Abstract
relacionada ao câncer e linfedema primário (LE) estão associados com a produção de tecido adiposo (AT). Nada se sabe, porém, sobre as moléculas à base de lípidos que compõem LE AT. Nós, portanto, analisadas moléculas lipídicas em lipoaspirates e soro obtidas a partir de pacientes com LE, e comparou-os a lipoaspirates de pacientes de cirurgia plástica e soro de controlo coorte saudável. LE análise soro do paciente demonstraram que os triglicerídeos, HDL e moléculas de LDL-colesterol e de transporte lipídico manteve-se dentro da normalidade, sem alterações em ácidos graxos individuais. A análise lipidomas também identificou 275 moléculas à base de lípidos, incluindo triacilglicerídeos, diacilglic�idos, ácidos graxos e fosfolipídios em óleo AT e gordura. Embora a maioria das moléculas de lípidos estavam presentes em uma abundância similar em LE e amostras não-le, existiam várias pequenas alterações: aumento C20: 5 triacilglic�idos contendo, reduzida C10: 0 e C24 caprinico: 1 ácidos nervonic. LE no óleo também continha uma assinatura de ácidos gordos do tipo ciclopropano aumentada e mediadores inflamatórios de ácido araquidónico e ceramidas. Curiosamente C20: 5 e C22: 6-3 do tipo omega lipídios são aumentados em LE AT, correlacionando-se com LE anos. Assim, a AT LE tem um perfil lipídico normal contendo uma assinatura de inflamação e de omega-3-lípidos. Ainda não está claro, no entanto, se essas diferenças refletem uma pequena escala distúrbio metabólico global ou efeitos dentro de focos inflamatórios localizados
Citation:. Sedger LM, Tull DL, McConville MJ, De Souza DP, Rupasinghe TWT, Williams SJ , et ai. (2016) lipidomas Profiling de tecido adiposo revela uma assinatura inflamatória em Câncer-relacionados e Linfedema Primário. PLoS ONE 11 (5): e0154650. doi: 10.1371 /journal.pone.0154650
editor: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, BRASIL
Recebido: 26 de fevereiro de 2016; Aceito: 15 de abril de 2016; Publicado em: 16 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Sedger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Os detalhes específicos de indivíduos dentro do paciente e normais coortes doadores são armazenados de acordo com as Diretrizes australianos Pesquisa Nacional de Saúde e Medicina para o exercício responsável da Investigação e as orientações do Comité de Investigação Humana Institucional
Financiamento:. A pesquisa foi financiada pelo Programa de linfedema, Faculdade de Medicina Ciências da Saúde, Universidade Macquarie. O financiamento concedido ao JB
Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Abreviaturas:.. AT, tecido adiposo; IMC, índice de massa corporal; Cer, ceramida; CE, éster do colesterol; DAG, diacylglyceride; GC, cromatografia em fase gasosa; HexCer, hexa-ceramida; HDL, lipoproteína de alta densidade; LE, linfedema; LC, cromatografia líquida; LDL, lipoproteína de baixa densidade; LPC, liso-fosfatidilcolina; LPE, liso-fosf; PBQC, reunidos controle de qualidade biológica; PC, fosfatidilcolina; PCA, análise de componentes principais; PE, fosfatidiletanolamina; MS, espectrometria de massa; SM, esfingomielina; TAG, triacilglicerídeos; VLDL, lipoproteínas de densidade muito baixa
Introdução
O linfedema (LE) é uma condição onde o fluido linfático se acumula dentro dos tecidos intersticiais que causam inchaço. Nos países desenvolvidos LE maioria das vezes ocorre como consequência de, ou “secundária a”, o tratamento para o câncer. Os pacientes com câncer com maior risco de desenvolver câncer relacionado LE incluem pacientes com câncer de mama que necessitam de linfa encenação nó ou tratamento (biópsia de linfonodo sentinela mais /menos dissecção e /ou radioterapia axilar, e muitas vezes com quimioterapia) devido à metástase do câncer [1]. Na verdade estimativas conservadoras sugerem que até 28% dos pacientes em países desenvolvidos irão desenvolver braço LE posterior ao seu tratamento de câncer de mama [1]. Da mesma forma, até 75% dos pacientes com câncer de cabeça e pescoço pode desenvolver garganta, facial, pescoço ou LE interno [2] e um terço dos pacientes com câncer pélvico irá desenvolver membro inferior LE dentro de 1 ano da cirurgia [3]. Assim, LE relacionada ao câncer é amplamente aceito como uma das complicações mais frequentes de longo prazo do tratamento do câncer. LE primária também pode ocorrer de forma espontânea, geralmente apresentando primeiro durante a infância, e muitas vezes com uma origem genética [4] ou resultantes de lesões de tecido-não-relacionadas com o cancro. Daí LE ocorre devido à drenagem linfática comprometida que podem ser diretamente causada por, ou contribuído para, por lesão ou alterações genéticas que levam a defeitos de biogênese de vasos linfáticos ou malformações na formação da válvula de vasos linfáticos e redução da função linfática [4]. Infelizmente, não há atualmente nenhuma cura para qualquer LE primária ou secundária (cancro-relacionada). Assim, LE é uma condição crônica que os impactos sobre a capacidade de uma pessoa a viver uma vida normal, porque a condição tende a agravar-se ao longo do tempo e desfiguração física e impactos incapacidade funcional na qualidade de vida [5,6].
One dos principais problemas associados com LE crónica é que os tecidos afectados frequentemente consolidar-se com o tecido adiposo (TA) [7,8]. Quando isso ocorre respeito aos tratamentos convencionais que compreendem compressão, bandagem e massagem vezes diminui à medida que se torna evidente que eles não podem reduzir a LE-associado AT que, em seguida, predomina dentro da área afetada. Felizmente, existe uma opção de tratamento cirúrgico para as pessoas que vivem com o avançado AT rich LE: cirurgia de lipoaspiração [9-12], que remove fisicamente o AT que predomina a área afetada [7,8]. Embora este tratamento é altamente benéfico para pacientes com LE, imediatamente reduzir o tamanho do membro afectado LE, as razões para a produção de OE a ainda estão a emergir e a patologia LE está compreendida de forma incompleta [13]. Assim, embora seja claro que a adipogénese normalmente envolve citoquinas, hormonas, factores de transcrição, e que miARNs temporalmente regulam a expressão do gene para conduzir a maturação de pré-adipócitos em adipócitos maduros contendo lípidos [14,15], mas muito pouco se sabe sobre a adipogênese dentro do próprio LE AT. Nada é conhecido, por exemplo, sobre os tipos de moléculas à base de lipidos que são produzidos pelos adipócitos tecido LE. Curiosamente, a AT é realmente essencial para o sistema imunológico dos mamíferos e, de fato, os gânglios linfáticos, normalmente existem em estreita associação física com a AT, em que a lipólise libera ácidos graxos livres e de lipídios-mediadores que as células de combustível do sistema imunológico [16]. Além disso, enquanto o colesterol é normalmente transportado no sangue através de lipoproteinas, quer como cholymicrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), intermediário ou lipoproteínas de alta densidade (HDL), transporte de lípidos para trás a partir de células e tecidos para o fígado ocorre através de HDL e linfa de um processo conhecido como o transporte reverso do colesterol [16]. Aqui, efluxo de colesterol celular é lançado para o espaço intracelular que as ações combinadas de transportadores ABC, limpador receptor-B1, CYP27A1, caveolin, ou difusão passiva (cada mecanismo varia dependendo em parte do tipo de célula) [17], onde é em última análise, removidas por HDL e traficado para trás do interstício através dos vasos linfáticos (para uma revisão recente, ver [18]). Assim, o transporte lipídico é necessariamente parte integrante LE porque a drenagem linfática é alterada quando os linfonodos são removidos, ou quando os vasos e válvulas linfáticos estão danificados ou mau funcionamento. transporte reverso de colesterol Com efeito, estudos recentes em animais sugerem baseada auditivos ocorre em murino induzida experimentalmente LE [19]. Se existem defeitos de transporte reverso de colesterol em LE humana, em seguida, na medida em que o metabolismo dos lípidos é alterada ou desequilibradas não são claras. Assim, também, pouco se sabe sobre as consequências da LE crônica inchaço no nível de lipídeo soro e lipoproteínas associadas a lipídicas em LE humano. Portanto, para começar a entender melhor o pathobiology da produção AT LE avançada examinamos os lipídeos séricos e experimentalmente gerado o primeiro AT perfil lipídico de pacientes com LE relacionadas com o cancro avançado e comparou-os com soro normal, e braço e perna anatomicamente normais pareados , non-LE, AT.
Materiais e Métodos
Human Ética em Pesquisa Aprovação
Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Universidade de Macquarie (HREC) antes a sua iniciação. Todos os elementos do estudo foram posteriormente conduzidas de acordo com o HREC aprovado protocolos, de modo que todos os doadores de tecidos normais e pacientes com LE, doou seu sangue e AT amostras de lipoaspiração, voluntariamente e com consentimento informado por escrito.
Paciente e Saudável participantes de controle estudar critérios de inclusão
Todos os pacientes com LE (n = 15, Tabela 1) foram buscar avaliação médica e tratamento para membro avançada LE na Clínica de avaliação avançada Linfedema no Hospital da Universidade Macquarie. Estes pacientes geralmente apresentadas com uma diferença de volume de membros de, pelo menos, 20-25% e são oferecidos cirurgia lipoaspiração com base na presença de LE-AT associada, conforme determinado principalmente por uma apresentação LE “não-pitting” [8,20] e confirmada por ressonância magnética [9]. Assim, a cirurgia de lipoaspiração é uma opção de tratamento para pacientes que sofreram benefício insignificante recente dos tratamentos LE convencionais devido ao acúmulo consolidado de quantidades substanciais de AT. Para efeitos de comparação com o tecido normal também obtido braço humano saudável e perna (membro) a (n = 7; Tabela 1). Este tecido foi obtido a partir de pacientes de cirurgia plástica que optaram por cirurgia de lipoaspiração em uma clínica de cirurgia estética privada Melbourne por motivos pessoais não declaradas. Uma imagem de exemplo do membro do paciente e o LE LE LE e não-lipoasparates é mostrado (Figura 1). Todos os pacientes com LE e doadores saudáveis também forneceu suas medidas de peso e altura, que foram utilizados para calcular o índice de massa corporal do indivíduo (IMC) e, assim, para permitir a identificação e exclusão de participantes do estudo que poderiam de outra forma não ser classificados como tendo um ‘IMC normal ‘, que de acordo com a escala de classificação da Fundação do coração da Austrália do (https://heartfoundation.org.au/). Assim, todos os participantes do estudo foram normais IMC normal (15 25), com exceção de dois pacientes com LE que tiveram um índice de pré-cirurgia de massa corporal (IMC) 30 kg /m
2. No entanto, esses dois pacientes com LE não foram consideradas obesas porque o IMC de um paciente voltou a 30 kg /m
2 rapidamente após lipoaspiração membro, eo outro tem de perna primário LE afetando ambos os membros ou seja, claramente esses pacientes dados pré-cirúrgicos refletida seus membros lymphedematous em vez de uma condição de obesidade corporal generalizada. Foi também evidente que vários indivíduos em ambos LE e coortes não-le eram “saudável, mas o excesso de peso” (IMC = 25-29) consistente com muitos dados demográficos dos países ocidentais atuais (dados individuais não mostrados). A análise estatística dos dados das características de coorte, especificamente idade, sexo e IMC, foi realizada por meio de um teste t de Student padrão com nenhuma suposição de normalidade de distribuição de dados tendo em conta os relativamente pequenos tamanhos de amostra (Tabela 1).
(A ) braço esquerdo LE, (B) Esquerda perna LE, (C) LE AT lipoaspiração aspirado e (D) normal não-LE (cirurgia plástica) AT aspirado de lipoaspiração, mostrando presença de óleo líquido (óleo) e de gordura sólida (FAT). Também evidente é a camada aquosa da solução salina lavar dentro do aspirado de cirurgia estética.
recolha de amostras e processamento de tecidos
cirurgia de lipoaspiração para LE foi realizada sob anestesia geral relacionada ao câncer anestesia no Hospital da Universidade Macquarie pelo autor TL que foi especialmente treinado pelo professor Brorson e Professor Munnoch, que desenvolveram o que é agora um procedimento bem estabelecido para LE avançada [10-12,21]. A cirurgia foi realizada sobre os braços e as pernas (FIG 1A e 1B) LE-afectados após a aplicação de um torniquete. Resumidamente, subcutânea foi removido através de múltiplas pequenas incisões localizadas ao longo do comprimento do membro afectado, através de uma cânula Helixed Tri Porto III (normalmente 22-30 cm de comprimento e 4-5 mm de largura) ligado a uma bomba de vácuo [9]; o mesmo procedimento já foi empregada com sucesso internacionalmente por mais de uma década [10-12]. O braço ou perna extraída LE lipoaspirado AT (Figura 1C) foi imediatamente transportado para a Faculdade de Medicina e de saúde Research Laboratories, processado tal como descrito abaixo e armazenado a -80 ° C em um banco à Amostra gerado pelo LMS. membro humano saudável (braço ou perna) AT foi coletado com o consentimento informado do doador, em uma clínica de cirurgia estética particular, o Dr. Lanzer Clinic, Melbourne, a partir de clientes que optaram por submeter a uma cirurgia de lipoaspiração. Resumidamente, um tecido de lipo-aspirado saudável (Figura 1D) foi obtido por procedimentos convencionais de cirurgia plástica, sob anestesia geral. Após pequenas incisões foram feitas, a área circundante foi preenchido com fluido tumescente Klein usando agulha de calibre 20, antes de aplicar sucção e posterior extração do AT através de um calibre 14 Klein microcânula da variedade capastrano [22]. pacientes de cirurgia de lipoaspiração cosméticos em seguida, usar uma pasta de compressão continuamente por aproximadamente 2 semanas, em seguida, de forma intermitente para duas semanas de pós-operatório, a fim de minimizar a possibilidade de eventos adversos ou complicações pós-cirúrgicas [23].
O LE e normal (cosmético) cirurgia lipoaspiração AT lipoaspirates (Fig 1C e 1D) foram vertidas em vários tubos de 50 ml Falcon e centrifugou-se a aproximadamente 350 g durante 5 minutos para separar o “óleo gordo” líquido a partir dos adipócitos com iE intactas intactas sólidos de outra forma referidos aqui como AT “gordo”. Os componentes dos tecidos subjacentes aquosas restantes também foram recolhidas, e o sedimento de eritrócitos de sangue foi rejeitado. Após centrifugação, o óleo foi removido e guardado congelado a -80 ° C. Em seguida, os adipócitos, intactas e as camadas aquosas, foram cuidadosamente removidas, separadamente, e de forma semelhante colocada em tubos separados e imediatamente congelado também a -80 ° C. Assim, os componentes de tecidos foram armazenados no momento de sua coleção cirúrgica durante um período de 12-18 meses através até que um único descongelamento para análise laboratorial posterior.
Amostras de sangue periférico foram coletadas de pacientes com LE usando tanto SST-II e tubos K
2EDTA coleção vacutainer imediatamente antes da anestesia para cirurgia de lipoaspiração. O sangue periférico também foi obtido a partir de idade saudáveis não-relacionadas e sexo correspondentes dadores (n = 13; Tabela 1) por punção venosa padrão de veias periféricas, realizadas por flebotomistas treinados. Todos os pacientes com LE e doadores saudáveis eles eram “jejum” e “descansando”; eles consumiram nenhum alimento e não se exercitar por pelo menos 8-10 horas antes da punção venosa ou na coleção por cirurgia de lipoaspiração. Amostras de sangue periférico foram centrifugadas durante 10 minutos e o soro (e plasma) camadas removidas, alíquotas, então congeladas até que um único descongelamento para análise laboratorial.
análise bioquímica Automatizado de lipídios totais séricos
lipídios totais no soro foram medidos como se segue: colesterol foi medida com um ensaio de colesterol enzimático (Abbott), triglicéridos com um ensaio de glicerol fosfatase oxidase de base (Abbott), e níveis de HDL-colesterol com o acelerador ultra HDL ensaio detergente selectivo (Abbot) e analisados em um instrumento Architect c16000 Abbott em Douglas Hanly Moir Patologia, Macquarie Park, Sydney. Os níveis de colesterol LDL foram calculados como se segue: LDL-colesterol HDL-colesterol = (0,45 x triglicéridos), o que é essencialmente similar a ambos os formuli Friedewald e Amhadi [24,25]. A apolipoproteína-A1 e os níveis séricos -B foram determinadas por ensaios imunoturbidimétricos tina-Quant Apolipoproteína A-1 Ver 2 e apolipoproteínas B Ver 2 (Roche), utilizando o Roche Integra 800 analisador no Sullivan e Nicolaides Laboratório em Brisbane, Austrália. O intervalo normal geralmente aceite destas moléculas no soro humano é observado juntamente com os dados.
Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa (GC-MS) A análise de ácidos gordos
AT amostras de aproximadamente 50 mg foram extraiu-se com 1 mL de clorofórmio: metanol (2: 1 v /v) por incubação num termomisturador (Eppendorf) durante 10 min a 30 ° C, e depois centrifugada a 18000g durante 5 min a 4 ° C. Uma alíquota de 50 ul do sobrenadante de cada amostra foi também combinado para criar um controlo de qualidade biológica reunida (PBQC). As amostras individuais e PBQC (5 ul) foram transferidos para um dispositivo de vidro ao qual se adicionaram 40 ul de padrões internos: clorofórmio: metanol (2: 1 v /v) contendo 62,5 uM de cada um de
13C
18-estearato e
13 C
2-miristato. padrões de ácido gordo de cadeia linear (Sigma) (25 uM) e os padrões de ácidos gordos de cadeia ramificada de monometilo e de tipo ciclopropano (25 uM) foram sintetizados internamente como descrito anteriormente [26,27] e preparados em clorofórmio: metanol (2: 1). Inserções contendo AT amostras ea PBQC foram seladas em frascos de GC e transesterificado para criar ésteres metílicos de ácidos graxos. Para esta amostras foram misturados com 5 ul Methprep-II (Alltech), utilizando um amostrador automático robô Gerstel MPS2, incubadas durante 30 min a 37 ° C com agitação lenta para a mistura. A análise de ácidos gordos foi realizada num cromatógrafo de gás Agilent 7890 acoplado a um detector selectivo de massa 5975. As amostras (2 ul) foram injectados no modo de divisão (10: 1) a uma entrada regulada para 250 ° C e separação cromatográfica foi conseguida numa coluna SGE BPX70 (60 m x 0,25 milímetros de diâmetro interno x 0,25 um de densidade de película). As condições do forno foi de 70 ° C durante 1 min, depois 40 ° C /minuto até 150 ° C, 4 ° C /minuto até 200 ° C, 3 ° C /minuto até 220 ° C, 4 ° C /min até 250 ° C e depois mantida a 250 ° C durante 4 minutos. fluxo de gás transportador hélio foi constante a 1,5 ml /min e a linha de transferência MS foi fixada em 280 ° C. Os compostos foram ionizados usando fragmentação impacto de electrões (-70eV) e espectro de massa recolhidos ao longo da faixa /z 50-450 m em 3,6 varreduras /segundo.
Líquido Espectrometria de cromatografia de massa (LC-MS) análise dos lípidos
análise de lípidos de LC-MS foi realizada essencialmente de acordo com métodos convencionais descritos previamente para lípidos no sangue [28]. Resumidamente, a gordura de óleo (~ 50 mg de “óleo”) e sólido-gordura (~ 50 mg “gordo”), as amostras foram extraídas com 1 ml de clorofórmio: metanol (2: 1, v /v) contendo o padrão interno de 5 uM C17 : 0 LPC durante 1 h à TA. Os extractos foram centrifugados a 18000 g durante 10 minutos a 4 ° C (refrigerado numa microcentrífuga) e os sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo. O pelete foi re-extraída com clorofórmio 500 ul: metanol (2: 1, v /v), centrifugou-se como descrito acima e os sobrenadantes combinados. Os extractos de gordura de óleo e sólido em gordura foram secos sob azoto gasoso, em seguida, ressuspensas em 100 ul butanol: metanol (1: 1) contendo formato de amónio 5 mM (Sigma). Os lipidos foram analisados usando uma cromatografia líquida Agilent 1200 sistema (LC) e Triplo Quadrupolo 6460 espectrómetro de massa (MS). Resumidamente, os lípidos foram separados através da injecção de 5 ul da amostra num 50 mm x 2,1 milímetros x 2,7 um Ascentis expresso RP-amida coluna (Supelco), seguido por eluição a um caudal de 0,2 ml /min ao longo de um gradiente de 5 min de água /metanol /tetra-hidrofurano (50:20:30, v /v /v) de água /metanol /tetra-hidrofurano (5:20:75, v /v /v) com o tampão final realizada durante 3 min. Os lípidos foram identificados por espectrometria de massa de electrospray de ionização através de um método que foi optimizado utilizando um painel de padrões autênticos lipídicas. identificação lipídico foi realizada utilizando duas funções de digitalização disponíveis em massa espectrômetro de triple-quadruple, uma varredura precursor e verificação de perda neutra. Ambos os exames são perfis de identificação de massas precursoras das espécies de lípidos com base no m /z do fragmento do grupo de cabeça. Fosfatidilcolinas (PC) e esfingomielinas (SM) foram identificados por varredura de precursores de 184,1 m /z, enquanto ceramidas (CER), ésteres de colesterol (CE) e fosfatidilglicer�s (PG) foram identificados por varredura de precursores de 264,6, 369,4 e 189 m /Z, respectivamente, todos no modo MS positivo. Fosfatidiletanolaminas (PE) foram identificados por varredura para perda neutra 141 m /z no modo de MS positiva. Diacilglicerol (DAG) e triacilglicerol (TAG) foram identificados utilizando varreduras de perda de neutros de possíveis porções de ácidos graxos. Assim, as identificações de lipídios são putativa e a maioria não foram validados por outros meios. Lipídios foram quantificados usando o monitoramento de reações múltiplas com tensão capilar 4000V, tensão Fragmentor 140-380 V, energia de colisão 15-60 V e gás de colisão (azoto), a 7 L /min. A quantificação foi baseada em mudanças relativas em áreas de pico
manipulação de dados e análise estatística
de cadeia reta espécies lipídicas são uniformemente refered através da Cx:. Y nomenclatura que se refere ao número total de carbonos (X) e o número de ligações duplas (y) do lípido. Por exemplo, éster de colesterol CE (14: 1) tem 14 carbonos e 1 ligação dupla nota que a posição da ligação dupla não está definido. ácidos ramificados estudos gordos de cadeia incluem acidsm iso-gordo contendo um grupo metilo no carbono penúltimo. Assim, iso-C15: 0 refere-se ao ácido 13-methylmyristic. ácidos graxos ciclopropano estudados incluem cis-9,10-methylenehexadecanoic ácido (MHA), ácido dihyrosterculic (DHS) e ácido lactobacillic (LBA). A nomenclatura lipídico e classificação está de acordo com que, em LIPD MAPS https://www.lipids.org. Ambos os dados GC e LC-MS foi processado usando Agilent Mass Hunter Quantitative Software (B.06.00). Os dados brutos que indicam abundância relativa (área sob a curva) foi analisada em Microsoft Excel (versão 14.5.9 para Mac OS), calculando média, desvio padrão (SD) e mediana para LE ou dados de coorte normais. Os dados em bruto foi primeiro log transformado, em seguida, ajustado pela normalização mediana (x /mediana) [29], onde o valor médio determinado como individualmente para cada classe de lípidos incluídos no estudo (por exemplo, ácidos gordos, DAG, TAG, CE, PE /LPE , SM, Cer, etc), a fim de explicar a natureza heteroscedástico de dados metabolômicos. Onde um lípido não detectado foi um valor zero foi substituído por “0” ou “1” para permitir análises a jusante (dados brutos, células em caixas de dados complementar). Meios e SD foram novamente calculadas desta vez do log transformado dados medianos normalizada e as diferenças significativas entre LE contra normal em amostras, avaliadas para cada espécie de lipídios, identificada por meio do teste t de Student não pareado uma de duas caudas; significância estatística p 0,05, sem hipóteses de distribuição de dados (normalidade). -Global mediana dados normalizados foram também analisadas independentemente para permitir uma análise de componentes principais (PCA) que avaliou as diferenças globais entre todos os metabolitos em cada um dos grupos de amostras em simultâneo; as APC foram realizados utilizando o software R e os resultados podem ser encontrados em S1 fig. Os dados foram, adicionalmente, examinadas para identificar potenciais falsos descobertas utilizando o método de correcção de Benjamini-Hochberg [30]. Finalmente, os dados foram analisados por correlação com LE anos pelo método de correlação de Pearson utilizando Graphpad PRISM (versão 60f para Mac OS X), com o correspondente R
2 valores tabelados em conjunto com
p Art 0,05 como um indicador de significância. Os dados foram representados graficamente com figuras PRISM e multicomponentes de dados foram construídos em Canvas Tração 2 (versão 1.01) para Mac OS.
Resultados
lipídeos séricos totais em avançado LE
Para determinar se houve qualquer desequilíbrio metabólico à base de lipídios sistémico associado com o membro AT deposição em crônica avançada LE, 15 LE paciente soros (Tabela 1) foram analisados para o total de níveis circulantes de colesterol e triglicérides, e comparou 13 sexo- saudável normal combinado relacionada ao câncer soro a partir de dadores saudáveis. Os níveis séricos destas moléculas eram altamente semelhantes em pacientes com LE como estava presente em saudáveis, não-LE, doadores de sangue, e ambos os grupos continha vários indivíduos com hipercolesterolemia ou seja, indivíduos com níveis de colesterol acima dos níveis recomendados para indivíduos saudáveis, ou seja, acima do “normal gama “(Figura 2A). Apesar destas semelhanças, os níveis de HDL-colesterol no soro foram encontrados a ser menor (estatisticamente significativa, p = 0,0340) em pacientes com LE em comparação com as amostras de dadores saudáveis coorte, ainda que estas amostras ainda estavam dentro do intervalo normal (Figura 2A). Os níveis de colesterol LDL calculados também foram semelhantes entre o LE e amostras de coorte normais (Fig 2A), assim como as moléculas de transporte de lipídeos séricos, apolipoproteína A1 e apolipoproteína B (Fig 2B). Assim, a abundância de lipídios totais e moléculas de lipídios-transporte não sofre grande alteração no LE em comparação com dadores normais e dentro da faixa normal para adultos saudáveis relacionadas com o cancro.
parcelas avançados (A) da caixa e suiça de total de colesterol no soro, triglicéridos, HDL-colesterol e calculado LDL-colesterol, e (B) de soro de lipoproteína total apoproteína A1 e apolipoproteína B, a partir de LE paciente (n = 15) e coorte normais (n = 11) amostras de sangue periférico. A linha de dentro de cada caixa indica o valor médio global, calculado a partir da coorte. A escala normal geralmente aceite população (NR) é mostrado dentro de cada gráfico (linha vertical, lado direito). A significância estatística (
p valor
) entre LE e normal (não-LE) também são mostrados, como determinado pelo bi-caudal t-teste, não assumindo igual variância.
Serum lipidomas de Le pacientes
Uma vez que estes ensaios laboratoriais de rotina de diagnóstico rápido não fornecem informações sobre o tipo ou a abundância de espécies de lipídios indivíduo, 7 amostras de pacientes LE aleatoriamente escolhidas e 3 amostras “normais” (saudáveis) de soro de doadores foram ainda analisados por espectrometria de massa por cromatograf ia gasosa (GC-MS). Isto permitiu a identificação molecular específica de alguns ácidos gordos no soro 31 humano, incluindo ácidos gordos de cadeia ramificada-4, este último não frequentemente analisada em outras publicações que investigam os lípidos do soro. No entanto, e de acordo com o total dos níveis de lípidos no soro, sem ácidos graxos séricos individuais foram encontrados para estar presente no soro do paciente LE com uma abundância alterada do que estava presente no “controle” saudável (-LE não) de soro de coorte (dados agora apresentados; S1 Arquivo de dados; Sheet “soro”). Uma análise de componentes principais (PCA) foi também realizada, mas, tal como esperado, não há diferenças globais significativas foram evidentes entre o LE e amostras de soro normal, como todos os pontos de dados coorte LE e normais foram amplamente inter-disperso (dados não mostrados). Tomados em conjunto com a análise de soro total de lípidos descrito acima, estes dados indicam que a presença de grandes quantidades de pelo dentro dos membros LE-afectadas de doentes LE relacionada com cancro avançado dos membros não resulte em diferenças detectáveis nos perfis ou níveis de sangue circulante lipídios -born, avaliadas pelos métodos. Além disso, este resultado está bem alinhada com o normal abundância de proteínas de soro de transporte apolipoproteína A1 e B no soro LE (referido acima, a Fig 2).
linfedema tecido adiposo (TA) lipidomas
apesar da falta de diferença de lipídios totais no soro, ele permaneceu desconhecido se o próprio LE AT consistiu de perfil lipídico molécula incomum, ou um abundância relativa alterado em relação ao membro humano normal AT. Estamos, portanto, molecularmente analisou tanto a AT sólido ( “gordo”), que compreende tecido rico em adipócitos intacta, assim como o óleo de adipócitos já lançado (óleo ou seja, gordura, referido daqui em diante como “óleo”) presente no lipoaspirates obtidas a partir de pacientes com LE submetidos a lipoaspiração cirurgia, e compararam esta com o óleo e a gordura gordura presente nos lipoaspirates obtidos a partir de indivíduos saudáveis submetidos liposurgery por razões cosméticas. É de notar que todas as amostras foram lipoaspirado anatomicamente-combinado, isto é, todos eram braço ou perna e tanto o sólido a gordura, o óleo e a gordura, foram analisadas separadamente por GC-MS e LC-MS. Isto permitiu a identificação simultânea e quantificação relativa (log transformado abundância relativa média normalizada) de cerca de 275 moléculas à base de lipidos, incluindo: 25 diacilglic�idos, 66 triacilglicéridos, 34 ácidos gordos, e 150 fosfolípidos de várias classes, em óleo de gordura e tecido adiposo em amostras de tecido lipoaspirado humanos.
em primeiro lugar, nós usamos LC-MS para identificar diacilglic�idos (DAG) e triacilglicerídeos lipídios (TAG) em ambas LE e membro normal AT. Embora a maioria dos DAGs e tags que foram identificados em óleo e gordura de humano LE AT estavam presentes em abundância semelhante ao detectado no membro normal AT (ou seja, entre -0,1 a +0,1 reduzida ou aumentada comparando LE ao normal), houve vários espécies de lípidos que foram individualmente estatisticamente significativamente aumentados ou reduzidos, em comparação com LE tecido saudável (Figura 3A e 3B, e S2 do ficheiro de dados). Embora estas alterações foram cada um bastante pequeno, verificou-se que a maioria dos aumentos foram em TAG com ácidos gordos poli-insaturados, e nomeadamente aquelas que contêm 3 ou mais átomos de carbono insaturados (barras brancas), C20, especialmente ácido eicosapentaenóico: 5 (barras cinzentas), tanto em OE a gordura e óleo (Figura 3A e 3B). Além disso, quando estes dados foram combinados juntos verificou-se que pode haver um aumento global em ácidos gordos que contenham etiquetas poli-insaturado e uma redução concomitante em gorduras menos saturados, tais como di-, mono-, ou gorduras completamente insaturados, em LE AT (Figura 3C). No entanto, em mamíferos, os ácidos gordos poli-insaturados em C20 são geralmente sintetizados a partir de ácido linoleico de código-fonte dietética (C18: 2) e alfa-linenic ácido (C18: 3) através da acção de dessaturases de ácido gordo e alongases, e a enzima proximal produzindo tanto araquidônico C20 ácido: 4 e C20 ácido eicosapentaenóico: 5, a partir dos seus respectivos precursores C18: 2 e C18: 3, respectivamente, é o delta-5-dessaturase. Por outro lado, ácidos graxos mono-saturadas são dependentes de dessaturases estearoil-CoA redutase. Assim, não fica claro se essas pequenas mudanças individuais no DAG específico e TAGs são biologicamente significativa ou seja, se (i) eles refletem mudanças reais no metabolismo lipídico, tais como um aumento no delta-5-dessaturases e /ou redução da atividade estearoil-CoA dessaturase, que subsequentemente ou concomitantemente resultar num aumento da produção de C20 ácido eicosapentaenóico baseado em ómega-3 anti-inflamatória: 5, ou alternativamente (ii) se estes pequenos efeitos são todos simplesmente dentro de domínios de variação especialmente fundo devido à sua pequena dimensão e à falta geral de significância estatística após a análise de correção BH. No entanto, uma primeira conclusão razoável é que o EL AT parece ter um perfil lipidomas notavelmente semelhantes aos não-LE EM (excepto para a maior teor de C20: 5, contendo TAG), e de que o óleo LE que é libertada a partir assemelha adipócitos rompidos o óleo que está presente dentro intacta AT adipócitos (gordura) -pelo menos no que diz respeito ao DAG e conteúdo de TAG.