Abstract

O fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) alvo -mammalian da rapamicina (mTOR) eixo de sinalização tem emergido como um novo alvo para a terapia do cancro. Os agentes que inibem PI3K, mTOR ou ambos estão em fase de desenvolvimento. O inibidor de mTOR alostérico, RAD001, e o inibidor de cinase de dupla via PI3K /mTOR, BEZ235, são exemplos destes agentes. Nós estávamos interessados ​​no desenvolvimento de estratégias para melhorar a terapia Caner-alvejado mTOR. Neste estudo, verificou-se que BEZ235 sozinho inibiu eficazmente o crescimento de células cancerosas resistentes a rapamicina. Curiosamente, a combinação de concentrações sub-óptimas de RAD001 e BEZ235 exercida inibição sinérgica do crescimento de células de cancro de pulmão humano, juntamente com a indução de apoptose e paragem em G1. Além disso, a combinação foi também mais eficaz do que qualquer dos agentes por si só na inibição do crescimento de xenoenxertos de cancro do pulmão em ratinhos. A combinação mostrou efeitos melhorados na inibição da sinalização de mTOR e redução da expressão de c-Myc e ciclina D1. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a combinação de RAD001 e BEZ235 é uma nova estratégia para a terapia do cancro

Citation:. Xu C-X, Li Y, Yue P, Owonikoko TK, Ramalingam SS, Khuri FR, et al. (2011) A combinação de RAD001 e NVP-BEZ235 Exerce sinérgica Anticancer Atividade contra Non-Small Cell Lung Cancer

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e20899. doi: 10.1371 /journal.pone.0020899

editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de março de 2011; Aceite: 12 de maio de 2011; Publicação: 14 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo prêmio Cancer Scholar Geórgia Cancer Coalition Distinguished, NIH R01 CA118450 e CA116676 P01 (Projeto 1), Departamento de Defesa IMPACT (Imaging and marcadores moleculares para pacientes com câncer pulmonar: Aproximações com Metas Molecular, /tratamentos inovadores complementares e terapêutica modalidades) Conceder à base de Biomarcador W81XWH-05-0027 (Project 5), Batalha (Abordagens de terapia direcionada para Lung Cancer Eliminação) prêmio W81XWH-06-1-0303 (Project 4) e BESCT (Biologia, Educação, Exibição, Quimioprevenção e Therapy) prêmio DAMD17-01-1-0689 (Project 2). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

K-Ras, receptor do factor de LKB1 e de crescimento epidérmico (EGFR) são frequentemente mutado no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Estas mutações resultam em activação aberrante da fosfoinositida 3-quinase (PI3K) /Akt /alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) via de sinalização [1], [2], [3]. Portanto, a via PI3K /Akt /mTOR via de sinalização emergiu como um alvo terapêutico promissor para NSCLC.

RAD001 (everolimus) é um derivado de rapamicina e é funcionalmente semelhante à rapamicina como um inibidor alostérico de mTOR. Em doentes com cancro de células renais avançado previamente tratados com agentes de VEGF alvo, RAD001 melhora a sobrevida livre de progressão e, portanto, foi aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA para esta indicação [4]. Ele também foi encontrada para melhorar a sobrevivência livre de progressão em pacientes com cancros neuroendcorine do pâncreas. Em muitos outros tumores sólidos órgão, RAD001 e outros análogos de rapamicina (rapalogs) os rapalogs exercer efeitos modestos anti-câncer, que, embora promissor, não são suficientes para justificar a monoterapia com esses agentes [5].

Os recentes esforços para melhorar a eficácia dos rapalogs têm-se centrado no desenvolvimento de novas estratégias de combinação. NVP-BEZ235 (BEZ235) é um romance e administrado por via oral PI3K dupla e inibidor de mTOR quinase. Este composto é um inibidor potente, tanto reversível de classe I e a actividade catalítica da PI3K cinase mTOR por competir no seu local de ligação de ATP [6]. BEZ235 está atualmente sob avaliação na fase I /II de ensaios clínicos. Em estudos pré-clínicos, BEZ235 induz marcante efeitos anti-proliferativos, tanto em ratinhos transgénicos com NSCLC-Ras oncogénica induzida por K e em linhas celulares que expressam NSCLC oncogénico K-ras. Além disso, ele efetivamente sensibiliza linhas celulares NSCLC expressando oncogénico K-Ras aos efeitos pró-apoptóticos da radiação ionizante, tanto

in vitro

e

in vivo

[7]. Quando BEZ235 foi combinado com um inibidor da MEK, marcado sinergia foi alcançado em encolher cancros do pulmão de murino mutante K-Ras [8].

Como a rapamicina, RAD001 provoca a activação de Akt em células de cancro humanas, incluindo células NSCLC, enquanto a inibição da mTOR sinalização [9]. Recentemente, relatou sobre a eficácia melhorada de uma combinação de RAD001 com um inibidor de PI3K sobre o crescimento de células NSCLC tanto

In vitro

e

In vivo

[9]. Curiosamente, BEZ235 poderiam superar a resistência, uma vez que a rapamicina inibiu eficazmente o crescimento de células NSCLC rapamycin- ou RAD001-resistente. Portanto, avaliou-se os efeitos da combinação de RAD001 e BEZ235 sobre o crescimento de células NSCLC e descobriram que a combinação era mais eficaz do que qualquer agente sozinho na inibição do crescimento de células NSCLC tanto

In vitro e

in vivo

. Este relatório irá documentar principalmente nossos resultados da investigação a este respeito.

Materiais e Métodos

Reagente

RAD001 e BEZ235 foram fornecidos pela Novartis Pharmaceuticals Corporation (East Hanover, NJ), dissolvido em DMSO e armazenado a -80 ° C. Policlonal de coelho anti-actina anticorpo foi adquirido de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Os anticorpos contra Akt, P-Akt (S473), p-S6 (S235 /S236), S6, p-4EBP1 (S65) p-4EBP1 (Thr37 /46), 4EBP1, eIF4G, eIF4E, e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), respectivamente, foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Policlonal de cabra mTOR (FRAP; N-19) e de rato monoclonal de c-Myc (9E10) anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), respectivamente. anticorpo policlonal de coelho Rictor (BL2178) foi adquirido a partir de Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX). anticorpo monoclonal de ratinho da ciclina D1 foi adquirido de DAKO (Carpinteria, CA).

Linhas Celulares e Cultura de Células

O NSCLC linhas de células de humano A549, H460 e H157 foram descritos anteriormente [10]. HCC827 foi adquirido da American Type Culture colecção ATCC (Manassas, VA). Rapamicina resistente linha de células A549 (A549-RR) foi estabelecido anteriormente [9]. Estas linhas celulares foram cultivadas em cultura em monocamada em meio RPMI 1640 suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera humidificada constituída por 5% de CO

2 e 95% de ar.

Ensaio de Inibição de crescimento

as células foram cultivadas em placas de cultura celular de 96 poços e tratadas no dia seguinte com os agentes indicadas. o número de células viáveis ​​foi estimado utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB), tal como previamente descrito [10]. índice de combinação (IC) de interacção de droga (por exemplo, a sinergia) foi calculada utilizando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ).

Ensaio de Formação de Colónias

Os efeitos da dada drogas sobre a formação de colónias em placas foram medidos como descrito anteriormente [11].

a detecção de apoptose

a apoptose foi avaliada por coloração de anexina V usando o kit de detecção de apoptose Anexina V-PE adquiridos a BD Biosciences ( San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Western blot análise

Preparação de lisatos de células inteiras de proteína e a análise Western blot foram descritos anteriormente [12], [13].

m

7GTP suspenso para Análise de eIF4F Formação do complexo

eIF4F complexa em extratos de células foi detectada utilizando cromatografia de afinidade m

7GTP-Sepharose como descrito anteriormente [14].

Detecção de complexos de mTOR (mTORCs)

mTORCs incluindo mTORC1 e mTORC2 foram imunoprecipitadas com anticorpo policlonal de cabra mTOR (FRAP; N-19) de anticorpos e seguiu com Western blot para detectar mTOR, ave de rapina e rictor, respectivamente, como descrito anteriormente [9].

Lung Cancer xenoenxertos e tratamentos

as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Emory. O número do protocolo é 222-2008. Cinco para ratos 6 semanas de idade atímicos fêmea (nu /nu) foram encomendados à Taconic (Hudson, NY) e alojados em condições livres de patógenos em gaiolas microisolator com ração de laboratório e água

ad libitum

. As células A549 em 5 × 10 s.c.

6 em meio isento de soro foram injectados na região do flanco de ratinhos nus. Quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 100 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n = 6 /grupo) de acordo com os volumes tumorais e os pesos corporais para os seguintes tratamentos: controlo de veículo, BEZ235 (20 mg /kg /dia, og), RAD001 (3 mg /kg /dia; og) e a sua combinação. Os volumes dos tumores foram medidos utilizando medições calibradas uma vez a cada dois dias e calculada com a fórmula

= π V (comprimento x largura

2) /6.

Análise Estatística

A significância estatística das diferenças entre os dois grupos ou entre vários grupos foi analisada com Student não pareado dois lados

t

testes (para variâncias iguais) ou com corrigido

t

teste de Welch (variâncias desiguais) ou one-way análise de variância (ANOVA) através do uso de Graphpad InStat 3 software. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a

P

. 0,05

resultados

BEZ235 Efetivamente inibe o crescimento de Rapamicina resistentes células NSCLC

um estudo prévio, foi estabelecido uma linha celular resistente a rapamicina (por exemplo, A549-RR). Esta linha celular é também resistente à RAD001 [9]. Nós antecipado que esta linha celular seria, pelo menos em parte, resistente aos BEZ235 uma vez que é uma PI3K e mTOR inibidor dual. Inesperadamente, BEZ235 demonstrou potente inibição do crescimento de células A549-RR (Fig. 1A). Além disso, BEZ235 também induziu apoptose em células A549-RR (Fig. 1B). De facto, a indução de apoptose e inibição de crescimento com BEZ235 foi ligeiramente mais eficaz em células A549-RR do que nas células A549 progenitor (Fig. 1). Assim, as células de rapamicina-resistentes não apresentam resistência cruzada a BEZ235.

Um

, As linhas de células indicadas foram semeadas em placas de 96 poços e, em seguida, tratado com diferentes concentrações de BEZ235 como indicado no segundo dia. Após 3 dias, os números de células foram estimadas utilizando o ensaio SRB. Pontos, os meios de quatro determinações replicadas; bares, SD ±.

B

, As linhas celulares indicadas foram plaqueadas em placas de 6 poços e depois tratou-se no dia seguinte com diferentes concentrações de BEZ235 como indicado. Após 24 e 72 h, as células foram colhidas e submetidas a detecção de apoptose Anexina V usando coloração. Colunas, através de determinações em duplicado; bares, ± DP.

A combinação de RAD001 e BEZ235 sinergicamente inibe o crescimento de células NSCLC juntamente com indução de apoptose e paragem G1

Nós anteriormente demonstrado que a combinação de rapamicina ou RAD001 com o LY294002 inibidor PI3K resultou em efeitos inibidores do crescimento reforçadas contra células NSCLC tanto

in vitro

e

in vivo

[9], [15]. Temos agora estudaram se a combinação de BEZ235 e RAD001 exerce aumentada atividade anti-câncer em células NSCLC. Inesperadamente, verificou-se que a combinação de baixas concentrações de BEZ235 e RAD001 foi muito mais potente do que cada agente isolado em inibir o crescimento de várias linhas celulares de NSCLC (por exemplo, A549, H460, H157 e HCC827). Os ICs para a maioria das combinações foram 1 (Fig. 2A, painéis da direita), indicando efeitos sinérgicos sobre inibir o crescimento de células NSCLC. Em concordância, a combinação de BEZ235 e RAD001 foi significativamente mais potente do que cada agente isolado na indução de apoptose (Fig. 2B) e a paragem em G1 (Figura 2C). (

P

0,001). Assim, a indução de reforço tanto apoptose e paragem do ciclo celular contribui para os efeitos inibidores do crescimento aumentada induzida pela combinação.

Um

, as linhas celulares indicadas foram semeadas em placas de 96 poços e em seguida tratada no dia seguinte com diferentes concentrações de BEZ235 (BEZ), RAD001 (RAD) e as respectivas combinações, como indicado. Após 3 dias, os números de células foram estimadas usando o ensaio de SRB e IC foram calculados com software CompuSyn (painéis da direita). Pontos, os meios de quatro determinações replicadas; bares, SD ±.

B

e

C

, As linhas celulares indicadas foram semeadas em placas de 6 poços e depois tratou-se com 10 nM BEZ235 sozinho, 2 nM RAD001 sozinho, e a sua combinação. Após 48 h, as células foram colhidas para detecção de apoptose utilizando coloração de anexina V (

Um

) e para análise do ciclo celular com uma citometria de fluxo (

C

). Colunas, através de determinações em duplicado; Bares, SD ±. *,

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***,

P Art 0,001 comparado com o controle DMSO; ###,

P Art 0,001 comparado com RAD001 ou BEZ235 sozinho

A combinação de RAD001 e BEZ235 inibe eficazmente a formação e crescimento de colônias de células NSCLC

determinou-se ainda mais os efeitos de longo prazo da combinação de RAD001 e BEZ235 sobre o crescimento de células NSCLC num ensaio de formação de colónias. Este ensaio permite a repetir os tratamentos durante um longo período de tempo (e.g., 12 dias). RAD001 a uma dose de 1 nM e BEZ235 a 5 nM por si só teve um efeito mínimo sobre a supressão da formação de colónias de células NSCLC; No entanto, a combinação seja eliminada a formação de colónias (por exemplo, A549) ou reduziu drasticamente o número de colónias (por exemplo, H460 e H157) (Fig. 3). Assim, é evidente que a combinação é muito mais eficaz do que qualquer agente isolado na inibição da formação de colónias e ao crescimento de células NSCLC (

P

0,001). Nós também comparou o efeito da sequência de administração dos dois agentes na formação de colónias de células NSCLC. Sob as mesmas condições experimentais descritas acima, os tratamentos sequenciais com RAD001 primeiro seguido por tratamento BEZ235 (RAD001 → BEZ235) ou BEZ235 primeiro seguido por tratamento RAD001 (BEZ235 → RAD001) apresentaram efeitos comparáveis ​​a cada um sozinho com supressão mínima do crescimento de colónias de células NSCLC . A combinação simultânea de RAD001 e BEZ235 foi muito mais potente do que qualquer tratamento sequencial na inibição da formação e do crescimento de colónias de NSCLC (

P

0,001) (Fig. 2). Portanto, a administração concomitante de RAD001 e BEZ235 é claramente superior aos tratamentos sequenciais na inibição do crescimento de colónias de células NSCLC.

As linhas celulares indicadas, a uma densidade de cerca de 200 células /poço foram semeadas em placas de 24 poços. No segundo dia, as células foram tratadas com 1 nM RAD001 (RAD), 5 nM BEZ235 (BEZ) ou as suas combinações concorrentes (RAD) + BEZ. As células também foram tratados com 1 nM RAD001 durante 6 dias seguido com 5 nM BEZ235 por mais 6 dias (RAD → BEZ) ou com 5 nM BEZ durante 6 dias, seguido de 1 nM com RAD001 por mais 6 dias (BEZ → RAD). Após 12 dias, as placas foram coradas para a formação de colónias de células com corante violeta de cristal. A imagem das colónias foi então levado usando uma câmera digital (

A

) e os números de colónias foram contadas (

B

). ***,

P Art 0,001 comparado com o controle DMSO; ###,

P Art 0,001 em comparação com todos os outros tratamentos

Nós ainda comparou os efeitos da combinação de RAD001 e LY294002 com tratamentos sequenciais na formação de colónias de células NSCLC. . Consistentemente, o tratamento de combinação em simultâneo, mas não o tratamento sequencial ou com RAD001 em primeiro lugar seguido por LY294002, LY294002 ou com seguido por RAD001, gerou efeitos aumentada na inibição da formação de colónias de células NSCLC (Fig. S1).

A combinação de RAD001 e BEZ235 exerce Aumentada Actividade contra o crescimento de NSCLC xenoenxertos em ratinhos nus

por causa dos efeitos inibidores do crescimento promissores da combinação RAD001 e BEZ235 em células NSCLC

in vitro

, nós em seguida, validou a eficácia da combinação contra o crescimento de tumores em ratinhos NSCLC. Ambos RAD001 e BEZ235 parcialmente, mas de forma significativa, inibiu o crescimento de xenoenxertos A549 (

P

0,01); No entanto, a combinação de RAD001 e BEZ235 foi significativamente mais potente do que cada agente isolado na inibição do crescimento dos xenoenxertos como medido por ambos os tamanhos e pesos dos tumores (

P

0,01) (Figs. 4A e 4B). Estes

in vivo

dados demonstram ainda que a combinação de RAD001 e BEZ235 exibe aumentada atividade anticancerígena. Observou-se um grau mais elevado de perda de peso em murganhos tratados com a combinação (até 19% dos ratinhos de controlo), especialmente durante o período de tratamento precoce. A diferença de peso no final do experimento melhorado para apenas 13% do controlo (Fig. 4C), sugerindo a possibilidade de adaptação e uma melhor tolerância do tratamento de combinação,

xenoenxertos A549 foram tratados (uma vez por dia) com veículos controlo, RAD001 (3 mg /kg, og), BEZ235 (20 mg /kg, og) e a sua combinação (BEZ + RAD) começando no mesmo dia após o agrupamento. Os tamanhos dos tumores (

A

) e peso corporal (

C

) foram medidos uma vez a cada dois dias. Após 14 dias, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram removidos e pesados ​​(

B

). Cada medição é a média ± DP (n = 6). Os números em

C

representam a perda de peso corporal no grupo de combinação em comparação com o grupo controle. *

P Art 0,05 comparado com o controle do veículo; **

P Art 0,01 em comparação com o controle do veículo; ***

P Art 0,001 comparado com o controle do veículo;

##

P Art 0,01 em comparação com RAD001 ou com BEZ235

A combinação de RAD001 e BEZ235 exerce efeitos sobre a supressão da sinalização mTOR e regulação negativa do c melhorada. -Myc e ciclina D1

Para obter insights sobre os mecanismos pelos quais a combinação de exercem reforçada atividade anticancerígena RAD001 e BEZ235, foram analisados ​​os efeitos da combinação de sinalização mTOR e na expressão de suas proteínas reguladas em comparação com qualquer dos agentes isolados. Nas doses testadas, BEZ235 teve um efeito mínimo nos níveis de p-S6 reduzidas, mas nenhum efeito sobre os níveis de p-4EBP1 (ambos S65 e T37 /46), c-myc e ciclina D1. Na verdade, foi observado o aumento dos níveis de 4EBP1 (T37 /46) (em ambos A549 e H157) e c-Myc (por exemplo, na H157). RAD001 a 2 nm fortemente inibida S6 e 4EBP1 fosforilação (S65), mas não reduziu os níveis de p-4EBP1 (T37 /46), c-Myc e ciclina D1. Semelhante a BEZ235, RAD001 também aumentou os níveis de p-4EBP1 (T37 /46) e de c-Myc em ambas as células A549 e H157. No entanto, a combinação de RAD001 e BEZ235 seja revogada o aumento da P-4EBP1 (T37 /46) (por exemplo, em células A549) induzida pelo agente único ou efeito melhorado exercida sobre a redução (46 t37 /) os níveis de p-4EBP1 (por exemplo, em células H157). Importante, a combinação de RAD001 e BEZ235 tinha aumentado efeitos na redução dos níveis de c-Myc e ciclina D1 em ambas as células A549 e H157, em comparação com cada um dos agentes isoladamente (Fig. 5).

Um

, as linhas celulares indicadas foram plaqueadas em 10 placas de cultura de células cm de diâmetro e tratou-se no dia seguinte com as concentrações indicadas de BEZ-235 na ausência e na presença de RAD001 durante 24 h. As células foram então colhidas para a preparação de lisados ​​proteicos de células inteiras e subsequente análise de Western blot para detectar as proteínas indicadas.

B

, As linhas de células indicadas foram tratados com 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 ou sua combinação. Após 24 h, as células foram colhidas para a preparação de lisados ​​proteicos de células inteiras e subsequente m

7GTP ensaio de pull-down seguido com a análise de Western blot para detectar as proteínas dadas.

RAD001 aumento Akt fosforilação em ambas as linhas de células A549 e H157 como anteriormente relatado [9]. Curiosamente, em doses baixas, BEZ235 também aumentou os níveis de P-Akt. A presença de BEZ235 na dose testada varia quer fracamente reduziu os níveis de P-Akt induzida por RAD001 (por exemplo, em células A549) ou não afectou aumento induzido por RAD001 em P-Akt (por exemplo, em células H157) (fig. 5). Assim, parece que a combinação RAD001 e BEZ235 pode indicar efeitos avançados em suprimir a sinalização mTOR ea expressão de suas proteínas reguladas com pouca ou nenhuma efeitos inibidores da Akt fosforilação.

A combinação de RAD001 e BEZ235 Exerce avançado efeitos na supressão montagem eIF4F

Uma vez que a sinalização mTOR é conhecida para regular positivamente a iniciação da tradução dependente de tampão, analisou-se ainda mais os efeitos da combinação e RAD001 BEZ235 no tampão de ligação e de eIF4E eIF4G (por exemplo, a montagem eIF4F) com o m

7GTP-Sepharose puxar para baixo ensaio. Como apresentado na Fig. 5B, RAD0001 e BEZ235 sozinha reduziu as quantidades de eIF4G que interagiram com eIF4E. No entanto, a combinação de RAD001 e BEZ235 era muito mais eficaz do que qualquer dos agentes por si só na diminuição dos valores de eIF4G que se ligam a eIF4E. Estes resultados indicam claramente que a combinação de RAD001 e BEZ235 exerce efeitos sobre a supressão da ligação de eIF4E e montagem eIF4G ou eIF4F tampa reforçada.

A combinação de RAD001 e BEZ235 não apresenta efeitos reforçada em Inibindo a Assembleia da mTORCs

sabe-se que o conjunto ou a associação da mTOR com os seus parceiros (por exemplo, aves de rapina e rictor) é essencial para a atividade das enzimas distintas e funções biológicas. RAD001, como rapamicina, suprime a sinalização mTOR inibindo a montagem das mTORCs [16]. Assim, nós ainda determinado se a combinação de RAD001 e BEZ235 exerceu efeitos inibitórios reforçada sobre a montagem dos mTORCs incluindo mTORC1 (mTOR /ave de rapina) e mTORC2 (mTOR /rictor). Para este fim, fizemos imunoprecipitação (IP) com o anticorpo anti-mTOR para puxar para baixo tanto mTORC1 e mTORC2 e depois seguiu com o Western Blot para detectar raptor e rictor nos imunoprecipitados. Como apresentado na Fig. 6, BEZ235 teve efeitos mínimos sobre a redução dos níveis de rapina e rictor nos imunoprecipitados, enquanto RAD001 reduziu substancialmente os níveis de ambos rapina e rictor puxado para baixo pelo anticorpo mTOR. A combinação de RAD001 e BEZ235 tinham potência semelhante à RAD001 sozinho na redução dos níveis de raptor e rictor nos imunoprecipitados, indicando que a combinação não apresenta efeitos avançados em inibir a montagem de mTORC1 e mTORC2.

A549 As células foram tratadas com 2 nM RAD001, 10 nM BEZ235 ou sua combinação. Após 24 h, as células foram colhidas para a preparação de lisados ​​de proteína de célula inteira e subsequente blotting IP-ocidental.

Discussão

O desenvolvimento de resistência a rapamicina é uma questão crítica no tratamento de cancro com rapamicina e os seus análogos [17]. BEZ235 é um inibidor de PI3K e mTOR quinase dupla [6]. O nosso estudo mostrou que BEZ235 inibiu o crescimento de células de rapamicina-resistentes e a apoptose induzida de forma tão eficaz como o fez nas células parentais correspondentes. De facto, as células de rapamicina-resistentes foram ligeiramente mais sensível do que as células parentais para BEZ235 (Fig. 1). Estes dados sugerem que as células resistentes a rapamicina não são uma resistência cruzada ao BEZ235. Uma vez que esta linha celular tinha sido demonstrado ser totalmente resistentes à RAD001, os nossos resultados sugerem que BEZ235 inibe o crescimento das células cancerosas através de mecanismos diferentes dos que medeiam as acções de rapalogs. Será interessante saber se BEZ235 possuem mecanismo adicional para além dupla inibição da PI3K e BEZ235. Ao lado, os nossos dados implicam também que BEZ235 pode ser utilizado para ultrapassar a resistência de rapamicina.

Embora BEZ235 inibe tanto PI3K e mTOR, em combinação com RAD001, exerce efeitos sinérgicos na inibição do crescimento de um painel de células NSCLC quanto demonstrada em uma cultura monocamada de 3 dias (com o ensaio SRB) e num ensaio de 12 dias a formação de colónias de longo prazo (Figs. 2 e 3). Esta sinergia é provavelmente devido a efeitos melhorados na induo da paragem do ciclo celular G1 e apoptose (Fig. 2). Em concordância, a combinação de RAD001 e BEZ235 foi significativamente mais eficaz do que qualquer agente em inibir o crescimento de xenoenxertos de NSCLC em ratinhos nus (Fig. 4). No estudo animal, notou-se que a combinação inicialmente causou uma perda significativa de peso corporal (até 19% do controle); No entanto, no final da experiência, os ratinhos que receberam o tratamento de combinação pareceu recuperar alguma da perda de peso (13% do controlo). Isto sugere que os ratinhos podem adaptar-se e, eventualmente, tolerar o tratamento com a combinação de RAD001 e BEZ235. No entanto, devemos potencial ciente reforçada efeitos adversos causados ​​pela combinação enquanto a combinação mostra atividade anticancerígena sinérgica promissor.

Os esquemas de tratamento podem afetar o resultado final do dado terapia combinatória. Neste estudo, verificou-se que os tratamentos sequenciais com RAD001 seguido por BEZ235 ou com BEZ235 seguido de RAD001 minimamente inibiu o crescimento de colônias NSCLC; Em contraste, o tratamento concomitante de RAD001 e BEZ235 inibiu substancialmente o crescimento de colónias de CPCNP ou eliminada a formação de colónias (Fig. 3). Isto também é verdade para a combinação de rapamicina e LY294002 (Fig. S1). Nossos dados sugerem que a combinação simultânea de RAD001 e BEZ235 pode ser ótimo para o desenvolvimento desta combinação.

O IC

50 anos (concentrações de inibir o crescimento de células 50%) do BEZ235 em células NSCLC humanas variam de 10 nM a 100 nM (os dados não publicados). Em nossos experimentos de combinação, que normalmente usadas faixas baixas doses de BEZ235 (por exemplo, 1-10 nM). A estas doses, BEZ235 teve um efeito inibidor fraco da p-S6 fosforilação mas não modular a fosforilação de P-4EBP1 ou os níveis de c-Myc e ciclina D1. A uma dose de 2 nM, RAD001 inibia eficazmente a fosforilação de S6 e 4EBP1 (S65), mas não suprimir 4EBP1 fosforilação (T37 /46) e c-myc e ciclina D1 expressão. No entanto, a combinação de RAD001 e BEZ235 inibia eficazmente a fosforilação de P-4EBP1 (em T37 /46) e reduziram os níveis de c-Myc e ciclina D1 (Fig. 5A). Além disso, mostramos que a combinação de RAD001 e BEZ235 foi muito mais potente do que qualquer agente isolado na inibição da ligação de eIF4E e eIF4E ou montagem eIF4F (Fig. 5B) o tampão, o que implica que a combinação exerce reforçada efeito inibitório sobre a iniciação dependente do tampão . Desde c-Myc e ciclina D1 são conhecidos por ser regulado pela mTOR sinalização através da tradução de proteínas dependentes de cap [18], os nossos dados indicam que a combinação de RAD001 e BEZ235 exerce efeito melhorado na inibição da sinalização mTOR e a expressão da sua regulamentada proteínas oncogénicas (por exemplo, c-Myc e da ciclina D1). Este efeito pode contribuir para a actividade sinérgica contra o crescimento de células NSCLC

in vitro

e

in vivo

pela combinação de RAD001 e BEZ235.

Neste estudo, RAD001 aumento da fosforilação de Akt, tanto em células A549 e H157; isso está de acordo com os nossos relatórios anteriores [9]. Nas concentrações testadas (por exemplo, 1-10 nM), BEZ235 aumentou os níveis de P-Akt, bem. Esta observação é consistente com um relatório anterior, em que BEZ235 foi demonstrado que o aumento da fosforilação de Akt em doses baixas (por exemplo, 10 nM) [19]. Tinha sido anteriormente mostrado que as concentrações mais elevadas de BEZ235 são necessários (por exemplo, 100 nM) para inibir Akt quando comparada com que (por exemplo, 10 nM) necessária para inibir a fosforilação S6 [19]. Assim, parece que BEZ235 possui essencialmente actividade inibidora de mTOR nas gamas baixas concentrações. Consequentemente, é compreensível que BEZ235 em gamas baixas de concentração aumenta a fosforilação de Akt como seria de esperar de um rapalog [9], [15]. Curiosamente, a combinação de RAD001 e BEZ235 não reduziu os níveis de P-Akt, que foram tão elevados como aqueles em células tratadas com RAD001 ou BEZ235 sozinho (Fig. 5). Dado que a combinação de RAD001 e BEZ235 inibe eficazmente o crescimento de células NSCLC, como discutido acima, parece que a combinação de RAD001 e BEZ235 pode exercer uma actividade anti-cancerígena melhorada com níveis elevados de P-Akt.

exerce a sua mTOR papéis críticos na promoção da progressão do ciclo celular e a proliferação de células, principalmente através de interacções com outras proteínas, tais como rapina (formando mTORC1) e rictor (formando mTORC2) [18], [20]. mTORC2 geralmente é pensado para ser insensível a rapalogs [18]. No entanto, o tratamento prolongado com estes inibidores de mTOR atrapalha a montagem do mTORC2 como demonstrado por nós [9] e outros [21]. Neste estudo, depois de um tratamento de 24 h, RAD001, mas não BEZ235, inibem efectivamente a montagem ou a actividade de ambas mTORC1 e mTORC2. A combinação de RAD001 e BEZ235 não reduzir ainda mais os níveis de raptor e rictor nos imunoprecipitados (Fig. 6), demonstrando que a combinação não apresenta efeitos reforçada em inibir a montagem de mTORCs. Com base nestas observações, especula-se que os efeitos avançados sobre a supressão da sinalização mTOR pela combinação é provavelmente devido a seus efeitos distintos sobre inibir a montagem mTORC ea actividade mTOR quinase. É geralmente acreditam que uma sinergia é conseguido através de uma empresa de dois fármacos que funcionam através de mecanismos distintos. Desde BEZ235 inibe eficazmente o crescimento das células de rapamicina-resistente, é também possível que a sinergia entre RAD001 e BEZ235 contra o crescimento das células do cancro do pulmão ocorre através de um mecanismo desconhecido de BEZ235, que necessita de uma investigação mais aprofundada.

em resumo, o presente estudo demonstrou que a combinação de RAD001 e o BEZ235 inibidor de PI3K /mTOR exibe inibição sinérgica no crescimento de células NSCLC

in vitro

e

In vivo

e, assim, representa um nova estratégia para melhorar a eficácia da terapia de câncer direcionada-mTOR. Nossos resultados fornecem a justificativa para avaliar esta combinação em ensaios clínicos para pacientes com doenças malignas rapalog-sensíveis e refratários.

Informações de Apoio

Figura S1.

combinação concomitante de rapamicina e LY294002 é mais eficaz do que os tratamentos sequenciais na inibição da formação e do crescimento de colónias de NSCLC. As linhas celulares indicadas, a uma densidade de cerca de 200 células /poço foram semeadas em placas de 24 poços. No segundo dia, as células foram tratadas com 1 nM de rapamicina (RAP) sozinho, 5 nM de LY294002 (LY) sozinho, a combinação simultânea de rapamicina e LY294002 (Rap + LY), rapamicina, durante 3 dias e, em seguida, transferido para o tratamento LY294002 (Rap → LY), LY294002 por 3 dias e depois passou para o tratamento de rapamicina (LY → Rap). Os mesmos ciclos de os tratamentos foram repetidos a cada 3 dias. Após 12 dias, as placas foram coradas para a formação de colónias de células com corante violeta de cristal. A imagem das colónias foi então levado usando uma câmera digital (A) e as colónias foram contadas (

B

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020899.s001

(PDF)

Reconhecimentos

TKO, SSR, FRK e S-Y.S.