Abstract
Fundo e Propósito
Ashwagandha é uma erva Ayurvedic popular usado na medicina tradicional casa indiana. Foi-lhe atribuído uma variedade de efeitos de promoção da saúde, dos quais os mecanismos permanecem desconhecidos. Nós relatado anteriormente a matança seletiva de células cancerosas, extrato de folha de Ashwagandha (i-Extract) e sua Withanone componente purificado. No presente estudo, investigamos o seu mecanismo de triagem de perda de função (revogação da i-Extract induzida morte celular cancro) dos alvos celulares e vias de genes.
Metodologia /Principais Achados
biblioteca de ribozima randomizado foi introduzido em células cancerosas antes do tratamento com i-Extract. Ribozimas foram recuperados a partir de células que sobreviveram ao tratamento i-Extract. genes alvos dos ribozimas seleccionados (como previsto pela pesquisa de banco de dados) foram analisados por bioinformática e análises via. Os alvos foram validados para o seu papel em i-Extracto induzida morte selectiva de células cancerígenas por ensaios bioquímicos e moleculares. Quinze genes-alvos foram identificados e foram investigados por seu papel na actividade de morte de células de câncer específico de i-Extract e seus dois componentes principais (Withaferin A e Withanone) por realizar a abordagem silenciamento de genes shRNA mediada. Bioinformatics no gene-alvo seleccionadas revelou o envolvimento de p53, apoptose e insulina /IGF vias relacionadas com a sinalização de ROS sinalização. Foi examinado o envolvimento de componentes ROS-sinalização (níveis de ROS, danos no DNA, a estrutura mitocondrial e potencial de membrana) e demonstrar que a morte selectiva das células cancerosas é mediada pela indução de estresse oxidativo.
Conclusão
extrato de folha Ashwagandha e Withanone causar a morte selectiva de células de câncer por indução de ROS-sinalização e, portanto, são reagentes potenciais que poderiam ser recrutados para quimioterapia do câncer ROS mediada
Citation:. Widodo N, Priyandoko D, Shah N, Wadhwa R, Kaul SC (2010) Killing seletiva de células cancerosas, Folha Ashwagandha Extrato e sua Withanone Component Envolve ROS sinalização. PLoS ONE 5 (10): e13536. doi: 10.1371 /journal.pone.0013536
editor: Vladimir N. Uversky, da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de julho de 2010; Aceito: 23 de setembro de 2010; Publicação: 21 de outubro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Widodo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações da Nova Energia e Tecnologia industrial Development Organization (Japão). N. S. é um destinatário de MEXT Scholarship, Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
sistema de home medicina tradicional indiana, Ayurveda é conhecida por sua história mais antiga do mundo. Ashwagandha (
somnifera
; Solanaceae) erva, orgulhosamente chamada Rainha do Ayurveda, é uma das plantas mais utilizadas em Ayurveda para uma variedade de efeitos que variam de analgésico, adstringente, adaptogen, anti-inflamatória, anti tais como estresse, anti-espasmódico, anti-diabetes, imuno-estimulante e cardioprotector [1] – [4]. Extractos de diferentes partes da planta, incluindo raiz, caule, sementes e bagas têm sido utilizados em várias receitas em casa remédio; raiz sendo particularmente para uma fonte comum de promoção da saúde alcalóides, withanolides e antioxidantes. Os principais componentes activos das folhas são Ashwagandha alcalóides esteróides e lactonas (vulgarmente conhecido como withanolides) [5] – [7]. O hotel tinha anteriormente investigou a atividade biológica em um extrato alcoólico do extrato de folha Ashwagandha (i-Extract) e demonstrou que ele tem uma forte atividade anti-câncer. Por fraccionamento química, a actividade foi atribuída ao seu Withanone componente (I-Factor) que foi demonstrado que provoca a activação da proteína p53 supressora de tumores em células de cancro apenas [8], [9]. fibroblastos humanos normais apresentaram sub-regulação da função de p53 e senescência retardada [10].
No presente estudo, nós esperado que o efeito selectivo de matar células de cancro ou i-Extracto Withanone é provável ser mediada pela mais de um genes /vias e, portanto, empreendeu uma abordagem imparcial perda de função em que o silenciamento de genes foi conseguida por ribozimas-martelo. população ribozima resgatados a partir de células de câncer de mama humanos ribozima randomizado biblioteca de infectados que sobreviveram ao tratamento i-Extract foi caracterizado. Bioinformática, ensaios bioquímicos e visuais foram utilizados para investigar os genes alvos identificados e revelar seu envolvimento na morte da célula cancerosa i-induzida por Extract. Nós demonstramos que a morte selectiva de células cancerosas pelo i-Extract e sua Withanone componente envolve a sinalização ROS.
Resultados e Discussão
ribozimas Hammerhead (HH-RZ) são os pequenos RNAs catalíticos que possuem hammerhead conservada como a estrutura secundária. Eles dobram na conformação activa por ligação a iões metálicos e hidrolisar ligações fosfodiéster de cadeias de ARN em sítios específicos (NUX, onde N pode ser qualquer nucleótido e X pode ser A, C ou U) e, portanto, são conhecidos como “tesoura de RNA” [ ,,,0],11], [12]. HH-Rz têm sido utilizados como ferramentas de silenciamento gene- devido às suas características, tais como, a ligação de elevada especificidade de substrato, a actividade autocatalítica que não necessita de outras enzimas, a estrutura flexível permitindo manipulações e falta de resposta de interferão em células de mamíferos [13], [ ,,,0],14]. De modo a gerar um gene de ribozima específica, os seus braços de reconhecimento (7-9 nucleótidos que flanqueiam o local alvo) foram concebidos para incluir sequência complementar com o ARNm alvo. A randomização destes 7-9 nucleótidos em cada braço produz uma grande variedade de ribozima capaz de se direccionar vários substratos de ARNm [11]. Tal conjunto de ribozimas degenerados expressa a partir de um promotor exógeno foi usado como uma ferramenta para a identificação de genes envolvidos na morte celular, migração, invasão, diferenciação e doenças [15] – [20]. A fim de identificar os alvos celulares envolvidas na citotoxicidade celular do cancro do extracto de folha de Ashwagandha (I-Extract), que infectou as células MCF7 com conduzido retrovírus biblioteca ribozima randomizado antes do tratamento. Como mostrado na Figura 1, quando as células (de controlo) vector infectados tratados com I-Extracto resultou na morte da célula, cultura infectada biblioteca ribozima mostraram sobrevivência celular. As ribozimas foram resgatadas de estes população de células sobreviventes e caracterizado por clonagem e análise da sequência. genes alvos para as sequências de ribozima isolados foram determinadas por pesquisa de banco de dados (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Os genes alvos potenciais das sequências de ribozima que foram isoladas várias vezes estão listados na Figura 1C. A fim de validar o envolvimento destes genes na i-Extract induzida morte da célula cancerosa, realizamos dois sentidos analisa (i) gene específico silenciamento shRNA mediada e (ii) uma investigação via bioinformática e biologia de sistemas dirigidos. Nós preparamos 7 gene (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 e ENTR 1) shRNAs específicos e investigou o seu envolvimento no i-Extract e seus componentes (Withanone e Withaferin A) induziu morte celular MCF7. Mesmo sob a eficiência de transfecção que vão desde 40-60%, tal como determinado por transfecção de um plasmídeo que expressa GFP, o silenciamento de quatro genes (Grupo 1 – TPX2, ING1, TFAP2A e LHX3) foi associada com significativa (20-40%) aumento da sobrevivência de células posterior ao tratamento de i-extracto (Figura 2). Os outros três genes (Grupo 2 – IGF2R, SREBF2 e AKAP11) mostrou apenas (2-8%) pequeno aumento na sobrevida. Além disso, as células comprometidas para a expressão de quatro genes Grupo 1 escapou o efeito citotóxico de tanto Withanone e Withaferin A. Estes dados sugeriram que estes quatro genes medeiam a citotoxicidade de i-Extrair. No entanto, eles não podem ser criticamente envolvido na toxicidade selectiva de I-Extrair e Withanone às células cancerosas, tal como descrito nos nossos estudos anteriores demonstrando o envolvimento da via supressora de tumores p53 neste fenómeno [8]. Estes dados indicam que a morte de células cancerígenas por i-Extract foi mediado, pelo menos em parte, por TPX2, ENTR 1, TFAP2A e LHX3. TPX2 é uma proteína associada a microtúbulos que funciona como um regulador alostérico da Aurora-A, um oncogene com papel essencial na maturação do centrossoma e segregação cromossoma durante a mitose requer montagem e manutenção de um fuso bipolar [21] – [23]. -Se sobre-expressos em vários cancros humanos e tem sido proposto como um alvo anti-cancro atraente [24]. TFAP2A desempenha um papel crucial no crescimento tumoral e na progressão através da regulação da E-caderina, MMP-2, c-kit, p21
WAF-1, HER-2, BCL-2, insulina como receptor-1 do factor de crescimento e de sinalização de Smad [25]. LHX3 é um factor de transcrição homeodom�io e desempenha um papel positivo no desenvolvimento embrionário, a determinação do destino da célula e oncogénese [26], [27]. Por outro lado, ING1, uma proteína da família ING, está envolvido na senescência celular humana, a supressão do tumor e a apoptose [28], [29]. ING1 foi mostrado para modular a actividade de p53 e seus efectores a jusante, p21
WAF1 e Bax por acetilação e estabilização [30]. Tomados em conjunto, os dados sugerem que a morte de células cancerígenas por i-Extract pode envolver repressão da TPX2, TFAP2A e LHX3, e ativação de funções ENTR 1; e o mecanismo de selectividade para células cancerosas ainda remian claro.
Apresentação esquemática da perda de função de blindagem usando a biblioteca de ribozima randomizado. As células de controlo tratadas com i-Extract mostrou citotoxicidade (
A
). i-Extract tratada células sobreviventes foram recolhidos (
B
). As ribozimas foram resgatadas das células sobreviventes através de clonagem e foram caracterizados por análise da sequência (
B
). alvos de genes candidatos são mostrados em (
C
).
As células foram transfectadas com vectores que expressam shRNA para os genes indicados. O efeito do i-extracto foi avaliada por ensaio de viabilidade celular. Os resultados representam a média de três experiências. A significância estatística foi calculada pela análise de variância (ANOVA).
A fim de identificar alvos celulares cruciais, estamos ao lado empreendeu bioinformática e sistemas de abordagem biologia e examinou a rede /caminhos dos genes alvos identificados descrita acima (Figura 3). As análises revelaram o envolvimento de genes alvos isoladas em vários tipos de processos biológicos, tais como, oncogénese, ciclo celular, metabolismo e reparação do ADN de ácido nucleico (Figura 3A). Os dois principais vias identificadas foram supressor de tumor p53 (genes alvos – DDB2, CDKN1A, CDKN2B) e apoptose (genes alvos – IGF2R e HSPA9). Digno de nota, as análises indicaram que 33% dos genes envolvidos na via da p53 e da sua regulação, e 7% dos genes envolvidos na apoptose foram identificados sugerindo que a morte celular por i-Extracto envolve a paragem do crescimento ou a apoptose, mediada pela activação de tumor via supressora de p53. Além disso, Ras, insulina /IGF, angiogénese e regulação do citoesqueleto caminhos que estão fortemente relacionados com a apoptose e desenvolvimento do tumor também foram identificados. Estes resultados demonstraram que o silenciamento de genes alvo ab-rogar o i-Extracto de morte celular mediada por protegendo as células de danos no ADN, interrupção do ciclo celular e apoptose. análise de interação da rede dos genes-alvo concebido quatro agrupamentos de genes – CDK4, TFAP2A, CDKN1A-p21 e ENTR 1 ligada por p53 e PCNA. Envolvimento destes grupos de genes durante o i-Extract induzida citotoxicidade sugere que poderia ser caracterizado como respostas celulares, incluindo a resposta ao estresse (HSPA9, CDKN1A) e danos no DNA e resposta de reparação (ENTR 1, DDB2 e TFAP2A), culminando em qualquer paragem do ciclo celular ou apoptose (Figura 3D). Com base nestes parâmetros identificados por análise de bioinformática, previmos que o i-Extracto pode causar uma activação do stress celular de sinalização por vias ROS mediadas iniciadas a dois níveis (i) o stress mitocondrial conduzindo a alterações no potencial de membrana e (ii) danos no DNA estresse levando a ativação de danos ao DNA e máquinas de reparação (Figura 3E). De nota, a maioria dos genes alvos identificados parecer encaixar-se as vias de sinalização previsto (Figura 3E). A fim de testar esta hipótese, foi investigado se CDKNIA-p21 é o regulador crítico do i-Extracto mediado de matar células de cancro. Como mostrado na Figura 4, i-Extracto mediada paragem do crescimento em células MCF7 (Figura 4A) foi associada com a activação de uma CDKN1A-p21 (Figura 4B). Também investigamos a examinar se CDKN1A-p21 era um mediador crítico da i-Extract induzida morte celular câncer seletiva. Como mostrado nas Figuras 4B e 4C, enquanto CDKN1A-p21 foi aumentada em células MCF7, manteve-se inalterado em (TIG-3) células normais em resposta a ou i-Extract ou tratamento Withanone. Em contraste, Withaferin A citotoxicidade tanto celular normal e cancro causado e foi visto para activar CDKN1A-p21 (Figura 4C). A seguir, investigou a activação de CDKN1A-p21 no controle e i-extracto tratado células MCF7 seguindo as transfecções de quatro shRNAs que revogados i-Extracto de morte celular MCF7 induzida, pelo menos em parte (Figura 2). Como mostrado nas Figuras 4D e 4E, verificou-se que o aumento induzido i-Extracto de expressão CDKN1A-p21 foi anulada pelo knockdown de cada um destes quatro genes alvo. Estes dados demonstraram que o CDKN1A-p21 é um mediador fundamental para a paragem do crescimento selectiva de i-Extracto induzida em células cancerosas. Nós finalmente testado esta hipótese, empregando p53 isogênico
+ /+, p53
– /-, p21
+ /+ e p21
– células cancerígenas do cólon HCT116 – /. Descobrimos que, enquanto p53
+ /+ e p53
– /- células mostrou sensibilidade comparável ao i-Extract (dados não mostrados), o p21
– /- células foram duas a três vezes mais tolerante a tratamento de i-Extracto em comparação com a proteína p21
+ /+ (células a Figura 4F) que subscrevem CDKN1A-p21 é de facto um mediador fundamental da paragem do crescimento induzida por i-Extracto em células cancerosas. Os dados era consistente com o nosso modelo proposto na Figura 3E.
Os processos biológicos que estavam envolvidos na i-Extract mediada morte celular foram previstos para incluir oncogênese, proliferação celular e ciclo celular (
A
) e p53 envolvido, apoptose, e insulina /IGF vias de sinalização (
B
). Mais predominante entre essas vias eram p53 e apoptose (
C
). Os genes alvo apareceu como quatro clusters (CDK4, p21, ENTR 1 e TFAP2A) que foram ligados por p53 e PCNA, envolvido no ciclo celular, a resposta danos ao DNA e genes de reparo do DNA (
D
). Com base nos genes alvos selecionados, a previsão era de que a célula cancerosa mediada i-Extract matando ROS- mediada danos envolvidos no DNA eo nível mitocondrial com CDKN1A como um mediador crítico (
E
).
i-Extract induzida paragem do crescimento de células MCF-7 foi devido a sua detenção na fase do ciclo celular G2 (
a
). Um aumento na expressão CDKN1A-p21 foi visto em células MCF7, quando tratada com i-Extrair e Withanone. Nenhum aumento na expressão CDKN1A-p21 foi visto em células normais, na presença de ou i-Extract ou Withanone (
B
e
C
). Knockdown de cada um dos quatro genes indicados que comprometiam i-Extract induzida citotoxicidade também reverteu o i-Extract induzida upregulation CDKN1A-p21 (
D Comprar e
E
). HCT116 p21
– /- células eram menos sensíveis à i-Extract, em comparação ao seu p21 isogênico
+ /+ células. A viabilidade das células em resposta às concentrações crescentes em série de i-Extract (
F
).
Como previsto pela análise de caminho (Figura 3E), o próximo investigado o envolvimento de danos no DNA e de reparação de via de sinalização no i-Extract induzida morte da célula cancerosa. Como se mostra, as células MCF-7 mostraram indução de γH2AX (um marcador precoce de resposta a danos no ADN), em resposta ao tratamento com i-Extract, Withaferin A e Withanone (Figuras 5A e 5B). Examinámos também a fosforilação de γH2AX por imunocoloração com um anticorpo específico de fosforilação e descobriram que o número de células contendo γH2AX fosforilado foi 70% superior em i-extrair células tratadas, em comparação com o controlo (Figura 5B). Considerando que a Withaferin Um tratamento induzida γH2AX tanto em células normais e cancerosas, i-Extract e Withanone induzida γH2AX apenas em células cancerosas (Figuras 5A e 5C). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a morte de células cancerígenas seletiva por i-Extract e Withanone foi mediada pela indução de danos no DNA e CDKN1A-p21, como previsto na Figura 3E.
danos no DNA focos (
A
), indução e fosforilação γH2AX (
B
) -assessed por coloração com anticorpo específico para fosfo (100-200 células por lâmina foram contados) foram detectados em células MCF-7 tratadas com i-Extract, Withaferin a e Withanone. As células normais mostrou DNA danos resposta após o tratamento com apenas Withaferin A (
A
e
C
).
A seguir, investigou o envolvimento de resposta ao estresse iniciada no mitocôndrias no i-Extract induzida morte celular MCF7. Como mostrado nas Figuras 6A e 6B, a indução de ROS na presença de i-extracto foi detectada, tanto por métodos de fluorescência da sonda (HPF) e imunocoloração. Consistente com a citotoxicidade dos dois componentes (A e Withaferin Withanone) de I-Extract, indução de ROS foi detectado por ambos os componentes em células MCF7 e apenas por Withaferin A em células TIG-3. Estes dados demonstraram que o tratamento com i-Extrair e Withanone chumbo para indução de ROS, selectivamente em células cancerosas, por conseguinte, pode ser responsável pela morte de células de cancro selectiva. A seguir, analisou o potencial de membrana mitocondrial, que é altamente afetada por níveis de ROS. Como se mostra nas Figuras 6C e 6D, houve uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial em células MCF7, como visto por ambos JC-1 coloração e ensaio de exclusão de Rho-123. Após tratamento com i-Extract, MCF7 células turno mostrou no JC-1 coloração de vermelho para verde (Figura 6C) e negativo para Rho-123 coloração. De nota, (TIG-3) células normais eram refratários a essas alterações quando tratados com i-Extract ou Withanone (Figura 6C). Estes dados nos fez acreditar que o i-Extract induzida morte selectiva de células cancerosas envolvidos estresse ROS e danos mitocondrial. A fim de obter evidências mais claras, examinamos a ultra-estrutura de controle e i-Extract trataram células MCF-7, a nível de uma única célula. Como mostrado na Figura 6E, controlar células MCF7 apresentaram morfologia mitocondrial típica, caracterizada por uma membrana dupla contendo uma matriz homogénea e um sistema de cristas paralelas. Withanone células tratadas mostraram mitocôndrias inchados com uma morfologia alterada de que o encurtamento e redução do número de cristas foram aparente (Figura 6E).
células
MCF7 demonstraram a indução de ROS quando tratados com I-Extract, A ou Withaferin Withanone (
A
e
B
). As células normais mostrou indução de ROS apenas na presença de Withaferin A (
Um
). Perda de potencial de membrana mitocondrial em células cancerosas MCF7, como visto por JC-1 coloração foi detectado com i-extrair apenas (
C
). indução preferencial de perda de potencial transmembranar mitocondrial em células MCF7 detectados por citometria de fluxo utilizando RHO-123 aumentou de 0,2% da população de controlo para 44% da população tratada com i-extracto (
D
). dano mitocondrial foi detectada em células MCF-7 tratadas com Withanone. (
E
), eletrônica de transmissão de imagens microscópicas de células MCF-7 tratadas com Withanone controle e. As células de controlo mostrou mitocondrial alongada normal (M) com cristas paralela (a) (imagem em caixa ampliada,
b
), Withanone-tratados células mostrando mitocôndrias inchados com número reduzido das cristas (c) (imagem em caixa ampliada,
d
). N, Núcleo.
ROS são quimicamente reactivos que têm moléculas de papel essencial na transdução de sinal, o crescimento e a diferenciação celulares, a regulação da actividade de enzima e resposta imunitária, incluindo a inflamação e a produção de citocinas. Considerando que um aumento moderado no ROS promove a proliferação e diferenciação celular, a sua quantidade excessiva provoca danos irreversíveis para oxidativa de ADN, proteínas e lípidos que conduzem à morte celular. As células cancerosas frequentemente apresentam elevado estresse oxidativo e aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), em comparação com os homólogos normais. Este nível mais elevado de ROS serve como um alvo terapêutico selectiva fazendo as células cancerosas vulneráveis aos reagentes ROS-produtoras, propostas como reagentes quimioterapêuticos [31]. Um pequeno número de estudos têm apresentado provas ao assassinato seletivo ROS- mediada das células cancerosas. Estes incluem, apoptose seletiva em células cancerosas, extrato de abacate [32], isotiocianato de beta-feniletilo (PEITC) [33], os análogos da talidomida [34] e MKT077 [35] – [36]. Curiosamente, a maioria destes reagentes foram mostrados para causar disfunção mitocondrial [31] – [39]. Demonstramos, pela primeira vez, que o extracto Ashwagandha folha (i-Extrair) e o seu componente, Withanone actuam como agentes ROS-produtoras causando ADN e o dano mitocondrial discriminadamente de células cancerosas, e, portanto, são bons candidatos para a terapia do cancro segura.
Materiais e Métodos
células e randomizados biblioteca martelo ribozima triagem
fibroblastos humanos normais (TIG-3), carcinoma da mama (MCF7), carcinoma do cólon (p53 HCT116-
+ /+, p53
– /-, p21
+ /+ e p21
– /-) e embalagem do mouse células, plat-e foram obtidos da coleção japonesa dos recursos biológicos de investigação (JCRB) celular Banco e cultivadas em meio essencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) como descrito anteriormente [8] – [10]. As células foram tratadas com i-Extract, Withanone e Withaferin A para 48-72 h para a viabilidade, bioquímica e análises visuais. Randomized biblioteca ribozima (pMX-puro /Rz) foi preparado e infectado em células MCF-7 tal como descrito anteriormente [15]. As células infectadas foram seleccionadas em puromicina (2 pg /mL) de meio -supplemented durante 24-48 h e em seguida, foram tratados com I-Extrair. O ARN foi preparado, utilizando Isogen (Invitrogen), a partir de células sobreviventes após 4-5 dias, quando todas as células no prato de controlo tinham morrido. O ARN total (2 ug) foi utilizado para RT-PCR. A transcrição reversa foi realizada com o iniciador inferior (5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GTA C-3 ‘) e transcriptase MMLV (42 ° C, 90 min) e o produto de RT foi sujeito a amplificação por PCR utilizando os iniciadores superior (5’ -tcc CCG GTT CGA AAC CGG GCA-3 ‘) e os iniciadores mais baixas (94 ° -52 ° -72 ° /30 seg cada, 20 ciclos). O produto amplificado por PCR (-150 pb) foi clonado num vector de clonagem TA (Promega) e sequenciados utilizando iniciador de T7.
gene específico shRNA-vector de clonagem
vectores de expressão de genes durante 7 shRNA (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 e ING1) foram preparados como anteriormente descrito [15]. Dois locais alvo foram seleccionadas para cada um dos genes. As sequências alvo selecionados para ENTR 1 foram ATATGAAGTTTAAATTCTA e GCCAAGACCTCCAAGAAGA, por TPX2 foram GCAAGAAGGATGATATTAA e GGGGAAGAATGGAACTGGA, por TFAP2A foram GGAGGAAGATCTTTAAGAG e GATCAAACTGTAATTAAGA, por AKAP11 foram GAGTGAAGCTTTATCAAAT e GCACAAACATGGAAAGTCA, por SREBF2 foram GCCTCAACCTCAAACTCAG e ATGCAAAGGTCAAAGATGA, por LHX3 foram GCGACGAGTTCTACCTCAT e GGGAGAGCGTTTACTGCAA, e por IGF2R foram GGCAGAAACCCAAACTGAA e GGAGGAAATACTACATTAA.
a viabilidade celular ensaio
cancro da mama humano (MCF-7), as células foram transfectadas com 50 ng do ADN de plasmídeo indicado. Após 24 h, as células foram tratadas com i-extracto (6 ug /ml), Withaferin A (1