Abstract

A ativação da via de sinalização PI3K /AKT é uma força motriz conhecido para a progressão para o câncer de próstata castração-recorrente (CR-CAP), que constitui o principal fenótipo letal do PAC. Aqui, nós identificamos usando uma tela de shRNA genómico a jusante de PI3K alvo /inactivador de AKT, FOXO4, como um potencial supressor de metástase CaP. Os níveis de proteína FOXO4 correlacionam-se inversamente com o potencial invasivo de um painel de linhas celulares de CaP humanos, com os níveis de ARNm diminuídos correlacionando com o aumento da incidência de metástases clínica. Knockdown (KD) de FOXO4 em LNCaP células causas humanas aumentou invasão

in vitro Comprar e linfonodo (LN) metástase

in vivo

sem afetar os índices de proliferação ou apoptose. O aumento da capacidade de invasão Matrigel foi encontrado por KD da FOXO1 mas não FOXO3. Comparação dos genes diferencialmente expressos afectadas por FOXO4-KD em células de LNCaP em cultura, em tumores primários e de metástases LN identificados um painel de genes sobre-regulada, incluindo PIP, CAMK2N1, PLA2G16 e PGC, que, se for derrubado por ARNsi, poderia diminuir a aumento da capacidade de invasão associada à deficiência FOXO4. Embora apenas alguns destes genes codificam promotor FOXO locais de ligação, todos eles são RUNX2-induzível, RUNX2 e de ligação ao promotor PIP é aumentada em células FOXO4-KD. De facto, a expressão forçada de FOXO4 inverteu o aumento da capacidade de invasão de células de LNCaP /shFOXO4; a expressão forçada de FOXO4 não alterou os níveis de proteína RUNX2, no entanto, diminuiu de ligação ao promotor RUNX2 PIP, PIP resultando em infra-regulação. Finalmente, houve uma correlação entre FOXO4, mas não FOXO1 ou FOXO3, regulação baixa e diminuição da sobrevida livre de metástases em pacientes com PAC humanos. Nossos dados sugerem fortemente que o aumento da PI3K /invasão metastática mediada por AKT em Cap está associada à perda FOXO4, e que mecanismos para induzir FOXO4 re-expressão pode suprimir CaP agressividade metastático

Citation:. Su B, Gao L, Baranowski C, Gillard B, Wang J, Ransom R, et al. (2014) A tela RNAi Genome-Wide Identifica FOXO4 como uma metástase-supressor através de Luta contra a PI3K /AKT Signal Caminho no câncer de próstata. PLoS ONE 9 (7): e101411. doi: 10.1371 /journal.pone.0101411

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Abril de 2014; Aceito: 05 de junho de 2014; Publicação: 01 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. dados de Microarray foi depositado ao Omnibus Gene Expression sob o número de GSE58403

Financiamento:. IHG foi apoiado pelo Departamento de Defesa, (www.army.mil) concede PC040256 e PC061246, Instituto Nacional do Câncer (www.cancer .gov) conceder CA94108 (IHG), e suporte Cancer Center Grant 2P30 CA016056 Nacional. BS foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China No. 81272380. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer de próstata (PAC) continua a ser o mais diagnosticado o câncer não-cutânea e a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos [1]. Os estágios iniciais de capitalização são regulados por andrógenos, assim, a terapia de privação de andrógeno tem sido o esteio da terapia para câncer de próstata progressivo. A maioria dos pacientes inevitavelmente falhar esta terapia, progredindo para o câncer de próstata castração-recorrente (CR-PAC) geralmente apresentando-se como osso ou metástases em linfonodos cujo crescimento depende sustentado receptor de andrógeno (AR) [2] sinalização. Na verdade, o direcionamento de CR-tampão com anti-andrógenos mais específicos ou antagonistas AR tem oferecido significativa, mas transitória, eficácia clínica, e resistência ainda envolve a dependência AR, embora envolvendo mutantes AR ou a sobre-expressão [3] – [5].

a ativação do fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /Akt é um dos principais contribuintes para Cap progressão [6], [7], em que 42% das lesões CaP primárias e 100% da apresentam alterações tumores metastáticos (mutações /exclusões, as variações no número de cópias, de expressão diferencial de genes) em um ou mais componentes [8]. Isto levou a ensaios clínicos múltiplos de segmentação de PI3K, AKT ou TORC1 em combinação com quimioterapias convencionais (taxanos, platinas) ou antagonistas de androgénio ou o eixo AR [6]. Na verdade, a perda específico da próstata do antagonista PI3K /AKT, PTEN, em modelos de camundongos transgênicos é suficiente para induzir neoplasia intra-epitelial [9], [10].

Os membros da família FOXO, FOXO1, FOXO3a e FOXO4 , são ubiquamente expressa-factores de transcrição que funcionam como proteínas supressores tumorais através da sua capacidade para reprimir a expressão de genes que codificam para as funções proliferativa, sobrevivência ou diferenciação anti-[11], [12]. Papéis para os membros FOXO em suprimir a progressão do câncer de próstata têm sido descritas. Por exemplo, FOXO1 deleção em 13q14 está associada à proliferação androgénio e AR-independente [13]. AKT, cuja actividade aumenta em progressão PAC [7], fosforila directamente membros da família FOXO, antagonizando assim a sua função através da promoção da associação com proteínas 14-3-3 e impedindo a sua translocação nuclear [14], que conduz à sua degradação mediada por ubiquitinação proteassoma [ ,,,0],15]. A perda de FOXO3a promove a formação de cancro no modelo de ratinho TRAMP do cancro da próstata [16], enquanto que a regulação positiva ou a activação de proteínas FOXO leva a paragem do crescimento e apoptose [17] – [19]. Um estudo por Zhang et ai. [20] demonstra que FOXO1 inibe a motilidade celular PAC e capacidade de invasão, impedindo Runx2 de ligação e transcrição ativando genes de progressão como

OP, IL8, VEGF

e

MMP13

. Embora algumas funções redundantes para proteínas FOXO estão implícitas pela constatação de que os linfomas do timo espontâneas e hemangiomas sistêmicos são induzidas apenas mediante a eliminação combinada de FOXO1, FOXO3 e FOXO4 [21], não há evidências de cromatina imunoprecipitação-seqüenciamento (ChIP-seq) estudos em FOXO1 e FOXO3a de genes alvos comuns e não sobrepostos [22], [23]. Para a progressão do cancro da próstata, os papéis comuns ou distintos para proteínas FOXO permanecem obscuros.

De forma a identificar genes que antagonizam CaP metástase, as células LNCaP humanos, que exibem fraca capacidade de invasão, foram infectadas com um shRNA genómico codificado por lentivírus biblioteca e, em seguida, selecionados para células altamente invasivos em um ensaio de câmara de Boyden revestidas de Matrigel. Nossos dados sugerem fortemente que FOXO4 suprime invasão metastática, impedindo Runx2 de ativar um grupo de genes pró-metastáticos incluindo

PIP, PGC, CAMK2N1

e

PLA2G16

. A constatação de que FOXO4 regulação baixa se correlaciona com doença metastática início mais precoce em pacientes com PAC sugere fortemente que CaP metástase pode ser antagonizada por reativar expressão FOXO4 ou inibindo a função Runx2.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes foram utilizados

Os seguintes anticorpos primários (AB): policlonais de coelho específico para FOXO1, FOXO3, FOXO4, caspase-3, GFP (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); rato monoclonais (MAB) incluem HA, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Myc (Materiais Biológicos Aplicadas, Richmond, BC, Canadá) e Ki67 (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL).

cultura celular

p> LNCaP (ATCC CRL-1740) e CWR22Rv1 (ATCC CRL 2505), as células foram cultivadas em

2. células DU145 (ATCC HTB-81) e HEK293T (ATCC CRL-3216) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. LNCaP foram infectados com alíquotas da DECODE (OpenBiosystems) agrupados pGIPZ biblioteca lentivírus que codifica shRNAs genómico humano (13.650 genes alvo em 7 piscinas de 9.750 shRNA clones /piscina) a uma infecção multiplicidade de-1 (RPCI shRNA Core, Irwin Gelman, Director), e, em seguida, seleccionados para a puromicina (2: g /ml) de resistência. células puromicina-resistente infectados com pGIPZ vazia sozinho serviu como controle negativo.

siRNA transfecção

Synthetic ON-TARGETplus SmartPool siRNA específico para FOXO4, FOXO1 e FOXO3, siCONTROL nonsilence siRNA (NS-siRNA ), e um reagente de DHarmaFECT-transfecção foram adquiridos da Dharmacon (Lafayette, CO). As células LNCaP foram plaqueadas a densidades iguais em placas de 6 poços (5 x 10

4 por poço) durante a noite. As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi ou NS-siRNA específico-FOXO durante 24 h, usando DharmaFECT1 seguindo o protocolo do fabricante.

MTS crescimento celular ensaio

A proliferação de células LNCaP estavelmente infectadas com pGIPZ -FOXO4 shRNA ou pGIPZ-NS-shRNA, ou transientemente transfectadas com FOXO4- ou NS-siARN foi avaliada utilizando o ensaio de MTS (Promega, Madison, WI) seguindo o protocolo do fabricante. ensaio MTS mede a restauração de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) em formazano por células metabolicamente activas.

imunoblot (IB) análise

As células foram lisadas em tampão RIPA (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, glicerol a 8%, 1% de Triton X-100, 0,1 % de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, 10 mM de Na

3VO4, NaF 1 mM, inibidor de protease completo cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha)). 40 ug de proteína total /amostra foi separada por SDS-PAGE, transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno que foram bloqueadas durante 30 min com 5% de albumina de soro de bovino (Sigma) em 1 × TBS /T (0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris ) e depois sondado como indicado. quantificação de imagem e sinal digital foram realizadas em um Chemi-Genius

2 Bio-Imager (Syngene, Frederick, MD) utilizando software GeneTools.

Transient transfecção

pFOXO4-GFP ou pFOXO4- TM-GFP, com substituições Ala em todos os três locais de fosforilação de AKT (gentilmente cedido por Stefanie Dimmeler, Universidade de Frankfurt, Alemanha) foram transitoriamente transfectados em CWR22Rv1. Myc-wtFOXO4 plasmídeo (gentilmente fornecida por Zhiping Liu, University of Texas Southwestern Medical Center) foi co-transfectadas transientemente com ADN pEGFP (Clontech /Takara, Mountainview, CA) em células CWR22Rv1 utilizando Lipofectamina reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o fabricante do recomendações, e depois incubadas durante 40 h. células GFP positivas foram marcados para a invasão e

in situ

zimografia. Para a análise CHIP-qPCR, as células HEK293T foram transitoriamente transfectadas com HA-Runx2 (gentilmente cedido por Jianmin Zhang, Roswell Park Cancer Institute), HA-Runx2 mais Myc-FOXO4, ou vector vazio.

ensaio de invasão e seleção de clones invasivos

ensaios de câmara de Boyden modificadas foram realizados como previamente descrito [24] a partir de 5 × 10

formato de 4 células /5 poços. Os valores para a migração foram obtidos por contagem de pelo menos 10 células em 6 campos por membrana (objectiva x20), com uma média de três experiências independentes. As células com aumento da invasão Matrigel foram isolados após quatro rodadas de ensaios de invasão sucessivas. Especificamente, as células invasoras (aderiram ao fundo de membranas Transwell) foram removidas por tripsinização, reunidas com base em módulos shRNA, plaqueadas em placas de 6 poços, e após a expansão, re-submetido a ensaios de invasão. Após três rodadas, as células foram semeadas esparsamente em placas de 10 cm, e depois de proliferação e isolamento colônia, códigos de barras foram Sanger sequenciado (RPCI Genomics Shared Resource Core, Irwin Gelman-Director) a partir de ADN isolado usando flanqueando pares de primers de PCR, F: 5 ‘ – ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3 ‘e R: 5′-AAGCAGCGTATCCACATAGCGT-3′ ou utilizando o iniciador de sequenciação directo, 5’-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ‘. LNCaP [vector] ou LNCaP [shFOXO4] células transfectadas transitoriamente com 1: g cada um dos clones pGIPZ lentivírus shRNA (-GFP expressando) específico para PIP (adesão # NM_002652.2; clones V2LHS170040 e V2LHS170041), CAMK2N1 (# NM_018584.5 adesão , clones V2HS176164, V2HS176163, V2HS176165), PLA2G16 (adesão # NM_007069.3, clonesV2LHS_253144, V2HS199589), PGC (adesão # NM_002630.3, clone V2LHS169912) ou Runx2 (adesão # NM_004348, clones V2LHS3151, V2LHS15062, V2LHS15065, V2LHS15066, V2LHS223856 , V2LHS 224628), ou pGIPZ vazia controle de vetores (OpenBiosystems) foram avaliados para o potencial invasivo.

In situ

zimografia

lamelas de vidro foram revestidas com 0,2 mg /ml Oregon gelatina-488 conjugado verde, reticulado em glutaraldeído a 0,5% durante 15 min a 4 ° C, e incubou-se com 5 mg /ml de NaBH

4 durante 3 min. As lamelas foram então desinfectados com 70% de EtOH durante 15 minutos e lavadas em meio isento de soro durante 1 hora a 37 ° C. As células foram plaqueadas em lamelas revestidas e incubou-se a 37 ° C durante 24 h, fixadas durante 10 min com gelo frio de 60% de acetona /3,7% de paraformaldeído em PBS, bloquearam-se com leite seco a 3% não gordo em PBS durante 30 min à TA. Myc-FOXO4 foi corado com murganho anti-Myc (1:500), e os núcleos foram coradas com DAPI (Invitrogen; 1:500), seguido de cabra conjugado com FITC anti-IgG de ratinho (1:500; Chemicon, Temecula, CA ). imagens fluorescentes foram capturadas usando um microscópio invertido Nikon TE2000-E equipado com câmera Roper CoolSnap HQ CCD. Invasão foi quantificada medindo a perda média de área de FITC-gelatina em lâminas triplicados

metástase Ortotópico modelo

injeções de próstata ortotópico em lobos dorsais de 10

6 células em 50:. L PBS em ratinhos nus machos incorporados nos seus flancos com peletes de testosterona foi realizada como previamente descrito [25]. Após 10 semanas, os ratinhos foram sacrificados e verificou para GFP fluorescência (Lightools Research, Encinitas, CA) em tumores primários e em órgãos periféricos. Todos os experimentos com animais foram realizados sob a supervisão do Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do Roswell Park Cancer Institute, sob o protocolo aprovado 1177M. A anestesia foi inalado Halothane para o efeito. A eutanásia foi realizada por asfixia com CO2, seguido por deslocação cervical.

A imuno-histoquímica (IHC)

Os tecidos foram fixados em formalina a 10% tamponada, durante 24 h antes do processamento. Os tecidos fixados foram embebidos em parafina e seccionados a 5: m. As lâminas foram de-parafinized em xilenos e, em seguida, re-hidratadas em álcoois graduados, seguido de DDQ

2O. As lâminas foram incubadas em 1X pH 6 tampão citrato (Invitrogen Cat # 00-5000) durante 20 min e em seguida em 3% H

2O

2 durante 15 min. As lâminas foram bloqueadas com soro de cabra normal a 10% durante 30 min, seguido de avidina /biotina bloco (Vector Labs Cat # SP-2001). Abs primários para Ki67 (1:500), GFP (1:50) ou caspase 3 (1:200) foram diluídos em solução de BSA a 1% e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente (RT), seguido por incubação com anti cabra biotinilado -rabbit secundária Ab (Cell Signaling Cat # 9661) para 15 min. Para aumento do sinal, o reagente ABC (Vector Labs Cat #PK 6100) foi aplicada durante 30 min, seguido de incubação com substrato DAB (DAKO Cat # K3467) durante 5 min e contracoloração com hematoxilina de Harris modificado (Richard-Allan Scientific Cat # 72704) durante 20 seg. As lâminas foram lavadas extensivamente em PBS, selado com lamelas e digitalizados em um Aperio ScanScope CS, usando software ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

array de expressão gênica

O RNA total foi preparado usando Trizol (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante a partir de seis amostras: [shFOXO4] linha de células, LNCaP [controle pGIPZ] linha de células, LNCaP [shFOXO4] tumor primário, LNCaP [controle pGIPZ] tumor primário, LNCaP [shFOXO4] linfonodo LNCaP metástase e LNCaP [pGIPZ controle] linfonodo metástases. As amostras de ARN foram quantificados usando um espectrofotómetro de ND-1000 (Thermo Scientific /NanoDrop) e avaliadas para a degradação usando um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). As amostras com ARN Integridade Valor (NIR) 7 foram processadas para análise de arranjo de expressão do gene utilizando a totalidade do genoma humano matriz HT-12 de expressão do gene beadchip (V4) (Illumina, San Diego, CA). 500 ng de ARN total foi convertido em cDNA, seguido de

In vitro

transcrição para gerar ARNc marcado com biotina utilizando o Kit Ambion Ilumina TotalPrep amplificação de ARN (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) de acordo com as instruções do fabricante. 750 ng de sondas marcadas foram em seguida misturados com os reagentes de hibridação e hibridados durante a noite a 58 ° C para os BeadChips HT-12V4. Após a lavagem e coloração com conjugado Cy3-estreptavidina, os BeadChips foram fotografadas usando um iScan Leitor Illumina para medir a intensidade de fluorescência em cada sonda. A intensidade do sinal corresponde à quantidade do respectivo ARNm na amostra original. arquivos de dados BeadChip foram analisados ​​com GenomeStudio (v2011.1; Illumina) módulo de expressão gênica (v1.9.0) para relatar ambos, os níveis de sinal de expressão do gene corrigido-fundo un-normalizadas e quantil normalizados. Os níveis de sinais de expressão de genes foram então analisados ​​utilizando o Bioconductor pacotes programas Lumi e limma (https://www.bioconductor.org). Genes com . Foram identificadas mudanças de expressão de 2 vezes

PCR transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR)

Total de RNA (1 mg /reacção) isoladas usando Trizol Reagente foi submetido a transcrição reversa reações com primers hexâmeros aleatórios utilizando o High Capacity cDNA Transcrição reversa kit (Life Technologies /Applied Biosystems). qRT-PCR foi realizada em um sistema de detecção de sequência 7900HT (Life Technologies /Applied Biosystems) utilizando o kit de FastStart Universal SYBR Green mestre (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) seguindo as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores (Tabela S2) foram projetados usando Primer -BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). GAPDH foi usada como um gene de manutenção para as reacções de qRT-PCR. Cada ensaio foi feito na replicação triplo e o

-ΔΔCt Método 2 [26] foi usada para calcular a expressão de genes.

Co-imunoprecipitação (IP-Co) de FOXO4 e RUNX2

células HEK293T foram co-transfectadas com Myc-FOXO4 mais HA-RUNX2, HA-RUNX2 sozinho ou vector vazio sozinho. Após 48 h, as células foram lisadas em tampão RIPA, e PI foi realizado usando HA Ab, seguido de IB com o Ab indicado, ou IP foi realizada utilizando Myc Ab, seguido por IB

Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP). – qPCR

ChIP ensaios foram realizados como previamente descrito (9) com pequenas modificações. Resumidamente, as células LNCaP e HEK93T cultivadas em placas de 10 cm (80-90% de confluência) foram reticulados por adição de 10% de formaldeído para o meio de cultura para 6-7 min à TA, seguida pela adição de glicina a 125 mM. Cromatina foi sonicada para produzir fragmentos de 100-300 pb em tampão de lise de SDS (SDS a 0,1%, EDTA 5 mM, Tris-HCl a 50, 150 mM de NaCl, 2% de NP-40, 0,5% de desoxicolato, pH 8,1) contendo 1 mM de fenilmetanossulfonilo fluoreto e mistura de inibidor de protease. (Roche Applied Science) Seguindo pré-limpeza com proteína A /G esferas magnéticas (Millipore), a cromatina foi incubada durante a noite a 4 ° C com 5 ug de Ab a seguir, tal como indicado: HA, RUNX2, IgG de rato ou normal. Os imunocomplexos foram puxados para baixo com a proteína A /G esferas magnéticas. As ligações cruzadas para ambos ADN e ChIP de entrada foram invertidos a 65 ° C durante 5 h e as proteínas foram digeridas com proteinase K e o DNA foi recuperado por extracção com fenol /clorofórmio e precipitação com etanol, com 20 ug de glicogénio como transportador, como descrito [27]. fragmentos precipitados foram quantificados por qPCR, e valores de entrada foram corrigidos para a percentagem de regiões de controlo negativo, onde indicado. Primers para amplificação por PCR de PIP como anterior descritos [28].

Análise estatística

significâncias estatísticas entre grupos foram determinadas pelo teste t de Student bilateral, com barras de erro significando S.E.M. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Uma tela shRNA de todo o genoma para identificar genes supressores de metástase candidato

A fim de compreender os componentes genéticos. necessária para metástase, foi utilizada uma abordagem de rastreio de alto rendimento para identificar genes shRNA capazes de suprimir a capacidade de invasão de Matrigel, um parâmetro da cascata metastática [29]. As células LNCaP, as quais exibem uma baixa invasiva potencial [30], foram infectadas com os módulos de pGIPZ (GFP-expressar) os lentivírus módulos de codificação de shRNAs genómicas humanas a uma MOI = 0,7 (para minimizar as células transduzidas com múltiplos shRNAs), e após a selecção para a puromicina resistência, as células foram submetidas a ensaios de Boyden triplicado Matrigel câmara de invasão. células invasoras (que aderiram ao fundo das membranas Transwells) foram removidas por tripsinização, reunidas entre triplicados, expandidas em cultura e, em seguida, sujeitos a mais dois ciclos de ensaios de invasão semelhantes. LNCaP infectado com pGIPZ vazia (LNCaP células [vetor]) foram executados em paralelo para avaliar qualquer seleção de aumento espontâneo na capacidade de invasão (Fig. 1A). Assumiu-se que as células com o aumento da capacidade de invasão resultante da perda de uma função supressora seria enriquecido com sucessivos ciclos de ensaio. Após três ciclos de seleção, as colônias foram isoladas de módulos 2, 3, 6 e 7, que mostrou aumento da capacidade de invasão em relação ao nível Round 3 de LNCaP [vector] controles (Fig. 1B). A análise da sequência (código de barras e sequência shRNA) e BLAST pesquisa banco de dados (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) identificou vários clones de caixa de forkhead O4 (

FOXO4

), kinesin membro da família 3B (

KIF3B

), o sinal de transdução molécula adaptadora (domínio SH3 e motivo ITAM) 1 (

STAM

) e Homo sapiens portadora de soluto família 17 (

SLC17A4

) (S1 Table), que representam 94% de todos os clones sequenciados. Dada a crescente compreensão para papéis para proteínas FOXO como reguladores negativos de progressão do cancro [31], [32], e um estudo recente mostrando que a regulação positiva de ANXA8 por FOXO4 inibe características da célula migratórias e metastáticos de células colangiocarcinoma [33], enfocamos o possível papel da FOXO4 como um potencial supressor de metástase.

a. resumo esquemático da tela. Uma abordagem de triagem shRNA de alto rendimento foi usada para identificar genes cuja knockdown induzida invasão do tumor, um processo essencial para a metástase. Altamente variantes invasivos de LNCaP foram selecionados utilizando ensaios de invasão câmara de Boyden Matrigel-revestidas. B. Aumento da capacidade de invasão induzida por pools de clones shRNA mais de 3 rodadas de seleção.

Painel superior

: imagens representativas de células que expressam GFP invasivos de controle (vector pGIPZ) ou shRNA (alíquota # 2) após três rodadas de seleção.

Baixa painel

:. Potencial invasivo de células agrupadas em cada um dos 7 módulos de infecção ao longo de três rondas de selecção, em comparação com células LNCaP [vetor]

Down-regulação da FOXO4 em metastático humano linhas celulares PAC e tecidos metastáticos

Para testar se a expressão do gene FOXO4 se correlaciona com a capacidade de invasão das células PAC, que a expressão da proteína FOXO4 primeira comparados em um painel de linhas celulares de boné e com diferentes potenciais invasivos e metastáticos. Houve uma correlação inversa entre Matrigel capacidade de invasão e os níveis de proteína FOXO4 (Fig. 2A), especialmente quando se compara LNCaP para duas variantes metastáticos, LN3 e C4-2. Uma pesquisa do banco de dados Oncomine (https://www.oncomine.org) revelou que FOXO4 foi significativamente regulada em Cap metastático em relação ao câncer de local primário e /ou amostras normais de dois estudos individuais (Fig 2B). Além disso, a análise dos pacientes com PAC metastático a partir do estudo de Taylor et ai. [8] no

CBio

site da (https://www.cbioportal.org/public-portal/) mostrou que aqueles com downregulation FOXO4 correlacionada com uma aparência mais rápida de metástases em comparação com aqueles sem FOXO4 alterada expressão (Fig. 2C). Não houve evidência correlacionando FOXO4 regulação negativa na metástase do cancro da mama embora tenha havido uma pequena regulação negativa nas metástases do cancro do cólon (Fig. S1), sugerindo que qualquer função metástase supressor putativo por FOXO4 seria tecido de tipo específico. níveis FoxO1 também foram reprimidos em Cap metástase (Fig. S2A), no entanto, não foi possível determinar se a perda FOXO1 correlacionada com o aumento metástases em pacientes com PAC (Fig. S2B) por causa de underpowering devido ao baixo número de pacientes. Em contraste, os níveis de expressão FOXO3 não mostrou correlação com tampa de metástase (Fig S2C . D).

A. análise IB de expressão FOXO4 em linhas celulares de CaP humanos (

painel superior

), quantificadas e comparadas à invasão tumoral relativa Matrigel no

painel inferior

. As barras de erro, DP de três IB independente análises quantificadas por densitometria (para níveis FOXO4) ou ensaios de invasão de Matrigel. O nível relativo em FOXO4 DU145 foi ajustado a um valor = 1 (linha pontilhada). B. Oncomine estuda os níveis de expressão do RNA FOXO4 em BPH, principal local (1 °) boné ou metástases (METs) de Latulippe et al. [45] e Yu et ai. [46]. análise lote C. Kaplan-Meier (https://www.cbioportal.org/public-portal/) de ocorrência de metástase vs. tempo de lançamento no início, em 37 CaP casos de metástase de Taylor et al. [8] em que 12 casos (32%) exibida FOXO4 downregulation e correlacionados com uma aparência mais rápida de metástases em comparação com os 25 casos que não apresentaram alterações nos níveis de expressão FOXO4.

perda de FOXO4 em LNCaP células PAC contribui para altamente potencial metastático

para determinar se a sub-regulação de FOXO4 contribuiu para o aumento da capacidade invasiva de células LNCaP, as células LNCaP foram estavelmente transduzidas com clones FOXO4 shRNA lentivírus, diferente da identificada no original tela, ou transfectadas com siFOXO4, e essas células, contra o vetor ou mexidos (SCR) siRNA controles, foram testados para a invasão. O knockdown de FOXO4 por SH- ou siFOXO4 resultou em aumentos de 2,5 a 4 vezes na invasividade de LNCaP (Fig. 3a). Por outro lado, as células co-transfectadas transientemente com CWR22Rv1 pEGFP mais qualquer WT-FOXO4 ou um mutante constitutivamente activo FOXO4 (TM, para “mutante triplo”, perda i.e.- de todos os três locais de fosforilação de Akt) resultou numa diminuição da capacidade invasiva (Fig. 3B). Perda de FOXO4 de shRNA ou siRNA não teve efeito sobre as taxas de LNCaP proliferação em culturas 2D (Fig. S3A), sugerindo que o aumento dos níveis de invasão após FOXO4 não foram devido a alterações nas taxas de proliferação. Além disso, foram analisados ​​como FOXO4 controla a capacidade de invasão de células CaP semeadas em lamelas revestidas com gelatina Verde Oregon 488-marcados. FOXO4 knockdown em LNCaP resultou num aumento da digestão localizada de gelatina Oregon Verde 488 marcado com matriz extracelular em comparação com células que expressam não específica shRNA (Fig. 3C), enquanto que a sobre-expressão de Myc-FOXO4 em células CWR22Rv1 diminuiu digestão localizada (Fig. 3D).

A. células LNCaP estavelmente transduzidas com shRNA ou transitoriamente transfectadas com siRNA contra FOXO4 (vs. controlo mexidos) foram testados quanto à capacidade de invasão. knockdown FOXO4 foi avaliada pelo IB (

painel superior

) e seu efeito sobre Matrigel invasão foi quantificado (

painel inferior

). As barras de erro, S.E. da triplicadas experiências. *, P 0,01. B. A expressão ectópica de (TM) FOXO4 WT ou constitutivamente activo diminui CWR22Rv1 invasão. FOXO4 ectópica foi avaliada pelo IB (

painel superior

) e seu efeito sobre Matrigel invasão foi quantificado (

painel inferior

). As barras de erro, S.E. da triplicadas experiências. *, P 0,01. C. A capacidade de invasão local do LNCaP [vector] (

superior fileira

) vs. LNCaP [shFOXO4] (

linha inferior

) foi avaliada para as células semeadas em gelatina Oregon Verde 488-rotulados, com células marcadas por DAPI. D. A mesma análise como em C, exceto comparando CWR22Rv1 expressando estavelmente vector ou Myc-FOXO4. E. pulmão, fígado, rim e LN de camundongos tumored indivíduo com LNCaP [vector] (controle) ou LNCaP [shFOXO4] foram fotografadas usando a luz visível (

Painel

superior) ou luz fluorescente (

painel inferior

). Setas, LN e renais metástases. lesões F. metastático LN de um [shFOXO4] rato tumored LNCaP coradas para H E ou GFP (por IHC). Triângulos, exemplos de células metastáticas GFP positivas.

Uma vez que os membros da família FOXO compartilhar algumas funções redundantes [31], foram analisados ​​os níveis FoxO1 e FOXO3 em células PAC e testaram sua capacidade de controlar a invasão. Em contraste com FOXO4, os níveis FoxO1 e FOXO3 parecia aumentar nas variantes mais invasivos de LNCaP e PC-3 células (Figs S4A . B). Curiosamente, o knockdown de FOXO1, mas não FOXO3, em células LNCaP induzida maior invasividade (Fig. S4C), no entanto, a expressão forçada de qualquer FOXO1 ou FOXO3 não conseguiu diminuir a capacidade de invasão de células CWR22Rv1 (Fig. S4D). Assim, enquanto FOXO1 podem estar envolvidos com invasão LNCaP, FOXO4 é ao mesmo tempo envolvido com e suficiente para o controle da invasão.

Em seguida, testamos se FOXO4 knockdown poderia promover metástase espontânea

in vivo

. ratinhos nus do sexo masculino incorporados com pelotas de libertação de testosterona tempo foram injectados nos seus lóbulos dorsal com LNCaP [vetor] ou LNCaP [] shFOXO4 células, e após dez semanas, os ratinhos foram sacrificados e analisados ​​para a fluorescência da GFP como um marcador de pGIPZ. Embora os LNCaP [shFOXO4] tumores do local primário foram ligeiramente menores do que os induzidos por LNCaP células [vetor], essa diferença não foi estatisticamente significativa (Fig. S3B). Mais importante, não houve diferença na expressão da GFP relativo (Fig S3C.), Ou as suas taxas de proliferação ou apoptose

in vivo

baseado em Ki67 ou caspase-3 clivada IHC coloração (Figs S3D . E, respectivamente) . FOXO4 knockdown resultou no aumento da incidência de macrometástases-expressando GFP para os nódulos linfáticos de drenagem locais (LN), rim (Fig. S3E) e pulmão, em comparação com células de controlo (Tabela 1). Especificamente, 82% (9/11) do grupo shFOXO4 tinha metástases LN, em comparação com 31% (5/16) para o grupo de controlo; 27% (3/11) e 9,1% (1/11) no grupo shFOXO4 tinha metástases renais e pulmonares, respectivamente, ao passo que metástases foram encontrados em nenhum (0/16) do grupo de controlo. Além disso, confirmou que as lesões LN expressa a proteína GFP utilizando específico-GFP IHC (Fig. 3F).

Análise de genes pró-metástase FOXO4 regulamentado

Dado que FOXO proteínas funcionam como repressores da transcrição, exploramos se o aumento da capacidade de invasão após a perda FOXO4 pode ser devido ao aumento da expressão do gene pró-metástase. Assim, a análise de expressão gênica em todo o genoma foi realizada em LNCaP [vector] vs. LNCaP [shFOXO4] células cultivadas, os tumores primários do local e metástases LN. Knockdown de FOXO4 em cada um desses conjuntos de amostras foi confirmada por IB (Fig. S5A). Esta análise identificou 535 genes cuja expressão alterada ≥1.5 vezes (Fig. S5B). Destes, 54 alterações foram comuns a todas as três amostras conjuntos (Fig. 4A, Fig. S5C), e destes, 19 genes (15 upregulated, 4 reprimidos) foram associados com FOXO4 knockdown (Fig. 4B). A fim de concentrar a nossa análise, foram analisados ​​pelo software Ingenuity IPA que da assinatura 19 gene estava envolvido em processos associados a metástase, tais como a motilidade celular, invasão quimiotaxia ou sobrevivência celular. Oito genes regulados positivamente nas metástases LN shFOXO4-associados (

PIP, CAMK2N1, PLA2G16, ALDH1L1, VCX, VCX3A, APP

, e

PGC) foram identificadas como potencialmente envolvidos na metástase (Fig . 4C,

topo

).