (CP-751,871) aumentou a taxa de resposta e benefício de sobrevivência livre de progressão de paclitaxel e carboplatina [40]. No entanto, a recente fase de NSCLC III ensaios testes figitumumab com quimioterapia ou o erlotinib inibidor EGFR foram suspensos devido à falta de benefício de sobrevivência [41]. Dada a evidência emergente para um papel de IR em outros tipos de tumores, é possível que esta ausência de benefícios clínicos da figitumumab em NSCLC foi devido, pelo menos em parte, a partir de sinalização desimpedido através da IR.

o presente estudo, nós determinamos se a sinalização através do IR suporta a proliferação de células do tumor de NSCLC, quando o IGF1R é inibida. Nós utilizamos anticorpos monoclonais neutralizantes que se ligam selectivamente ao IGF1R ou a IV para além de inibidores de moléculas pequenas de ATP-competitivos que inibem simultaneamente ambos os receptores. Esta abordagem também permitiu uma comparação das eficiências de anticorpos e inibidores de moléculas pequenas de segmentação do eixo de sinalização IGF na inibição da proliferação de células tumorais.

Materiais e Métodos

Materiais

AZ12253801 (Astra Zeneca, Macclesfield, Cheshire, Reino Unido), NVP-ADW742 (Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA) e Akti-1/2 (Merck, Darmstadt, Alemanha) foram feitas em DMSO (concentração final nas experiências foi de 0,5% ( v /v)). αIR3 (Merck Chemicals Ltd., Nottingham) e IR47-9 (gentilmente cedida por Ken Siddle (University of Cambridge, UK)) foram preparadas em PBS. De insulina (Sigma, Poole, Reino Unido), IGF1 (Gro-Pep, Adelaide, Austrália) e IGF2 (R D Systems, Abingdon, Reino Unido) foram tratados de acordo com as instruções do fabricante. Anticorpos: P-Akt S473 e IGFRβ foram adquiridos a partir de Cell Signaling Tecnologia (Boston, MA, EUA), IRβ da Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, EUA) e α-tubulina de Sigma. Donkey HRP-conjugado anti-rato IgG e anticorpos IgG anti-coelho eram de Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA).

Cultura celular e uso de Fator de Crescimento Combinações

células A549 eram de ATCC (Teddington, Reino Unido) e as células Hcc193 [42] – [44] eram um presente de Michael Seckl (imperial College, Londres). As linhas de células foram rotineiramente cultivadas em “meio de crescimento”, consistindo de DMEM (A549) ou RPMI (Hcc193) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS, Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 20,000 U /mL de penicilina, estreptomicina 7 mM e glutamina 200 mM. As linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada suplementada com 5% (v /v) CO

2.

Para a maioria dos ensaios descritos, as células foram expostas a uma combinação de 1 nM de insulina , 50 nM IGF1, 50 nM IGF2 (denominado ‘3GF’), a fim de representar melhor o microambiente do tumor. Aqui insulina e IGF são entregues pela circulação e também os IGFs são produzidos pelas células estromais de tumor e se a actuar de forma parácrina e autócrina. A concentração de IGF-1 e IGF2 em 3GF baseou-se que a encontrada em experiências preliminares para aumentar a proliferação celular em ensaios de crescimento independente de ancoragem, tendo simultaneamente em conta o aumento da biodisponibilidade de IGF no microambiente tumoral devido à produção local e para as proteases secretadas de tumor causando hidrólise de proteínas de ligação a IGF [5].

para avaliar o efeito de factores de crescimento e inibidores de Akt fosforilação e sobre a expressão do receptor, as células foram semeadas em placas de 12 poços experimentais para alcançar 90% de confluência após 24 h. As células foram incubadas com vários inibidores, durante 2 horas em meio isento de soro antes do tratamento com factores de crescimento durante 10 min. Após a incubação, a proteína foi extractada a partir de células como descrito anteriormente [45].

Anchorage-ensaio de crescimento independente

A partir de cultura de células aderentes foram tripsinizadas e passadas através de uma agulha de 18G para formar uma única célula suspensão. Estas células foram suspensas em 0,4% (w /v) de agar nobre em meio de crescimento contendo 0,1% (v /v) de FBS e 150μ ul da suspensão adicionados por cavidade de uma placa de 96 poços (Greiner Bio-One, células A549: 15000 células /cavidade, as células Hcc193: 25000 células /alvéolo) mais de um 40 camada de base ul solidificou de 0,6% (w /v) de agar. Sempre que necessário, os inibidores de factores de crescimento e foram adicionados às células no momento da suspensão na solução de meio de crescimento de ágar. As culturas em suspensão foram incubadas durante 5 dias, altura em que 10% em volume de azul de Alamar (Serotec, Kidlington, Reino Unido) foi adicionado aos poços e as culturas incubadas por mais 2-5 h. Metabolicamente activas células converter Azul de Alamar a um indicador fluorescente de modo que a quantificação de fluorescência é uma medida do número de células vivas. A fluorescência foi analisada usando um Perkin Elmer, leitor de placas de fusão com filtros de emissão de 544 nm de excitação e 590 nm.

Western blotting

NSCLC lisados ​​celulares (15 ug de proteína) foram submetidas a SDS-PAGE e transferência de western como previamente descrito [45]. Resumidamente, após a separação dos lisados ​​utilizando géis de gradiente de 4-12% Bis-Tris (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido), as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Hertfordshire, Reino Unido). As membranas foram incubadas com anticorpo primário (1 ug /ml) durante a noite antes da lavagem e incubação com os anticorpos secundários apropriados durante 1 h. Imunotransfer�cias foram visualizadas utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL; Amersham Biosciences). Todos os anticorpos primários utilizados aqui detectar uma banda proeminente com o peso molecular previsto da proteína é o anticorpo produzido contra. As imagens digitalizadas de imunotransfer�cias são cortadas para caracterizar a banda proeminente.

Análise Estatística

A significância estatística foi determinada por bicaudal não pareado

t

teste. p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

AZ12253801 Inibe Sinalização jusante do IGF1R e IR com potência igual ao passo que Inibitória anticorpos monoclonais (αIR3 e IR47-9) são específicos para o seu receptor alvo.

neste estudo foram utilizados os anticorpos inibidores monoclonais αIR3 e IR47-9, direcionados ao IGF1R [46] e IR [7], respectivamente, eo AZ12253801 inibidor da ATP competitiva pequena molécula quinase que tem uma actividade inibidora para com ambos os receptores . As experiências iniciais foram efectuadas para avaliar a eficácia e especificidade da αIR3, IR47-9 AZ12253801 e na linha de células NSCLC Hcc193. 24 horas após a sementeira, as células foram tratadas com αIR3, IR47-9 (0,5-10 ug /mL) ou AZ12253801 (2-100 nM) e depois estimuladas com factor de crescimento. Uma concentração baixa (5 nM) de factor de crescimento foi utilizado de modo que os factores activados apenas o seu receptor cognato. A fosforilação da cinase de serina /treonina a jusante, Akt, na serina-473 (S473) foi usada como uma medida da actividade de sinalização insulina e induzida por IGF-1.

A estimulação com insulina ou IGF-1 causou um aumento fosforilação de Akt em S473 (Figura 1A). O anticorpo monoclonal inibidor do IGF1R, αIR3, inibiu o IGF-1, mas não a insulina mediada por fosforilação de Akt. Por outro lado, o anticorpo monoclonal inibidora de IV, IR47-9, inibiu de insulina, mas não de IGF-1, mediada por fosforilação de Akt (Figura 1B). Isto confirmou que estes anticorpos inibem apenas os seus receptores respectivos, nas concentrações de anticorpos utilizados neste estudo. O tratamento com αIR3 reduziu o nível do IGF1R (Figura 1A, painel da mão direita), que é consistente com observações anteriores da linha de células MCF7 ([47]; Djee, EK, JMT observações não publicadas) expressão.

Hcc193 células foram tratadas quer αIR3 (a), IR47-9 (B) ou AZ12253801 (C) nas doses indicadas durante 2 h antes de 10 minutos de incubação com 5 nM de insulina ou 5 nM de IGF-1. A fosforilação de Akt em S473 e expressão de IGFRβ e IRβ foi determinada por transferência de Western utilizando anticorpos específicos. Um anticorpo anti-α tubulina foi utilizada como um controlo para a carga de proteína. Todos os anticorpos primários utilizados aqui detectar uma banda proeminente com o peso molecular previsto da proteína é o anticorpo produzido contra. As imagens digitalizadas de imunotransfer�cias são cortadas para caracterizar esta banda proeminente.

O pré-tratamento de células com AZ bloqueou a fosforilação de Akt insulina e induzida por IGF1 de uma forma dependente da dose e com potência similar (Figura 1C ). Ao contrário do pré-tratamento com anticorpos monoclonais inibidores, AZ12253801 (a 25 nM e acima) inibiu a fosforilação de Akt para níveis abaixo que em células não tratadas (Figura 1C). Nem αIR3 ou IR47-9 alcançado este mesmo na maior concentração usada (10 ug /ml) ou quando o tempo de pré-tratamento (a 2 ug /ml) foi estendido a 24 horas (Figura 1A, B e dados não mostrados). Em contraste com αIR3, AZ12253801 não diminuir o nível de expressão do IGF1R.

Combinada Inibição do IGF1R e bloqueia IR de Crescimento de Células de forma mais potente do que a inibição do IGF1R sozinho em células Hcc193

Para investigar uma possível contribuição do IR em apoiar a proliferação de células tumorais quando o IGF1R é inibida, as células Hcc193 NSCLC foram cultivadas sob condições independente de ancoragem, na presença de IGF1, IGF2 (em concentrações que activam simultaneamente ambos os receptores) e insulina (3GF, ver Materiais e métodos). , Isoladamente e em combinação, foram determinados os efeitos sobre a proliferação de inibir o IGF1R e do IR. Maximamente eficazes concentrações de inibidor foram seleccionados com base nos dados da Figura 1.

A Figura 2A ilustra os dados de proliferação de células em cultura Hcc193 independente de ancoragem. 3GF potenciou a proliferação de células Hcc193 1,6 vezes em comparação com a observada com apenas veículo. A inibição do IGF1R por αIR3 ou o IR por IR47-9 reduziu a proliferação observada na presença de 3GF (proliferação 3GF) até 22% (

P

0,0001) e 17% (

p

0,01), respectivamente. Bloqueando tanto o IGF1R e IR com αIR3 e IR47-9 resultou numa redução de 48% na proliferação 3GF, um efeito significativamente maior do que o obtido por meio do bloqueio de receptor quer sozinho (

P

1 × 10

-5 em cada caso). A constatação de que IR47-9 bloqueou a proliferação induzida por 3GF quer isoladamente ou em combinação com αIR3 sugere que o receptor da insulina é directamente capaz de promover a proliferação de células Hcc193.

Hcc193 células (A) foram cultivadas sob Anchorage- condições independentes em soro a 0,1% na presença de 3GF (1 nM de insulina, 50 nM de IGF-1, 50 nM de IGF-2) sozinho e em combinação com αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml) , αIR3 (2 ug /ml) e IR47-9 (2 ug /ml), e AZ12253801 (50 nM), como indicado. Após 5 dias as células viáveis ​​foram estimadas pela fluorescência do produto de redução metabólica de Alamar Blue. Cada barra representa a fluorescência média de quatro poços em duplicado ± o desvio padrão a partir de uma única experiência. Os resultados apresentados são representativos de 3 expericias independentes. ***,

p Art 1 × 10

-5; **,

p Art 0,0001; *,

p Art 0,01 (válido para todas as repetições); Bicaudal não pareado

t

teste. células (B) foram tratadas com Hcc193 αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) e IR47-9 (2 ug /ml), e AZ12253801 (50 nM) tal como indicado, durante 2 h antes de 10 min de incubação com o veículo ou 3GF. A fosforilação de Akt em S473 e expressão de IGFRβ e IRβ foi determinado por western blotting. Um anticorpo anti-α tubulina foi utilizada como um controlo para a carga de proteína. Todos os anticorpos primários utilizados aqui detectar uma banda proeminente com o peso molecular previsto da proteína é o anticorpo produzido contra. As imagens digitalizadas de imunotransfer�cias são cortadas para caracterizar esta banda proeminente.

bloqueio simultâneo do IGF1R e do IR usando AZ12253801 resultou em uma maior inibição da proliferação (75%) do que o obtido com αIR3 e IR47-9 em combinação (

p Art 1 × 10

-5) (Figura 2A). Isto pode ser explicado pelo aumento da eficácia na inibição da AZ12253801 induzida 3GF fosforilação de Akt (Figura 2B). Além disso, os anticorpos combinados foram mais eficazes na inibição da fosforilação de Akt do que era cada anticorpo sozinho (Figura 2B). Assim, o efeito dos inibidores sobre a fosforilação de Akt induzida por 3GF, quando adicionado por si só ou em combinação, em paralelo os seus efeitos sobre a proliferação induzida por 3GF.

A IGFR à RI Rácio de expressão pode prever a dependência de células na IR for Survival

a seguir, examinar se a expressão relativa de receptores IGF1R e IR afectou a capacidade de IR47-9 para inibir a proliferação de células tumorais ou a eficácia comparativa dos AZ12253801 e os anticorpos neutralizantes combinados. Para este fim uma outra linha de NSCLC, A549 foi usado, uma vez que expressa números aproximadamente iguais de IR como células Hcc193 mas significativamente mais do IGF1R, como determinado por Western blotting quantidades iguais de lisado (Figura 3A). A análise densitométrica indicaram que as células têm um Hcc193 IR:. relação de expressão do IGF1R -15 vezes a de células A549

(a) Comparação da expressão de IGF1Rβ e IRβ em Hcc193 e linhas de células A549 foi determinada por Western blotting usando 15 ug de proteína extraído de cada linha celular. (B) As células A549 foram cultivadas sob condições independente de ancoragem em 0,1% de soro, na presença de 3GF sozinho e em combinação com αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml ) e IR47-9 (2 ug /ml), e AZ12253801 (50 nM), como indicado. Após 5 dias as células viáveis ​​foram estimadas pela fluorescência do produto de redução metabólica de Alamar Blue. Cada barra representa a fluorescência média de quatro poços em duplicado ± o desvio padrão a partir de uma única experiência. Os resultados apresentados são representativos de 3 expericias independentes. ***,

p Art 1 × 10

-6; **,

p Art 0,0001; *,

p Art 0,05 (válido para todas as repetições); Bicaudal não pareado

t

teste. (C) As células A549 foram tratadas com αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) e IR47-9 (2 ug /ml), e AZ12253801 (50 nM) tal como indicado, durante 2 h antes de 10 min de incubação com o veículo ou 3GF. A fosforilação de Akt em S473 e expressão de IGFRβ e IRβ foi determinado por western blotting. Um anticorpo anti-α tubulina foi utilizada como um controlo para a carga de proteína. As imagens digitalizadas de imunotransfer�cias são cortadas para caracterizar a banda proeminente.

As células A549 foram cultivadas sob as condições descritas para Hcc193 (Figura 2). 3GF potenciou a proliferação de células A549 por duas vezes em relação ao observado para o controlo de veículo (Figura 3B). A inibição do IGF1R por αIR3 reduziu a proliferação estimulada por 3GF 40% (

P

1 × 10

-6) aproximadamente 2 vezes a redução observada em células Hcc193. Em contraste, a inibição do IV por IR47-9 teve um efeito modesto 3GF redução da proliferação em 10% (

P

0,05) e, ao contrário de com Hcc193 células, a presença de IR47-9 não conseguiu aumentar a efeito sobre a proliferação de αIR3 3GF (Figura 3B). Assim, em células A549 a IR é muito menos eficaz se a apoiar a proliferação independente de ancoragem do que é observado com células Hcc193. No entanto, como foi observado com as células Hcc193, o grau de inibição da proliferação de células A549 por AZ12253801 foi significativamente maior do que a observada na presença da combinação de anticorpos (p 0,0001; Figura 3B).

O efeito de os inibidores no ensaio A549 ancoragem-independente foi novamente consistente com o seu efeito sobre a fosforilação de Akt (Figura 3C); αIR3 inibiu a fosforilação de Akt induzida por 3GF, foi observado nenhum efeito adicional quando IR47-9 foi combinado com αIR3, e AZ12253801 foi mais eficaz do que αIR3 (ou combinado αIR3 e IR47-9). αIR3 causou uma redução na expressão de IGF1Rβ mas não da IRβ em células A549 (Figura 3C), como anteriormente observado em células Hcc193 (Figura 1 e 2).

efectiva inibição da proliferação celular por uma pequena molécula IR /IGF1R Inhibitor estruturalmente distintos para AZ12253801

em ambos Hcc193 e linhas de células A549 AZ12253801 tem um efeito inibitório maior sobre a proliferação independente de ancoragem do que combinado αIR3 e IR47-9. Para investigar se os inibidores de ATP-competitivo de IGF1R /IR fornecer um modo mais eficaz para inibir a proliferação do crescimento celular induzida por factor de anticorpos neutralizantes, o efeito de uma estruturalmente distinta de ATP-competitivo molécula pequena IGF1R inibidor /IR de NVP-ADW742 sobre o crescimento de Hcc193 e A549 também foi avaliada. dependente da dose, NVP-ADW742 reduzida 5 células de IGF-1 e 5 nM de fosforilação estimulada por insulina de Akt em Hcc193 e A549 nm com uma concentração eficaz máxima atingida em 1 uM (Figura 4A).

(A) e Hcc193 As células A549 foram tratados com NVP-ADW742 (0,1-3 uM), durante 2 h antes de 10 minutos de incubação com 5 nM de insulina ou 5 nM de IGF-1. A fosforilação de Akt em S473 foi determinado por western blotting. Um anticorpo anti-α tubulina foi utilizada como um controlo para a carga de proteína. Hcc193 células A549 e (B) foram cultivadas sob condições independente de ancoragem em 0,1% de soro, na presença de 3GF sozinho e em combinação com αIR3 (2 ug /ml) e IR47-9 (2 ug /ml), AZ12253801 (50 nM ), NVP-ADW742 (1 uM), ou Akti-1/2 (10 uM) como indicado. Após 5 dias as células viáveis ​​foram estimadas pela fluorescência do produto de redução metabólica de Alamar Blue. Cada barra representa a fluorescência média de quatro poços em duplicado ± o desvio padrão a partir de uma única experiência. Os resultados apresentados são representativos de 2 expericias independentes. ***,

p Art 0,001; ** P 0,01 (válido para cada experiência); Bicaudal não pareado

t

teste. células (C) Hcc193 e A549 foram tratadas com αIR3 (2 ug /ml) e IR47-9 (2 ug /ml) AZ12253801 (50 nM), NVP-ADW742 (1 uM) ou Akti (10 uM) como indicado por dois h antes de 10 min de incubação com o veículo ou 3GF. A fosforilação de Akt em S473 e expressão de IGFRβ e IRβ foi determinada por transferência de Western utilizando anticorpos específicos. Um anticorpo anti-α-tubulina foi utilizada como um controlo para a carga de proteína.

A Figura 4B ilustra a proliferação independente de ancoragem de células Hcc193 e A549, respectivamente, na presença de 3GF e o efeito de e αIR3 IR47-9, AZ12253801 e NVP-ADW742 em cima deste. NVP-ADW742 inibida induzida 3GF Hcc193 e a proliferação de células A549 para um grau semelhante à AZ12253801 e a um maior grau do que o observado com a combinação de αIR3 e IR47-9. Isto reflectiu-se no maior grau de inibição da fosforilação de Akt por inibidores de ATP-competitivos em comparação com αIR3 /IR47-9 (Figura 4C).

A estreita correlação entre o efeito de AZ12253801, NVP-ADW742, αIR3 e IR47-9 sobre a proliferação celular e na fosforilação de Akt sugeriu que a AKT pode contribuir para a proliferação estimulada por 3GF das células. Para explorar mais esta foi utilizado um inibidor alostérico selectiva de Akt, Akti-1/2 em células A549 e Hcc193. Akti-1/2 foi tão eficaz como AZ12253801 e NVP-ADW742 na inibição da proliferação independente de ancoragem de células (Figura 4B) e uma eficácia semelhante na inibição da fosforilação de Akt (Figura 4C). Este resultado é consistente com a mediação de Akt proliferação independente de ancoragem destas linhas celulares a jusante do IGF1R e IR.

Discussão

O IGF1-R tem um papel bem estabelecido na tumorigénese, no entanto, a recente falha do figitumumab anticorpo monoclonal IGF1-R em ensaios NSCLC questionou se segmentação esta via só irá levar a um benefício terapêutico. Algumas evidências sugere que a sinalização através do IR relacionados fornece um mecanismo pelo qual as células tumorais resistir aos efeitos de inibição de IGF1-R em osteossarcoma humano e cancro da mama. Consistente com isto, os nossos dados suportam um papel potencial para a IR na proliferação de linhas de células NSCLC com uma elevada RI: proporção do IGF1R. Além disso, proporcionam evidências de que o duplo bloqueio de IR e o IGF-1R usando uma pequena molécula inibidora IR /IGF-1R ATP-competitivo tem uma eficácia melhorada na inibição da proliferação de células NSCLC relativamente à obtida por inibição simultânea do IV e IGF1-R, usando anticorpos monoclonais selectivos.

consistente com o papel estabelecido de IGF1 para apoiar a proliferação de células de tumor [17], [30], [31], [38], [48], neutralizando bloqueio dirigido a anticorpo do IGF1 -R em cada uma das linhas celulares de NSCLC testados resultou em uma inibição parcial da proliferação (Figuras 2-4). As células A549 foram mais sensíveis que Hcc193 a este respeito, possivelmente reflectindo a expressão mais elevada de IGF1R em A549 e a resultante baixa RI: rácio expressão do IGF1R. bloqueio selectivo de IR utilizando um anticorpo específico também reduziu a proliferação em cada linha celular. Em células Hcc193, que têm uma relativamente elevada RI: rácio expressão do IGF1R, a extensão da redução foi semelhante ao provocado por inibição do IGF1R, mas em células A549 a redução na proliferação de bloqueio de IR foi marcadamente menos do que o observado em cima do IGF1R inibição. Estes resultados são consistentes com um relatório anterior que mostra que uma linha de células de cancro da mama com elevada RI: rácio expressão do IGF1R (MDAMB231) foi mais sensível ao bloqueio de IV do que uma linha de células com uma baixa RI: rácio expressão do IGF1R (MCF7) [31]. Supressão da expressão de IR pela interferência de ARN, também foi mostrado para inibir a proliferação celular, na medida em que isso ocorre varia com o tipo de célula e da natureza do ensaio de [29], [30]. Por conseguinte, o IR suporta a proliferação de células de tumor de vários tipos de células, independentemente do IGF1R, e temos aqui estendida estas observações a células NSCLC.

inibição combinada do IGF1R e IV com os anticorpos monoclonais na linha celular de proliferação Hcc193 reduzida para um grau maior do que a inibição de qualquer um dos receptores sozinho. Isto indica que em NSCLC de RI tem o potencial para contribuir para a resistência à inibição do IGF1R, apoiando a proliferação celular. Tal papel para a IR no contexto do IGF1R alvo tem sido demonstrada num modelo de ratinho transgénico da carcinogénese neuroendócrino do pâncreas e células de cancro da mama humano [31], e em linhas de células de osteossarcoma [30]. Em ambos os estudos IGF2, em vez de IGF1, foi definido como o factor de crescimento de sinalização através da IR para causar este efeito protumorigenic. Este também pode ser o caso em NSCLC IGF2, onde é conhecido para suportar o crescimento do tumor [39], [49]. Além disso, é possível que a própria insulina pode contribuir a este respeito, uma vez que tem propriedades mitogénicas bem estabelecida [23] – [26] e está incluído, com IGF1 e IGF2, no meio de crescimento no estudo corrente. O bloqueio do IR falhou para aumentar o efeito de inibição do IGF1R em células A549 o que sugere que nos casos de NSCLC onde as baixas proporções de IV: existem expressão do IGF1R, e quando as células são expostas a IGF1 para além IGF2 e insulina, co-orientadas para o IR não pode ser benéfico.

inibidores da quinase de tirosina Pequenos molécula, tais como AZ12253801, NVP-ADW742 e BMS754807 [50], [51] inibem tanto o IGF1R e o IR e, como tal, têm o potencial de ser mais agentes anti-neoplásicos eficazes do que os anticorpos contra o IGF1R. Com efeito, no presente estudo, o efeito da AZ12253801 em células Hcc193 era consistente com a de dupla IGF1R e bloqueio de IV por anticorpos, tal como a extensão da inibição da proliferação foi maior do que o observado em cima de bloqueio só o IGF1R.