Abstract
Especial AT-rich protein-1 (SATB1) foi identificado como um organizador genoma que reprograma organização da cromatina e transcrição de ligação sequência perfis. SATB1 promove o crescimento do tumor ea metástase do câncer de mama e está associada com mau prognóstico em vários tipos de câncer. A associação entre SATB1 e cancro colorectal (CRC) não foi estudado de forma intensiva. Portanto, este estudo teve como objetivo investigar o efeito da SATB1 no crescimento CRC e metástase in vitro e in vivo e sua correlação com a sobrevida global e fatores clínico-patológicos em pacientes com CCR. Estável knockdown SATB1 e linhas celulares SATB1-superexpressão foram estabelecidos. SATB1 knockdown diminuição no crescimento celular, a formação de colónias, migração e invasão e aumento da apoptose em células de CRC in vitro (p 0,05), ao passo que a sobre-expressão SATB1 teve o efeito oposto. SATB1 superexpressão aumento do crescimento de tumores e metástases de pulmão e fígado in vivo usando modelos animais de xenoenxerto (p 0,05). Assim, SATB1 promoveu um fenótipo CRC agressiva in vitro e in vivo. A análise imuno-histoquímica de 560 espécimes de CRC mostraram que a expressão SATB1 foi significativamente maior do que em tecidos de CRC na mucosa não-tumoral combinado (p 0,001). Além disso, a expressão SATB1 foi significativamente maior em pacientes com tumores pouco diferenciados, maior profundidade de invasão, metástase à distância, e estágio TNM avançado. pacientes SATB1-positivos tinham um prognóstico pior do que os pacientes SATB1-negativos, e SATB1 foi identificado como um fator prognóstico independente para CRC (p = 0,009). Surpreendentemente, nós também avaliada expressão SATB2 em CRC e descobriram que SATB2 foi mais abundantemente expresso na mucosa não-cancerosa em comparação com tecidos de cancro colo-rectal (p 0,001). No entanto, a expressão SATB2 não teve influência no prognóstico de pacientes de CRC (p = 0,836). expressão SATB1 foi significativamente associada com menor sobrevida tanto em pacientes SATB2-positivos ou SATB2-negativos pacientes (p 0,001). Em conclusão, nossos resultados indicaram um papel importante para SATB1 no CRC tumorigênese e metástase. Portanto, SATB1 pode representar um importante biomarcador prognóstico e alvo terapêutico para CRC
Citation:. Zhang Y, Tian X, Ji H, Guan X, Xu W, Dong B, et al. (2014) Expressão de SATB1 promove o crescimento e metástase de câncer colorretal. PLoS ONE 9 (6): e100413. doi: 10.1371 /journal.pone.0100413
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 15 Setembro, 2013; Aceito: 28 de maio de 2014; Publicação: 27 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo financiamento Nacional de Ciências Naturais (Não: 81272765), Capital característica clínica Aplicação Research (Não: Z121107001012083), o Projeto chave de Fundo de Capital Medical Desenvolvimento (no: 2009-2095), Pequim Municipal Natural Science Foundation (no: 7122030) , Plano de Apoio Financeiro talento excepcional de Pequim (215 programa, não: 2009/02/18), o Projeto especial de Pequim “dezenas, centenas e milhares” Health financiamento Talentsand do Hospital do Câncer Pequim (no: 10-04). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de morte associada ao câncer nos Estados Unidos da América [1] e o segundo câncer mais prevalente na China [2]. Cerca de 15-25% dos pacientes com CCR experimentar metástases hepáticas síncronos, e 80-90% destes pacientes têm doença hepática metastática irressecável [3]. doença do fígado metastático é a principal causa de morte nos pacientes de CRC [4]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de identificar marcadores moleculares sensíveis e específicos para prever CRC metástase. Além disso compreensão dos mecanismos subjacentes da CRC metástase é essencial para a identificação de biomarcadores para a progressão metastático no CRC.
especial rica em AT-sequência de ligação de proteína-1 (SATB1) é uma proteína nuclear específico de tecido que é predominantemente expresso em timócitos [5] e foi originalmente reconhecida por seu papel crítico no desenvolvimento de células T adequada [6] – [8]. SATB1 liga especiais locais de ancoragem AT-ricos que circunscrevem heterocromatina para formar uma arquitetura de “cage-like” funcional nuclear que serve como uma plataforma de aterragem para fatores-remodelação de cromatina. Por conseguinte, a rede SATB1 pode regular a expressão de genes, alterando a organização funcional da sequência de ADN [9], [10]. SATB1 foi recentemente relatado para ser um organizador genoma. expressão SATB1 marcadamente alterada a expressão de mais de 1000 genes do câncer de mama, incluindo genes associados à metástase e genes supressores de tumor para promover o crescimento e metástase de tumor de mama [11]. Além disso, a análise de sobrevida multivariada mostrou que SATB1 foi um fator prognóstico independente para o câncer de mama [11]. SATB1 superexpressão também tem sido associada a um mau prognóstico no carcinoma epidermóide de laringe [12], câncer gástrico [13], [14], e melanoma cutâneo maligno [15]. A associação entre SATB1 e cancro colorectal (CRC) permanece incerto
Neste estudo, demonstramos o envolvimento de SATB1 no crescimento CRC e metástases com base nas seguintes provas:. (A) SATB1 superexpressão foi detectado em ambos CRC linhas celulares e tumores CRC, (b) as taxas de crescimento e formação de colónias foram regulados em células SATB1-knockdown, mas até regulamentada em células SATB1-sobre-expressam, (c) capacidade de migração e invasão foram muito mais pobre em células SATB1-knockdown, enquanto mais agressivo em células SATB1 que sobre-expressam, (d) SATB1 superexpressão promovido carcinogénese e metástase in vivo usando modelos animais, (e) a expressão da proteína SATB1 era mais abundante em tecidos de CRC do que em tecidos não-cancerosas correspondentes, e (f) a expressão SATB1 foi encontrado para ser um fator prognóstico independente para pacientes com CCR.
Materiais e Métodos
Lines
2.1 celulares e Cultura de células
SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO e linhas de células LoVo CRC foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC) e da Academia chinesa de Ciências Médicas Peking Union Medical College, e todas as linhas celulares foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), estreptomicina (100 ug /ml) e penicilina (100 ug /ml). Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C sob 5% de CO
2.
2.2 Estabelecimento de Estável SATB1-knockdown Linhas Celulares
Três ARN curto-hairpin sequências (shRNA) foram concebidos com base na sequência SATB1 (NM_002971), identificado por shRNA alvo localizador (Ambion; Life Technologies, Carlsbad, Califórnia): shRNA1 (2566), 5′-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3 ‘; shRNA2 (2364), 5’-AAGGACAATTCCGGTTTAGAG-3 ‘; e shRNA3 (2797), 5’-AAAGTGTGTACCCCGTAAGCA-3 ‘. Os oligoduplexes foram clonados no vector pSilencer3.1 (Ambion; Life Technologies, Carlsbad, Califórnia). As construções resultantes foram transfectados em células LoVo ou células RKO utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas com vector vazio (pSilencer3.1) foram utilizados como controlos. shRNA transfectantes estáveis foram seleccionadas por cultura com 600 ug /mL de G418 (Gibco BRL) durante 3 semanas. RT-PCR, western blot e imunofluorescência foram usadas para confirmar a regulação para baixo da expressão SATB1.
2.3 Estabelecimento de linhas de células estáveis SATB1-superexpressão
Full-length cDNA SATB1 humana foi clonado no vector de expressão pcDNA3.1 (Ambion; Life Technologies, Carlsbad, Califórnia). células SW480 foram transfectadas com pcDNA3.1-SATB1 ou vector vazio (pcDNA3.1) como um controlo. Os transfectantes com superexpressão estável SATB1 foram seleccionadas por cultura com 600 ug /mL de G418 durante 3 semanas. RT-PCR, western blot e imunofluorescência foram utilizados para confirmar a regulação para cima da expressão SATB1.
2.4 Pacientes e amostras
tecidos tumorais CRC foram obtidas de 560 pacientes que foram diagnosticados e tratados no Departamento de cirurgia, Peking University School of Oncology entre 2005 e 2008. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Cinco cento e quarenta e dois destes pacientes foram acompanhados no pós-operatório, durante um período de pelo menos 3 anos. E informações clínico-patológico detalhada foi obtida a partir de 520 pacientes. tumor colorretal fresco e amostras de mucosa colorretal normais pareados foram obtidos de 21 pacientes. As amostras foram congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à análise. análises histopatológicas foram realizadas de forma independente por dois patologistas. Para o uso de materiais clínicos para fins de investigação, a aprovação dos Comitês de Ética Regional, Hospital do Câncer Pequim, China foi obtido. consentimentos informados por escrito ter sido obtido de todos os participantes. A investigação clínico foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.
2.5 Extração de RNA total e transcrição reversa Polymerase Chain Reaction
expressão de mRNA SATB1 foi determinada por transcrição reversa da polimerase reacção em cadeia (RT-PCR). O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir do ARN extraída (4 ug), utilizando o kit de EasyScript da primeira cadeia de síntese de ADNc SuperMix (Invitrogen). A amplificação por PCR foi efectuada utilizando os seguintes iniciadores específicos do gene SATB1 e beta-actina: SATB1, 5′-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3 ‘(sentido) e 5′-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3′ (anti-sentido); e beta-actina, 5’- TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ‘(sentido) e 5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’ (anti-sentido). Beta-actina foi utilizada para normalizar a expressão do gene SATB1. Vinte e oito ciclos de PCR foram realizadas em que cada ciclo consistiu de pré-desnaturação a 94 ° C durante 3 min, desnaturação a 94 ° C durante 45 s, emparelhamento a 55 ° C durante 45 s e extensão a 72 ° C durante 45 s , e após os ciclos de 28 é um alongamento final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de 2% de gel de agarose corado com brometo de etídio. intensidade da banda foi medida directamente numa Imager 2200 sistema de análise de Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).
2,6 Ocidental análise de mancha
Células e tecidos frescos foram lisadas em 1 × sódio dodecil sulfato (SDS) de tampão de lise. Quantidades iguais de proteína total foram separadas por SDS-PAGE, electrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Pall Corporation, Cidade do México, México), e incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo policlonal de coelho SATB1 (1:500 diluição, PRS4631; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Beta-actina (1:10000, Sigma-Aldrich) foi usado como um controlo de carga. bandas de proteínas foram avaliados por quimioluminescência aumentada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA).
2.7 Imunofluorescência Coloração e Laser-scanning microscopia confocal
As células foram cultivadas em lamelas de vidro, fixada com 4 % de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100, lavados, e bloqueadas com 5% de albumina de soro bovino. As células foram incubadas com anticorpo primário SATB1 (1:100, PRS4631, Sigma-Aldrich) seguido de incubação com um anticorpo secundário conjugado com rodamina (01:50; Zhongshan Golden Bridge Biotecnologia, Pequim, China). As lamelas foram montadas com meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) contendo diamidino-2-fenilindole (DAPI) corante nuclear e examinado sob um microscópio de fluorescência, em seguida, as imagens foram construídas usando um software (versão 2.2.1 LAS AF , TCSSP5, Leica, Alemanha).
2.8 crescimento celular
O crescimento celular foi avaliado por 3- (4,5-methylthiozol-2-il) brometo de MTT) (-2,5-difeniltetrazólio. Células (3 x 10
3 células /poço) foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas durante 24, 48, 72, e 96 h. MTT (10 ul) foi adicionada a cada poço, e as células foram cultivadas durante um adicional de 4 h. O meio de cultura foi removido e 200 ul de DMSO (Amresco Inc., Solon, OH, EUA) foi adicionado a cada poço. A absorvância a 570 nm foi medida com um leitor de microplacas (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). curvas de crescimento celular foram construídos plotando absorvância (apagado por DMSO) contra o tempo.
2.9 apoptose e Fluxo de Análise Citometria
Stable SATB1-superexpressão, SATB1-knockdown, e as células de controle de vetores vazios (1 × 10
6 células) foram cultivadas em placas de 60 mm durante 48 h e colhidas. As células foram marcadas com iodeto de propídio e AnnexinV. Os controlos negativos consistiram de células não marcadas e controlos de isotipo apropriado. Um mínimo de 10.000 eventos para cada amostra foram recolhidos e analisados usando um citômetro de fluxo. (FACSAria; BD Biosciences, San Jose, CA, EUA)
Análise do Ciclo
2.10 celular por citometria de fluxo
Stable SATB1 que sobre-expressam, SATB1-knockdown, e células de controlo de vector vazio foram cultivadas em pratos de 60 mm e privadas de soro durante 24 h. As células foram então cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10% durante 48 h. As células viáveis foram colhidas, fixadas em etanol a 70% e analisadas por citometria de fluxo.
2,11 Formação agar mole Colony
Estável SATB1 que sobre-expressam, SATB1-knockdown, e células de controlo de vector vazio (3 × 10
3) foram ressuspensas em DMEM contendo 3 mL de 0,4% de agarose, 20% de FBS, piruvato de sódio 0,5 mM, 10 m MHEPES, e 1% de penicilina /estreptomicina e em camadas em cima de 4 mL de 0,8% de agarose em DMEM sobre pratos de 60 mm. Após 3 semanas, as colónias foram contadas e fotografadas.
2,12 Cura Ensaio
células de controle de vetores estáveis SATB1-superexpressão, SATB1-knockdown, e vazios de Feridas foram cultivadas em placas de 60 mm até que a célula densidade atingiu 90% de confluência. Uma ferida horizontal foi criado usando um estéril MICROTIP 10 mL. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover os detritos celulares. Três áreas diferentes em cada prato foram seleccionadas para comparar a distância de migração de células a partir da origem da ferida. As imagens foram capturadas em 0 e 24 h para avaliar o fechamento da ferida.
2,13 Migração Transwell e Invasão Ensaios
Stable SATB1-superexpressão, SATB1-knockdown, e as células de controle de vetores vazios (1 × 10
5) foram suspensas em meio isento de soro de 200 ul e semeadas para dentro da câmara superior de uma inserção de Transwell com um tamanho dos poros da membrana de 8 um (Corning Costar Corp, Cambridge, MA, EUA). DMEM contendo FBS a 10% foi colocada na câmara inferior como um quimioatractor. Após incubação durante 24 h, as células que não migraram na câmara superior do inserto Transwell foram removidos com uma mecha de algodão, e as células que migraram na face inferior da membrana de filtro foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,1%. O número de células migradas foi contado em 5 campos microscópicos seleccionados aleatoriamente e fotografado. O protocolo utilizado para o ensaio de invasão foi o mesmo que o utilizado para o ensaio de migração, excepto que o inserto Transwell foi revestida com Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
2,14 Carcinogénese In Vivo
células de controlo do vector SATB1 que sobre-expressam e vazios estáveis (2 × 10
6) em solução salina equilibrada de 100 uL de Hank (HBSS; Gibco BRL, Life Technologies) foram injectadas em cinco fêmea de 4 semanas de idade, ratinhos BALB /c atímicos . SATB1 que sobre-expressam as células de controlo do vector vazio e foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal esquerdo e direito de cada rato, respectivamente. Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por semana, e os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas. Os tumores foram excisados, medidos e pesados. Os tumores foram fixadas em formalina a 10% para análise histopatológica ou armazenado a -80 ° C para RT-PCR e Western blot. Toda a experimentação animal foi feito de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal de Peking University School of Oncology (número de autorização: 2012-07). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
2,15 Xenoenxerto modelo animal de pulmão e fígado Metástase
Nós determinamos o efeito da expressão SATB1 no CRC metástase em modelos de murganho de xenoenxerto de pulmão e metástases do fígado. No modelo de metástases do fígado, suspensões unicelulares de células de controlo do vector que sobre-expressam SATB1 e estáveis vazios (2 × 10
6) em 100 mL de HBSS foram lentamente injectada no baço de ratinhos BALB /c atímicos sob anestesia. No modelo de metástases do pulmão, suspensões unicelulares de células de controlo do vector que sobre-expressam SATB1 e vazios (2 × 10
6) em 100 mL de HBSS foram injectados na veia lateral da cauda. Cinco ratinhos foram incluídos em cada grupo de tratamento. Os ratinhos foram sacrificados 8 semanas após a injecção, e os baços, fígados e pulmões foram excisados cirurgicamente. O número e tamanho de focos metastáticos no pulmão e fígado foram documentados. Os espécimes foram fixados em formalina a 10% ou armazenadas a -80 ° C para análise futura.
2,16 imuno análise de microarrays de tecido
fixado em formalina, embebido em parafina tumor colorretal e ao lado da mucosa colorretal normal, espécimes foram construídos em microarrays de tecido (TMAs). seções bloco de TMA (4 mm) foram desparafinados e re-hidratadas em álcool graduado. A recuperação de antígenos foi realizada em um forno de microondas por tampão de EDTA. As células foram incubadas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena e depois em leite magro a 5% para evitar a ligação não específica. secções de bloco de TMA foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo monoclonal específico SATB1 coelho (01:50, ab92307; Abcam, Cambridge, CA, EUA) ou um anticorpo monoclonal de coelho contra SATB2 (1:200, TA307098; OriGene Technologies, Inc .). Para os controlos negativos, os anticorpos primários foram substituídos com PBS. Todas as secções foram examinadas ao microscópio e marcado por dois patologistas independentes que foram cegos para a informação clínica dos sujeitos. Ao contrário seções comuns, SATB1 ou SATB2 coloração imuno-histoquímica nas fichas de tissue microarray foi quase 100% nuclear tingidos ou não tingido de tecido do tumor ou na mucosa colorretal normal, por isso, quando avaliar a sua coloração, que só levou em conta a intensidade da coloração da corou positivamente núcleo. intensidade nuclear foi indicado como negativo, fracamente positiva, moderadamente positiva ou fortemente positiva. E quando a realização de análise estatística, foram combinados os pacientes de coloração fracamente positiva, moderadamente positiva e fortemente positiva, como um grupo de positivo-coloração.
2,17 Statistical Analysis
SPSS 16.0 (SPSS Inc. , Chicago, IL, EUA) foi utilizado para realizar as análises estatísticas. Todas as experiências in vitro foram realizadas em triplicado e repetidas 3 vezes. Unpaired 2 caudas
t
testes foram utilizados para comparações entre os grupos após verificar normalidade e homogeneidade de variância. Os dados nas figuras e texto são apresentados como a média ± desvio padrão. Bicaudal teste do qui-quadrado (χ
2) ou o teste exato de Fisher foi usado para avaliar a relação entre a expressão SATB1 e fatores clínico-patológicos ou expressão SATB2. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi utilizado para avaliar o prognóstico do paciente, e os valores de p foram calculados pelo teste de log rank. A análise multivariada por Cox modelo de regressão de riscos proporcionais foi utilizado para determinar o efeito da expressão SATB1 e fatores clínico-patológicos sobre a sobrevida do paciente. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo
Resultados
3.1 Expressão de SATB1 em linhas celulares de CRC
A expressão de mRNA e proteína de SATB1 em 6 células CRC humano. linhas, SW480, SW620, HT-29, HCT 116, RKO e LoVo são mostrados na Fig. 1A. SATB1 ARNm e a expressão de proteínas não foram detectadas em SW480, SW620, HT-29, e as células HCT-116. SATB1 ARNm foi detectada nas linhas celulares altamente metastáticas RKO e LoVo. Além disso, a proteína SATB1 foi altamente expressa em células RKO e LoVo. Assim, as linhas de células LoVo e RKO foram escolhidos para uma série de experiências de knockdown SATB1, e linhas de células SW480 para as experiências superexpressão SATB1.
expressões (A) de ARNm e de proteína foram determinadas SATB1 em 6 linhas de células de CRC (A) , SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO e LoVo; (B) tumores colorretais representativas e mucosa normal alinhados; (C) tumores moderadamente e pouco diferenciados e mucosa normal; e (D) tumores colorretais representativos e tumores metástases hepáticas focos síncronas correspondentes. SATB1 ARNm e a expressão da proteína foi determinada por RT-PCR e western blot, respectivamente, e normalizado para p-actina. T, tumores colo-rectais; N, combinado mucosa normal; M, hepáticas tumores metástases focos síncronos.
3.2 Expressão de SATB1 no CRC Primária e hepática Metástase Focos
O nível de mRNA e proteína SATB1 expressão foi determinada em tumor primário CRC e combinados amostras de mucosa não-tumorais. Entre os 21 casos correspondentes, SATB1 ARNm e proteína foram detectados em 17 amostras de tumor mas não em qualquer uma das amostras de mucosa não-tumor (Fig. 1B). Além disso, SATB1 ARNm e a expressão de proteína foram mais elevadas em amostras de tumores pouco diferenciados do que em amostras de tumores moderadamente diferenciados (Fig. 1C). SATB1 ARNm e a expressão da proteína em CRC primário foi semelhante ao que em correspondência síncrono focos de metástases hepáticas (Fig. 1D).
3,3 Repressão de SATB1 Expressão reduz a proliferação celular, Formação de Colónias, migração e invasão in vitro
Para avaliar o papel da SATB1 na progressão CRC, três linhas de células LoVo SATB1-knockdown estáveis foram estabelecidos utilizando shRNA. SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, e SATB1-shRNA3 linhas celulares foram eficazes na regulação negativa SATB1 ARNm e a expressão de proteína (Fig. 2A). a expressão da proteína de SATB1 era dificilmente detectável em células SATB1-shRNA1 e SATB1-shRNA2. a expressão de ARNm SATB1 foi reduzida em quase 90% em células-SATB1 shRNA1, e por 70% e 60% em células-SATB1 shRNA2 e SATB1-shRNA3, respectivamente (Fig. 2A). A taxa de crescimento de todas as linhas celulares SATB1-shRNA foi mais lento do que a das células de controlo de vector vazio (p 0,05, Fig. 2B). Como mostrado na Fig. 2C, células SATB1-shRNA1 teve uma percentagem significativamente mais elevada de células apoptóticas do que as células de controlo (45,1% V.S. 20,3%, p 0,01). No entanto, a percentagem de células apoptóticas não foi significativamente diferente entre a SATB1-shRNA2, SATB1-shRNA3, e células de controlo (dados não apresentados). SATB1 knockdown de fase G1 induzido a paragem do ciclo celular: a percentagem de células na fase G0 /G1 foi mais elevada nas células (45,6%) SATB1-shRNA1 (46,4%) e SATB1-shRNA2 do que nas células de controlo (36,8%) (p 0,01; Fig. 2D). Em contraste, a percentagem de células em G2 /M e as fases S foi significativamente menor em células shRNA1 e shRNA2 do que nas células de controlo (p 0,01; Fig. 2D). alterações do ciclo celular não foram observadas em células SATB1-shRNA3 (dados não mostrados). Estes resultados indicaram que SATB1 pode desempenhar um papel importante na promoção do crescimento e sobrevivência das células CRC.
Três linhas de células (A) estáveis SATB1-knockdown LoVo foram estabelecidos utilizando shRNA. As células transfectadas com vector vazio serviram como controlos. A eficácia de SATB1 knockdown foi verificada por meio de RT-PCR (painel superior esquerdo), western blot (painel inferior esquerdo), e imunofluorescência (painel da direita). β-actina foi utilizada para assegurar a igualdade de carregamento. (B) A proliferação de células de controlo de vector vazio, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, e SATB1-shRNA3 células foi determinado pelo ensaio de MTT. (C) A apoptose de células de controlo do vector vazio SATB1-shRNA1 e foi determinada por análise de citometria de fluxo de PI e Anexina V coloração. (D) A citometria de fluxo análise do ciclo celular em controle do vetor vazio, SATB1-shRNA1 e SATB1-shRNA2 células. (E) Macio agar a formação de colónias de controle do vetor vazio, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2 e SATB1-shRNA3 células após 3 semanas. * P 0,001. (F) A migração de controle do vetor vazio, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2 e SATB1-shRNA3 células foi determinada pela cicatrização de feridas ensaio (painel esquerdo) e ensaio de migração Transwell (painel superior direito). O número de células que migraram no ensaio de migração Transwell foi quantificada por contagem das células no lado de baixo da membrana de filtro em 5 campos microscópicos seleccionados aleatoriamente (painel inferior direito). * P 0,001, o número de células migradas em comparação com o controlo. (L) a invasão de células de controlo de vector vazio, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, e SATB1-shRNA3 células foi determinada por ensaio de invasão de Matrigel Transwell. O número de células invadidas foi quantificada por contagem de células no lado de baixo da membrana de filtro em 5 campos microscópicos seleccionados aleatoriamente. * P 0,001, número de células invadidas comparação com o controlo
knockdown de expressão SATB1 diminuiu o tamanho da taxa de formação de colónias e de colónias (Figura 2E)… Nas células de controlo, quase de 100 a 120 colónias pode ser observada em campos microscópicos seleccionados aleatoriamente. Em contraste, a formação de colónias eram muito menos nos três células SATB1-shRNA (shRNA1: 28,75 ± 8,5; shRNA2: 34,5 ± 7,8; shRNA3: 40,5 ± 4,5). Knockdown de SATB1 também reduzida motilidade celular como evidenciado pelos fechamento de feridas sentido lato, em 3 linhas celulares SATB1-shRNA em comparação com aqueles nas células de controlo (Fig. 2F). A capacidade invasiva foi significativamente menor em células SATB1-shRNA1, shRNA2, e shRNA3 do que nas células de controlo (p 0,001; Fig. 2G). Estes resultados foram consistentes com os do ensaio de migração Transwell (Fig. 2F).
Além disso, testou-se a taxa de crescimento e capacidade de migração /invasão em linhas de células RKO. SATB1-knockdown de linhas de células RKO foi criada usando shRNA1 (nomeado linhas celulares SATB1-shRNA1 RKO). Ambos os ARNm e proteína níveis de SATB1 foram eficazmente regulados negativamente por shRNA1 (Fig. 3A). Consistente com as experiências de knockdown SATB1 em linhas de células LoVo, a taxa de crescimento das linhas celulares SATB1-shRNA1 RKO foi mais lento do que a das células de controlo de vector vazio (p. 0,05, Figura 3B), e SATB1-shRNA1 linhas de células RKO também mostrou a paragem do ciclo celular G1-fase (Fig. 3C). ensaio de migração desde a evidência de que knockdown do gene SATB1 poderia reduzir a motilidade celular (p . 0,001 Fig 3D). E em linhas de células RKO, a capacidade invasiva foi significativamente reduzida por baixo-regulação da expressão SATB1, como mostrado na Fig. 3E (p 0,001).
SATB1-knockdown linhas de células RKO (A) foi criada usando shRNA1. As células transfectadas com vector vazio serviram como controlos. A eficácia de SATB1 knockdown foi verificada por meio de RT-PCR e Western blot. β-actina foi utilizada para assegurar a igualdade de carregamento. (B) A proliferação de células de controlo de vector vazio, e células RKO SATB1-shRNA1 foi determinada pelo ensaio de MTT. (C) A citometria de fluxo análise do ciclo celular em controle do vetor vazio, células SATB1-shRNA1 RKO. (D) A migração de controle do vetor vazio, células SATB1-shRNA1 RKO foi determinada por transpoço ensaio de migração. * P 0,001, o número de células migradas em comparação com o controlo. (E) a invasão de células de controlo de vector vazio, células SATB1-shRNA1 RKO foi determinado por Matrigel Transwell ensaio de invasão. * P 0,001, número de células invadidas em relação ao controle
3.4 superexpressão do SATB1 promove a proliferação celular, Formação Colony, Migração e invasão in Vitro
Para verificar melhor o papel. de SATB1 na progressão CRC, uma linha de células SATB1-superexpressão foi estabelecida utilizando células SW480 mal metastáticos. SATB1 sobre-expressão foi verificada por meio de Western blot, RT-PCR, e imunofluorescência (Fig. 4A). A taxa de crescimento foi maior em células que sobre-expressam SATB1 do que nas células de controlo de vector vazio (p 0,05; Fig. 4B). A percentagem de células apoptóticas foi menor nas células que sobre-expressam SATB1 do que nas células de controlo (28,7% V.S. 36,1%, p 0,01; Fig. 4C). A sobre-expressão de SATB1 promovida a progressão do ciclo celular da fase G0 /G1 para a fase G2 /M e S (56,3% G0 /G1 fase em linhas de células que sobre-expressam SATB1 contra 63,6% G0 /fase G1 em células de controlo) (Fig. 4D). taxa de formação de colónias e o tamanho das colónias eram mais elevados nas células que sobre-expressam SATB1-(67,5 ± 9,5) do que nas células de controlo (24,75 ± 2,75) (Fig. 4E). SATB1 superexpressão aumento da migração de células, como evidenciado pelo encerramento completo da ferida e mais células migradas em células que sobre-expressam SATB1-(Fig. 4F). Além disso, a capacidade de invasão foi mais elevada nas células que sobre-expressam SATB1-(109 ± 8,7) do que nas células de controlo (12,75 ± 4,5) (Fig. 4G).
células SW480 (A) foram transfectadas com pcDNA3 vector de expressão de 0,1-SATB1 ou vector vazio. A sobre-regulação de ARNm e proteína SATB1 expressão foi verificada por meio de RT-PCR (painel superior esquerdo), western blot (painel inferior esquerdo), e imunofluorescência (painel da direita). β-actina foi utilizada para assegurar a igualdade de carregamento. (B) A proliferação celular de células pcDNA3.1-SATB1 e controlo com vector vazio foi determinada pelo ensaio de MTT. (C) A apoptose de células pcDNA3.1-SATB1 e controlo com vector vazio foi determinada por análise de citometria de fluxo de PI e Anexina V coloração. (D) A análise de citometria de fluxo do ciclo celular em células pcDNA3.1-SATB1 e controlo com vector vazio. (E) Macio agar a formação de colónias de células de controle de vetores e pcDNA3.1-SATB1 vazias após 3 semanas. (F) migração de controlo do vector vazio e pcDNA3.1-SATB1 células foi determinada por ensaio de cicatrização da ferida (painel da esquerda) e o ensaio de migração Transwell (painel da direita). * P 0,001, o número de células migradas em comparação com os controlos. (G) invasão celular de células pcDNA3.1-SATB1 controle e vector vazio foi determinada por Matrigel Transwell ensaio de invasão (* p 0,001).
3.5 SATB1 promove o crescimento e metástase de células CRC em vivo
em seguida, avaliou-se o efeito da sobre-expressão em SATB1 CRC carcinogénese in vivo, o ARNm e a expressão da proteína de SATB1 foram mais elevados em tumores a partir de células que sobre-expressam SATB1 do que em tumores a partir de células vector vazio (Fig. 5A). Tumores a partir de células que sobre-expressam SATB1 tiveram uma taxa de crescimento mais rápido do que os tumores a partir das células de controlo, que foi consistente com as taxas de crescimento in vitro em (p . 0,01, Fig 5A, painel superior). Os pesos dos tumores a partir de células que sobre-expressam SATB1 foram aproximadamente 5-6 vezes mais pesados do que os das células de vector vazio, indicando que SATB1 poderia promover o crescimento de tumores colorrectais in vivo (Fig. 5A, painel inferior).
(A) de ARNm e da proteína de SATB1 inxenograft tumores de células pcDNA3.1-SATB1 e controlo com vector vazio foram determinados por RT-PCR e western blot, respectivamente (painel superior esquerdo). Em seguida, o crescimento do tumor foi determinada num modelo de xenoenxerto in vivo em. as células de controlo do vector que sobre-expressam SATB1 e estáveis vazios (2 × 10
6) foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal esquerdo e direito, respectivamente, em 5 do sexo feminino BALB /c atímicos ratinhos. Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes por semana, e os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas.