Abstract

Apesar de bloqueio do receptor andrógeno sinalização (AR) representa o principal tratamento para o câncer de próstata avançado (AEP), muitos pacientes progredir para um fenótipo letal de câncer de próstata “resistente à castração” (CR-PRCA ). Com a hipótese de que, no início, a AEP pode abrigar uma população de células cancerosas andrógeno-sem resposta como precursores de doença CR-recorrente, que se comprometeu a propagação de células andrógeno-independente a partir de amostras PRCA-prostatectomia de início, casos localizados (Fase-I). Uma coleção de 120 espécimes cirúrgicos de casos de prostatectomia foi estabelecida, entre os quais 54 eram adenocarcinomas. condições de cultura celular isento de hormonas foram desenvolvidas permitindo a propagação de rotina de células que expressam marcadores de células basais da próstata e da haste marcadores de células /progenitoras, e que proliferaram como esferas /esferóides em culturas em suspensão. As colónias de células epiteliais independente de androgénios cresceu a partir de 30/43 (70%) dos casos de adenocarcinoma estudadas em detalhe. A microscopia de fluorescência e citometria de fluxo mostrou que as células RC-AEP foram positivas para CD44, CD133, CK5 /14, c-kit, integrina α2β1, SSEA4, E-caderina e aldeído desidrogenase (ALDH). Todas as 30 culturas de células CR-AEP também foram TERT-positivo, mas negativo para TMPRSS2-ERG. Além disso, um subconjunto de 22 destas culturas de células CR-AEP foi examinada por xeno ortotópico em murganhos SCID intactos e castrados, gerando AEP ou indiferenciadas cancros humanos histologicamente típicos localmente invasivos, respectivamente, em 6-8 semanas. Culta células AEP e ortotopicamente induzida por

in vivo

cancros faltava expressão PSA. Relatamos aqui a propagação de células de iniciação Cancro (CIC) do Estágio I diretamente tecido AEP humano sem seleção ou da manipulação genética. A propagação de células CR-PRCA-tronco /progenitoras-like derivadas de carcinomas iniciais da próstata humanos sugere a existência de uma subpopulação de células resistentes à terapia de privação de androgênio e que podem conduzir ao aparecimento posterior de disseminada CR-PRCA.

Citação: Fiñones RR, Yeargin J, Lee M, Kaur AP, Cheng C, Sun P, et al. (2013) As células precoce do câncer de próstata humano Adenocarcinomas Porto andrógeno-independentes. PLoS ONE 8 (9): e74438. doi: 10.1371 /journal.pone.0074438

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 03 de maio de 2013; Aceito: 01 de agosto de 2013; Publicação: 25 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fiñones et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Todos os fundos foram generosamente fornecidos através do San Diego Foundation UC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o bloqueio do receptor de andrógeno sinalização (AR) representa o principal tratamento para câncer avançado de próstata [1]. No entanto, muitos pacientes evoluem para um fenótipo fatal de câncer de próstata “resistente à castração” (CR-AEP). Como AEP é heterogênea [2], [3], a hipótese de que no início AEP pode conter uma população de células cancerosas andrógeno-indiferente que serve como precursores de doença CR-recorrente. Nós embarcou na identificação de células andrógeno-independente a partir de amostras PRCA-prostatectomia de início, localizadas casos (Fase-I), contidos dentro da próstata.

A existência de células-tronco da próstata epitelial é amplamente aceito com base no extraordinária capacidade regenerativa da próstata [4] – [6]. Embora a retirada de androgénio induz a apoptose de células epiteliais luminais, as células basais permanecer intacta, permitindo uma rápida regeneração mediante substituição de androgénio e sugerindo que as células estaminais da próstata residem na camada de células basais. As células luminais da próstata têm sido mostrados para dar origem a AEP humano na sequência de sobre-expressão de genes específicos [7]. De nota, as células-tronco /progenitoras não foram propagadas num estado não alterado desde estágios iniciais do CR-AEP [8], [9]. Apesar da presença de células cancerosas de iniciação (CIC) em linhas de células imortais AEP derivado de PRCA metastático [10], o papel das células-tronco /progenitoras epiteliais na geração de próstata CIC permanece indefinida [11].

Current modelos sugerem que prca inicia-se com o desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial prostática (PIN), tornando-se o adenocarcinoma localmente invasivo, seguido de androgénio dependente metastático e, finalmente, cancro independente de androgénios [4], [12], [13]. Utilizar marcadores da superfície das células, o isolamento do CIC próstata tem sido relatada [14] – [16]. Em ratinhos, a introdução de AKT cinase constitutivamente activa nas células epiteliais da próstata Sca-1-enriquecida resultou na iniciação do tumor [17] e, em células humanas, a sobre-expressão de AKT, ERG e AR nas células luminais cancro da próstata gerado [7] . Em espécimes de Fase I humano próstata, 0,1% de células-tronco expressas câncer de próstata /marcadores de células progenitoras-like, incluindo CD44, CD133, CK5 /14 e integrina α2β1 [18], [19]. É importante ressaltar que as células AEP primárias podem ser imortalizado por hTERT gene de transferência, e apresentam elevado potencial de auto-renovação [9], [20].

Relatamos aqui a propagação do CIC do Estágio I diretamente tecido AEP humano sem selecção ou manipulação genética. Uma coleção de 120 espécimes de prostatectomia cirúrgica foi estabelecida, entre os quais 54 amostras eram adenocarcinomas. Hormonas e condições de cultura de células isentas de soro foram desenvolvidos para permitir o estabelecimento de rotina de células que expressam marcadores de células basais da próstata e do caule marcadores de células /progenitoras, e que proliferaram como esferas /esferóides em culturas em suspensão. Além disso, as células de AEP derivadas de carcinoma foram propagadas com êxito a partir de 30/43 destes casos de adenocarcinoma. Destes, culturas de células derivadas de AEP 22 amostras de adenocarcinoma foram ainda examinados por xeno ortotópico e verificou-se gerar cancros típicos da próstata, tumores indiferenciados ou, respectivamente, em modelos de xenoenxerto em ratinhos SCID ortotópicos hormonalmente intactas e castradas. As células cultivadas são células cancerosas andrógeno-independente “resistente à castração” e assim satisfazer

in vitro Comprar e

In vivo

critérios da CIC. células CR-AEP propagada como descrito aqui pode agora ser usado para analisar os mecanismos de auto-renovação [21] -. [23], as alterações na expressão genética, a selecção de novas mutações, progressão, metástase e respostas terapêuticas

métodos

métodos experimentais são apresentados em métodos S1.

Declaração de Ética

Todas as amostras humanas foram anonimamente codificados e obtidos de acordo com UCSD IRB # 130397. Todos os procedimentos realizados no trabalho descrito foram meticulosamente descrito ao UCSD-IRB e foram apresentados para, revisada e autorizada pela cheia UCSD Institutional Review Board. Um pacote de Consentimento Informado detalhado que foi escrito especialmente para este estudo foi amplamente explicado a cada paciente doação de tecidos, antes dos procedimentos clínicos e, quando compreendidos e acordados por cada paciente, foi devidamente assinados por cada paciente. Esses registros estão arquivados nos respectivos departamentos clínicos. Todo o processo foi totalmente documentado em papel e digital, como parte dos dados clínicos do paciente; esses registros são salvos. A equipa de investigação não tenha tido acesso, atualmente não tem acesso e no futuro não terá acesso a quaisquer detalhes de identificação ou clínicos nem dados dos pacientes de acompanhamento. Não havia nenhum pessoal sobreposição entre a clínica e as equipes de pesquisa, atividades que ocorrem em edifícios separados no Campus UCSD em La Jolla. pacientes consentiram foram inseridos no estudo consecutivamente, sem qualquer categorização, seja em exposição socioeconômica, racial, religiosa, nutritivo, ambiental ou bases semelhantes. Todas as amostras de tecidos estudados foram doados à conclusão de procedimentos de prostatectomia clínicos. Esses procedimentos são, e foram meticulosamente cumpridos e tenham sido autorizados pela Comissão de Ética da UCSD-IRB. Os protocolos de procedimento são, e foram re-visitou e re-autorizada pelo Comité de UCSD-IRB numa base anual. a privacidade do paciente e consente são levados muito a sério na UCSD.

uso ético dos camundongos deficientes imunológico para o transplante de tecido de recombinação eo transplante ortotópico de células de cancro da próstata humano obtido-ER foi examinado e autorizado pela UCSD IACUC autoridades por meio do protocolo de animais # S07410. Os Comitês IACUC foram apresentados com todos os aspectos das experiências, incluindo a origem das células humanas transplantadas, os consentimentos informados, etc. e ter autorizado o trabalho sobre os direitos dos animais éticos e sobre bases humanitárias.

Resultados

O crescimento da próstata primário epiteliais culturas

Depois de triagem numerosos meios de comunicação social, fatores de crescimento, matriz extracelular e combinações ambientais, as células AEP foram propagadas a partir de Estágio I humano prostrar carcinomas como descrito (ver métodos S1), usando meio sintético sem soro ou androgénios. colónias individuais de células epiteliais foram observados dentro de 3 d após o plaqueamento em meio de crescimento ( “Medium 6

+++”), e pelo 7-9 d o número de colónias era estável. Estas culturas propagadas para formar epiteliais, células de favo de mel, que manteve estreito contato célula-célula (Fig 1A), e que exibiu um grupo pequeno, compacto de células provisoriamente designado como um Cluster Cancer Cell (CCC) (Fig 1B-D) . colônias de células AEP inicialmente dividida com um tempo de duplicação de ~ 20 h (Fig 1E). As culturas foram passadas até por volta do 8

th passagem ou -30 população duplicações, pelo qual as células de ponto começou a adotar um grande, achatada morfologia e foram positivos para associados a senescência β-galactosidase (Fig 1F). Os resultados de 43 dos 54 casos diagnosticados como adenocarcinomas da próstata de Gleason Pontuação variando de 6-9 estão resumidas (Tabela S1). Tabela S1 também lista o número de colónias epiteliais obtidas a partir de cada uma das amostras 30 de adenocarcinoma que produziram colónias epiteliais. Os restantes 13 amostras de adenocarcinoma não produziu colónias e não foram adicionalmente estudados.

(A), a morfologia celular típica é mostrada, com a maioria das células geradas a partir de amostras primárias AEP exibem uma morfologia apertado, em favo de mel. (B-D) Exemplos são mostradas (ver setas) de clusters semi-aderentes, Clusters célula cancerosa (CCCS), originários de colónias individuais denominado. Barra de escala = 100 pm. (E) o crescimento de células de AEP a partir de um único CCC em 3 pontos do tempo após a primeira observação da colónia: 0, 24, e 48 h, quantificado por análise de imagem. ensaio (F) senescência das células em 8

th passagem, que mostra a coloração positiva para associada à senescência β-galactosidase. Barra de escala = 50 uM.

Como controlos, amostras obtidas por ressecção transuretral e diagnosticados como hiperplasia prostática benigna (BPH) foram processadas e cultivadas de forma idêntica à das amostras de adenocarcinoma. Apenas 2 de 50 amostras diagnosticados como casos de hiperplasia prostática benigna gerado números baixos (3-10) de mal-crescentes colônias epiteliais.

Os dados aqui apresentados demonstram a existência de células que podem ser diretamente propagados por câncer de próstata Fase-I em meio definido sem soro ou androgénios. A propagação de células andrógeno-independentes e induzindo câncer desde o início (fase I) adenocarcinoma da próstata humana não foi descrito anteriormente.

expressão celular do marcador por células AEP

Early-passagem células PRCA expandiu a partir de colónias individuais foram testados por imunofluorescência indireta para marcadores de células progenitoras de próstata integrina α2β1, CK5 /14, CD44 e CD133. culturas de passagem antecipada continha ambos os grupos de células visíveis e um halo de expansão da progênie de células epiteliais que expressam integrina α2β1, CK5 /14 e CD44 (Fig 2A-C). expressão CD133 foi limitada a células em clusters apertados (Fig 2D), mas logo foi perdida depois passaging

CCC próstata e epiteliais da próstata que envolve as células AEP manifestou:. (A) integrina α2β1 (vermelho); (B) de peso molecular elevado peso citoqueratina (CK5 /14) (vermelho); (C) CD44 (verde); e (D) CD133 (verde). Nuclei detectadas com DAPI (azul). Citometria de fluxo de mesmos marcadores é apresentado para células AEP agrupados e CCCs: (E) integrina α2β1 (-99% positiva); (F) CK5 /14 (~48% positiva); (G) CD44 (~98% positiva); e (H) CD133 (~38% positivo). Expressão de CD133 diminuiu rapidamente nas transferências de colónias posteriores, que se correlaciona com a diluição progressiva da CD133

+ CCCs, em relação a proliferar mais rapidamente CD133

lo /-. Células AEP

por citometria de fluxo , células de AEP expressa α2β1 integrina (Figura 2E), de elevado peso molecular (de células basais) citoqueratina CK5 /14 (Figura 2F), e CD44 (Figura 2G). CD133 foi expresso em culturas de passagem precoce (Figura 2H), mas a expressão foi perdida na excrescência em folhas de células epiteliais. Assim, a gama da expressão de CD133 por nossas culturas de células de AEP diminuiu rapidamente a partir de cerca de 50% em colónias recém explantados para níveis indetectáveis ​​à passagem de cultura e 2 acima.

colónias celulares AEP foram também ensaiadas para a haste da próstata /progenitor e marcadores de diferenciação. Duas vezes para coloração p63, CK8 /18, e c-kit, em conjunto com CD44, foi realizada. A p63 marcador de células basais foi principalmente localizada no núcleo em células /CCC AEP (fig. S1A), como é vulgarmente encontrado em células basais da próstata normais. Apesar de a p63 tende a ser underexpressed em adenocarcinomas [24], algumas linhas celulares de carcinoma da próstata em cultura foram mostrados para expressar p63 nuclear [25]. Além disso, a p63 citoplasmática tem sido associada com a mortalidade do cancro da próstata [26]. células /CCC prca cultivadas também expressa a diferenciação da próstata (célula luminal) marcador CK8 /18 (Fig. S1B), e c-kit (Fig. S1C), que co-localizada com CD44. As células cultivadas AEP manifestou nem cromogranina A nem PSA. A surpreendente falta de expressão do PSA foi confirmada utilizando anticorpos específicos 8-PSA em 22 diferentes culturas de células de AEP diferentes (dados não mostrados).

Expressão do aldeído desidrogenase (ALDH) haste enzima especifica para a célula

ALDH, enzima responsável para a oxidação de aldeídos a ácidos carboxílicos um desintoxicante, serviu como um marcador funcional [27], [28] para a presença de células-tronco e CIC numa ampla variedade de cancros [29] – [31]. No cancro da mama CIC, o isótipo ALDH1A3 predomina e é preditivo de metástases [32], enquanto que no cancro da próstata predomina o isotipo ALDH7A1 [33]. Nos nossos células cultivadas prca, de ALDH foi fortemente expressa (90,0% para PR # 109), mas foi reduzida para 9,8% na presença de a-dietilaminobenzaldeído específico inibidor da ALDH (DEAB) (Figura 3). As células MCF7 foram usadas como um controlo negativo ALDH-nestas experiências (dados não apresentados). Com o aumento do número de passagens, de ALDH expressão em células de AEP diminuiu, atingindo menos de 1% depois de 6 passagens (dados não mostrados).

prca # 109 células, TR.1 foram tripsinizadas, feito reagir com o substrato ALDH1A1 BODIPY- aminoacetaldeído (BAAA). O inibidor da ALDH DEAB foi adicionado a um tubo de as mesmas células de controle para mostrar a especificidade da detecção de BODIPY-activadas fluorescentes-ALDH1. O sinal de ALDH1 fluorescente mediana de 3 × 10

5 unidades de -200 foi inibida pelo inibidor × DEAB. 90,0% de células ALDH1-brilhante (A e C) foram reduzidos a 9,8% na presença do inibidor da ALDH DEAB (B e D). O ponto-parcelas relevantes são mostrados na direita, e um gráfico de contorno comparando a fluorescência-ativado ALDH e que de células em que a reação foi inibida por DEAB é mostrado abaixo (E).

Adicionalmente , a expressão do isotipo ALDH7A1 foi demonstrada por imunof luorescência indirecta em 12 culturas de células de AEP cultivadas diferentes testadas (Fig. S2). Expressão da ALDH7A1 isótipo em células cultivadas AEP aqui é consistente com a sua expressão relatada em AEP humano e nas seções imuno de PRCA humana e suas metástases [33].

células AEP cultivadas facilmente gerar independente de ancoragem esferas /esferóides em Matrigel culturas

em contraste com células diferenciadas, as células-tronco /progenitoras normais e iniciando o cancro proliferam para formar esferas /esferóides sob condições de cultura independente de ancoragem [34]. células AEP aderentes foram tripsinizadas para as células individuais, passados ​​através de um filtro de 40 mm e 10

4 células semeadas em culturas de suspensão de Matrigel. Isto resultou na geração de esferas que crescem em Matrigel por 90% das células individuais em suspensão (Figura 4), que é independente da classificação de Gleason (6-9) dos dadores de cancro. Após a coloração núcleos de células com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole), o número de células por esfera crescimento foi quantificado como 88 ± 9,7 células por colónia (Fig 4A). Exemplos de esferas na cultura em suspensão de Matrigel são mostrados (Figura 4B) na forma de esferas são depositadas em lâminas de microscópio de vidro por citocentrifugação (Figura 4C). Esferas persistiu na expressão de ALDH1, CD44, integrina α2β1, SSEA4 e TERT (não mostrado). Com transmissões sucessivas de células AEP aderentes na proporção 01:03 subcultura, uma fração diminuindo gerado esferas Matrigel, com 0,1% mantendo essa capacidade por passagem 7.

Baixa passagem, as células AEP aderentes (# 76 , TR 2) foram tripsinizadas e suspensas em Matrigel em meio 6

+++. culturas em suspensão foram cultivadas por 14 dias e esferas de culturas réplica foram colhidas nos dias 1, 4, 7, 9, 11 e 14. As culturas foram digeridos com dispase, peletizadas em lâminas de microscópio por citocentrifugação e fixas com metanol. (A) O tamanho das esferas foi determinada por contagem das células de 200 esferas coradas em cada ponto de tempo. (B) esferas de ponto de tempo precoces e tardias foram fotografados em um microscópio invertido. (C) esferas colhidas representativos crescente 1, 4, 7, 11 e 14 dias em culturas de Matrigel, e depositados em lâminas de microscópio para imagens, contagem e coloração de anticorpos.

células CR-PRCA expressar inversa telomerase transcriptase (TERT) enquanto que as células epiteliais da próstata humana normais são terc-negativo

TERT expressão por células de AEP descritos aqui foi ensaiada por transcriptase reversa-Reacção em Cadeia da polimerase (RT-PCR) (Figura 5A). Todos os 30 adenocarcinomas que renderam CR-PRCA células cultivadas apresentados na Tabela S1 expressa RNA TERT. ARN extraído da linhagem celular teratoma humano NTERA serviu como um controlo terc-positivo, enquanto que as células epiteliais humanas normais da próstata (NPREP) jovens derivadas de dadores foram terc-negativo (n = 3).

(A) TERT . amplificação RT-PCR de ARNm isolado a partir de células de AEP para a expressão do (TERT) enzima telomerase Transcriptase Reversa. Todas as 30 culturas PrCaCell testados expressou TERT, enquanto as células NPREP cultivadas a partir de três doadores jovens não expressam o gene TERT. A linha celular imortal NTERA (teratoma humano normal) foi utilizado como controlo terc-positiva. (B) TMPRSSG-ERG. Os resultados de RT-PCR de culturas PrCaCell não mostram evidência de um mRNA de fusão TMPRSS2-ERG, enquanto as células da linhagem humana vertebral metástase da próstata célula cancerosa VCaP expressam o mRNA de fusão.

Cultivadas CR-PRCA células não expressam níveis detectáveis ​​do TMPRSS2-ERG RNA de fusão

Ainda não está claro se a expressão do mRNA de fusão TMPRSS2-ERG em uma célula de cancro da próstata serve como um importante driver para suas características tumorigênicos [33], ou se o evento de fusão ocorre

como resultado de um estado

célula tumoral responsivos aos andrógenos, conforme sugerido por indução do evento de fusão em células epiteliais prostáticas normais em resposta ao androgénio [35], [36]. Independentemente, do AEP 30 amostras independentes de cultura, todos foram negativos para a expressão de ARNm de fusão TMPRSS2-ERG por RT-PCR (Fig 5B). Uma vez que o ARN de fusão TMPRSS2-ERG pode ser difícil de detectar [37], utilizou-se vários conjuntos de oligos de amplificação e o kit de amplificação altamente sensível MyTaq (BioLine EUA, Taunton, MA) (Tabela S2). A linha de células humanas VCaP, que expressa um mRNA de fusão TMPRSS2-ERG, foi confirmado como expressar a transcrição de fusão usando apenas 1 ng de RNA celular isolado (Tabela S2). O ARNm de fusão amplificado de células VCaP foi confirmada por sequenciação de ADN do produto de amplificação [38] (não mostrado). Em resumo, as células CR-PRCA cultivadas aqui não expressam RNA detectável fusão TMPRSS2-ERG.

enxerto ortotópico de células AEP

diminuição do número de células AEP foram enxertados diretamente na próstata anterior do destinatário SCID camundongos /bege e em ratos castrados cirurgicamente e quimicamente. Em algumas experiências, as células de AEP foram primeiro marcadas com EGFP por infecção das células cultivadas com um retrovírus que codificam MSCV EGFP [39].

In vivo

imagem de SCID xenoenxerto com células marcadas com EGFP gerado um sinal fluorescente claro duas semanas após o enxerto no local do enxerto de próstata anterior (Fig 6A). Estas células AEP desenvolveu em um localmente invasivo, cribriform padrão consistente com baixa Gleason Grau PRCA (Fig 6B e 6C) (glândula-in-glândula). Observou-se aumento da celularidade do estroma adjacente às glândulas complexos, em conjunto com necrose central nos lúmens e uma mistura desordenada dos basal e células epiteliais cubóides (Figura 6D-G). Curiosamente, glândulas tumorais simples expressa p63 na sua camada de células basais (Figura 6D), enquanto que na histologicamente glândulas mais complexos, a expressão de p63 por células basais foi reduzida e desordenada (Figura 6E).

(A)

em imagiologia in vivo de células

/CCC prca marcado com EGFP enxertadas nas próstatas anterior de ratinhos SCID receptor é mostrada a localização dos enxertos de duas semanas após o enxerto nas cápsulas próstata anterior. (B) coloração de hematoxilina-eosina de crescimento de tumores em órgãos urogenitais e da próstata. (C) Maior ampliação das glândulas cribriforme sugere desenvolvimento inicial do câncer de próstata invasivo. Foram observadas ambas as glândulas complexas mais simples e muito mais. (D) Proliferação marcador p63-coradas camada de células basais das glândulas complexas. (E) a expressão p63 aparece desordenada nas glândulas histologicamente grau superior. (F) glândulas mais simples expressar a CK5 marcador /14, ao passo que (G) glândulas que parecem estar progredindo para Cribriform câncer de próstata apenas esporadicamente expressar alta citoqueratina peso molecular.

A aparência histológica de um cancro locais induzido em um rato SCID ortotopicamente xenotransplantadas com 200 células de AEP é comparada com a da Fase I doador amostra de tecido do cancro (Fig. S3). Ambos os tumores eram compostas por pequenas glândulas em que as células com nucléolos proeminentes são frequentes. estruturas glandulares foram muitas vezes back-to-back ou formações glândula-dentro-da glândula. cancros induzidos por células PRCA em ratinhos receptores SCID intactas apresentou uma aparência histológica que era indistinguível do câncer de origem. Em ratos castrados, pouco diferenciado e os tumores podem ser amplamente divulgados resultou. Em contraste, até 10

5 células normais epiteliais da próstata humana (n = 3), que foram propagados de forma idêntica e transplantado ortotopicamente para as próstatas anterior de SCID e SCID castrados não produziu crescimento do tumor em mais de 30 semanas.

Discussão

Atualmente, Estágio I adenocarcinoma de próstata é considerado hormono-dependente e hormônio sensível; Normalmente, estes cancros são tratados por terapias de privação de androgênio (ADT). Muitos pacientes evoluem para o fenótipo letal de resistente à castração (CR) AEP, possivelmente implicando a “comutação” de células cancerosas de hormônio dependência à hormona-independência. Alternativamente, as populações menores de células podem ter qualidades que lhes permitem sobreviver ADT com o potencial de propagação da doença CR-primário ou metastático recorrente.

Neste estudo, temos propagado células epiteliais “resistentes Castração” diretamente do Stage -I tecido humano com cancro da próstata Gleason pontuação variando de 6 a 9 (Tabela S1). Usando as condições descritas, as colónias de células epiteliais independente de androgénios cresceu a partir de 30/43 pacientes (70%) de adenocarcinomas, 22 dos quais foram estudados por xenotransplanation ortotópico em murganhos SCID. número de colónias de células prca variaram tipicamente entre -40 a 500 por 10

7 células de entrada (50 mg a partir de tecido de cancro), uma frequência de 0,0004-,005%, embora alguns dos carcinomas produtoras de colónias geradas muito poucas colónias (Tabela S1).

as colónias de células AEP aderentes proliferaram na ausência de andrógenos e soro, mas exigia bFGF, EGF e extrato de pituitária. colónias epiteliais AEP emanava centros apertadas de 10-30 células, designadas grupos de células Câncer (CCC) (Fig 1), que perdeu CD133, mas expressa c-kit, p63, e E-caderina, marcadores de células basais na próstata [40 ]. Os marcadores expressos pelas células AEP /CCC – CD44, CD133, CK5 /14, c-kit, integrina α2β1, ALDH, SSEA4 e E-caderina – são características de células basais e de próstata células estaminais /progenitoras [14], [41 ] – [43]., sugerindo que o CCC se assemelha a um nicho de células-tronco de próstata epiteliais

a expressão por CR-PRCA células cultivadas de p63 e sua perda parcial sobre a geração de mais complexo

in vivo

glândulas seguintes xenotransplante (Fig 6E) sugere que as células CR-PRCA cultivadas podem diferir apenas moderadamente de suas contrapartes normais na próstata humana. No entanto, o

in vivo

tumorigenicidade significativa das células e sua expressão inequívoca da TERT sugere que essas células CR-PRCA cultivadas de câncer de próstata Fase-I representam uma manifestação precoce do processo cancerígeno. Na verdade, será de grande interesse para futuros experimentos para comparar a expressão de genes do cancro relevantes entre as células Cr-AEP descritos aqui e células NPREP humanos.

xeno ortotópico de células PRCA (Fig 6) e tumor resultante indução confirmado o fenótipo do cancro fundamental das células de AEP em cultura. No entanto,

in vivo

transplante de um pequeno número de células AEP isolado da cultura em ratinhos SCID em condições diferentes resultou em vários resultados. Primeiro, as células transplantadas PRCA em colágeno ou Matrigel na próstata anterior de camundongos SCID produzidos complexos, cribriforme back-to-back padrão-glândulas que invadiram o estroma circundante, característica do câncer de próstata de baixo Gleason Grau. Durante o período de observação de 12 semanas para os experimentos de xenoenxerto othotopic, não foi observada metástase. Xenotransplante de todas as 22 culturas de células CR-PRCA cultivadas resultou em glândulas simples ou mais complexas de câncer (Fig 6E /F). No entanto, a possível correlação entre a pontuação de Gleason do câncer de originais (Tabela S1) e da complexidade dos tumores xenotransplantadas em receptores SCID serão objecto de investigação futura. transplantação subcutânea de até 5 × 10

5 células de AEP em ratinhos SCID intactos ou castrados não resultam na geração de tumores (dados não mostrados), realçando a natureza dependente do microambiente das células de AEP cultivadas a partir de carcinomas de próstata precoce .

em segundo lugar, utilizando o transplante de mesênquima urogenital (UGM) recombinação modelo de xenoenxerto de [44], [45] sob a cápsula renal de ratinhos SCID (Figura S4) resultou em glândulas simples composta principalmente de células cubóides que apresentaram como células basais que expressam p63 e e-caderina. Algumas das glândulas desenvolvida uma segunda camada de células luminais que não tinham expressão de p63, mas manteve a E-caderina, semelhante ao desenvolvimento da próstata normais [46], [47]. Estes resultados sugerem que embrionário UGM no xenoenxerto de tecido de recombinação imposta sinais proliferativos normais nas células AEP Stage-I-derivados [48], [49].

A falta de expressão PSA pelas células cultivadas AEP descritos aqui e pelos seus cancros induzidos por xenotransplante ortotopicamente foi inesperado. Outra surpresa foi que estas células cultivadas AEP, eventualmente, envelheceram apesar expressão de TERT. células AEP invariavelmente diferenciado e envelheceram após ~ 8 transferências em cultura, sugerindo que, na ausência de um microambiente /nicho adequado essas células eram mortais. No entanto, estas mesmas células foram aparentemente imortal

In vivo

na presença do seu microambiente da próstata, tal como evidenciado pela xenotransplantion ortotópico de aproximadamente 200 células prca, resultando numa incidência do cancro de 20 g, equivalente a ~ 25 duplicações celulares. Portanto, a auto-renovação de células CICs CR-AEP parece ser condicionado, o que requer um microambiente adequado. De facto, a definição comum de CIC abraça um fenótipo imortal [50], como comumente CICs foram isolados a partir de cancros totalmente progrediu e /ou metastático, [51] – [53]. Além disso, em ratinhos castrados algumas células cultivadas CR-AEP que foram ortotopicamente xenotransplantadas na próstata anterior de ratinhos SCID cresceram continuamente até que os ratos tiveram de ser sacrificados uma vez que efectuada uma carga de tumor abdominal igual ao peso do rato (dados não apresentados ).

A presença de células cancerosas da próstata CR-possuindo um fenótipo de células-tronco no câncer de próstata precoce é consistente com os resultados recentes [54] esse documento um aumento sistemático em células estaminais /progenitoras AEP durante ADT dos pacientes AEP, explicando como atual ADT pode resultar em uma expansão indesejada de uma população de células-tronco AEP /progenitor com falha terapêutica. Nossos resultados sugerem que CICs celulares CR-PRCA que estão presentes em mais da metade da amostra de pacientes Stage-Examinei podem dizer respeito à falha terapêutica descritas por outros [54].

Outros investigadores haste isolado AEP putativa células utilizando um ensaio de efluxo de corante Hoechst 33342 modificado para isolar secundários-populações de células estaminais putativas enriquecidos a partir de tecido prostático maligno [55] – [58]. Uma segunda abordagem tem examinada a existência de uma célula estaminal independente de androgénios que pode dar origem a, células luminais totalmente diferenciadas dependentes de androgénio por meio de uma população de trânsito-amplificação positivo para a expressão de CK5 /14, CK18, CD44, ABCG2, CD133, e integrina α2β1 [14], [59], [60]. Uma terceira abordagem foi investigada a imortalização de células estaminais da próstata através da expressão forçada de telomerase humana (hTERT) [9], [20], [41], [61]. Por último, próstata humana células iniciadoras de tumores foram descritos que exibem propriedades estaminais-como com o aumento da atividade NF-kappaB [62]. A relação entre as células AEP aqui relatados, e as populações de células descrito por outros investigadores, vai exigir investigação mais experimental.

Em resumo, os dados apresentados demonstram a presença de células cancerosas, nos primeiros estágios de adenocarcinomas da próstata humana , que podem ser propagadas em meio definido com falta androgénios. As condições de cultura originais aqui apresentados e a facilidade relativa de propagação de populações de células de proliferação independente de androgénios pode ser esperado para estimular ainda mais investigação. Significativamente, estes métodos podem ser aplicados a pequenas amostras de biópsia, permitindo a caracterização de células de cancro da próstata CR-putativos e facilitar a gestão clínica baseada em evidência no início da doença.