Abstract
Purpose
Para elucidar o papel do impacto biológico e clínico de hipermetilação do promotor aberrante (PH) no câncer de ovário (OC).
Experimental Design
PH da
PGP9.5
,
HIC1
,
aim1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1,
FKBP4 e
VGF
foram avaliadas por PCR específica de metilação quantitativa (QMSP) em um conjunto de treinamento. Foram selecionados dois genes (
VGF
e
PGP9.5
) para uma análise mais aprofundada QMSP em uma validação independente maior (IV) definido com dados clínicos disponíveis. relevância biológica da
VGF
gene também foi avaliada.
Resultados
frequência PH para
PGP9.5
e
VGF
foram 85 % (316/372) e 43% (158/366), respectivamente, no conjunto IV de amostras enquanto nenhum PH foi observada em controles. Em 372 casos de criminalidade organizada com disponíveis acompanhamento,
PGP9.5
e
VGF
PH foram correlacionados com melhor sobrevida do paciente [taxas de risco (HR) para a sobrevida global (OS) foram 0,59 (95% Intervalos de confiança (IC) = ,42-,84, p = 0,004) e 0,73 (IC 95% = 0,55-0,97, p = 0,028), respectivamente, e para a doença sobrevida específica (DSS) foram 0,57 (95% CI 0,39-0,82, p = 0,003) e 0,72 (IC de 95% 0,54-0,96, p = 0,027). Na análise multivariada,
VGF
PH manteve-se um fator prognóstico independente para OS (HR 0,61; IC 95% 0,43-0,86, p 0,005) e DSS (HR 0,58, 95% CI ,41-,83, p 0,003 ). Além disso,
PGP9.5
PH foi significativamente correlacionada com menor grau, os tumores em fase inicial e, com ausência de doença residual. A expressão forçada de
VGF
em linhas celulares OC crescimento celular inibido.
Conclusões
Os nossos resultados indicam que o
VGF
e
PGP9.5
PH são potenciais biomarcadores para carcinoma de ovário. coortes de confirmação com acompanhamento longitudinal são necessários estudos futuros para definir o impacto clínico da
VGF
e
PGP9.5
PH antes da aplicação clínica
Citation:. Brait M , Maldonado G, H Noordhuis, Begum S, Loyo H, Poeta ML, et al. (2013) Associação de metilação do promotor de
VGF
e
PGP9.5
com cancro do ovário progressão. PLoS ONE 8 (9): e70878. doi: 10.1371 /journal.pone.0070878
editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 18 Janeiro, 2013; Aceito: 24 de junho de 2013; Publicação: 27 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Brait et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio de desenvolvimento de carreira com o Dr. Hoque do Programa especializada de Investigação de Excelência P50 concessão CA098252 (PI: TC Wu). Dr. Hoque e Dr. Begum são suportados por um Prêmio Jovem Cientista Clínica pela hospedeiros de bordo Medical Research Institute. Dr. Marchionni é apoiado pelo National Institutes of Health subvenção P30CA006973-National Cancer Institute. M. G. Noordhuis é um destinatário de doações de studiefonds Cancer Society holandês e Jo Kolk. As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise, interpretação dos resultados, a preparação do manuscrito, ou a decisão de enviar o manuscrito para publicação
Conflito de interesses:. Temos a seguindo interesses. Sob um acordo de licenciamento entre as Ciências Oncomethylome, SA (agora MDxHealth) e da Universidade Johns Hopkins, D.S. tem direito a uma quota de royalties recebidos pela Universidade sobre as vendas de produtos de diagnóstico descritos neste artigo. D.S. possui Oncomethylome Sciences, SA de ações, (agora MDxHealth), que está sujeita a certas restrições ao abrigo da política University. D.S. é um consultor pago às Ciências Oncomethylome, SA (agora MDxHealth) e é um membro pago do Conselho Consultivo Científico da empresa. A. van der Zee era um consultor pago para MDxHealth (Anteriormente Oncomethylome Sciences SA). Autor MOH é um membro do PLOS ONE Editorial Board. Há um pedido de patente, que inclui alguns dos dados a ser publicado aqui neste artigo: WO201 /099489, EP2401408A2 – cancro do ovário Methylome. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O câncer de ovário (OC) é o segundo câncer ginecológico mais comum ea principal causa de morte entre cânceres ginecológicos em todo o mundo [1]. 22.240 novos casos foram estimados para 2013 nos Estados Unidos, levando a 14.030 mortes por este tipo de câncer [2]. A idade média dos pacientes com OC é de 60 anos, e o risco médio de vida para o desenvolvimento de OC em mulheres é cerca de 1 em 70 [3]. Setenta por cento dos pacientes com OC tem doença avançada (estágios III ou IV) no momento do diagnóstico, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 15 a 20%, apesar do tratamento agressivo [4], em comparação com os pacientes em fase inicial com uma sobrevida taxa superior a 90% [3]. OC tem sido geralmente tratados com quimioterapia com platina e frequentemente recorrente, devido à resistência adquirida platina. A resposta clínica inicial aos medicamentos à base de platina é um dos principais determinantes do prognóstico para pacientes com OC. Os pacientes com tumores in vitro que demonstram resistência às drogas extrema à platina foi encontrado para ser um risco significativamente maior de morte e progressão quando tratados com regimes padrão à base de platina [5]. Por isso, é de grande importância para identificar marcadores preditivos úteis indicando sensibilidade de platina. Estes podem permitir uma melhor seleção do tratamento para a linha 1
st do tratamento, possivelmente permitindo um melhor resultado para os pacientes resistentes platina. Determinação de marcadores apropriados para prever a resposta quimioterapêutico padrão ou mais novos agentes biológicos permitirá melhorar as taxas de cura e de controlo para OC, bem como a selecção da terapia adjuvante ou identificação de pacientes adequados para ensaios clínicos específicos. Além disso, a capacidade de prever resultados OC após ressecção cirúrgica é crítica para os médicos, uma vez que teria impacto da utilização da quimioterapia e radiação terapias adjuvantes. Um indicador prognóstico independente da sobrevivência OC seria, portanto, de valor inestimável para médicos e pacientes na escolha de opções de tratamento.
É sabido que genéticas (alterações na sequência de ADN tais como deleções, amplificações e mutações) e alterações epigenéticas (definidos como alterações hereditárias na expressão de genes que ocorrem sem alterações da sequência de ADN) contribuir para o desenvolvimento e progressão de células de tumor [6]. Os eventos epigenéticos mais comuns incluem a metilação do DNA e acetilação das histonas [7], sendo de metilação do DNA, possivelmente, o aspecto mais amplamente estudado da epigenética no que diz respeito à carcinogênese, e o foco principal das intervenções farmacológicas em ensaios clínicos. Ele refere-se à adição de um grupo metilo na posição carbono-5 do anel citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), mas apenas em citosinas que precedem uma guanosina na sequência de ADN, conhecida como dinucleótido CpG [8]. Existem regiões ricas em CpG conhecidas como ilhas de CpG que normalmente se estendem a região de extremidade 5 ‘(promotor, a região não traduzida e o exão 1) de vários genes com actividade supressora de tumor e são normalmente não metiladas nas células normais [9]. O genoma humano neste células normais não é metilado de modo uniforme, que contém segmentos não metilados, intercaladas com regiões metiladas [10], enquanto que os padrões de células de cancro de metilação são alterados, submetidos a hipometilação global de ADN [11], bem como hipermetilação de certas ilhas CpG [8] . Hipermetilação aberrante de CpG Island (em particular no promotor de genes supressores de tumor ‘), bem como a histona modificação vantagem da transcrição inactivação e silenciamento do gene, sendo um fenómeno comum em células de cancro humanas e provavelmente um dos primeiros eventos na carcinogénese [7]. Em particular, a hipermetilação do promotor (PH) é um mecanismo frequente de inativação de genes supressores de tumor (ETG) [7], [8] e PH de certos genes relacionados com o cancro foram encontrados para ser associados com a resposta terapêutica e resultado da doença [12 ], [13].
no presente estudo, foram analisados PH de 13 genes
(PGP9.5
,
HIC1
,
aim1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1
,
VGF, FKBP4)
por quantitativa fluorogênico em tempo real metilação específicas de PCR (QMSP) em um conjunto de treinamento e, finalmente, testados dois genes (
VGF Comprar e
PGP9.5
) em um conjunto de validação independente para avaliar se existe alguma associação de PH destes dois genes com quaisquer fatores clínicos, incluindo resultado global do paciente. Além disso, estudamos o papel funcional de VGF como uma molécula anti-tumorigénico em OC linhas celulares derivadas.
Materiais e Métodos
estudo de coorte
Set Formação.
para compor o primeiro conjunto de amostras foram obtidas amostras de tecido do tumor de ovário do nosso arquivo de tecido, coletados de 33 pacientes com OC epitelial que se submeteram a cirurgia terapêutica na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins. Nós também obtidas amostras de 24 pacientes com OC submetidos à cirurgia na Universidade Campus Bio-Medico, Roma. Para ser incluído no grupo, um paciente qualificado tinha que ter um diagnóstico confirmado de OC e uma quantidade suficiente de material tumor arquivados para extração de DNA. As amostras foram conservadas em parafina, e um conjunto de lâminas (10 microns de espessura) foram retiradas de cada bloco. A informação demográfica e clínica foi obtida a partir do registo informatizado tumor no The Johns Hopkins Healthcare System ou do registro no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Universidade Campus Bio-Medico de Roma, Itália. Os tumores foram classificados de acordo com o sistema de estadiamento FIGO [14]. Dos pacientes Johns Hopkins (33), 16 pacientes apresentavam doença estágio inicial (15 a fase I e fase II 1) e 17 com doença avançada (14 estágio III e 3 estágio IV). Todas as amostras eram carcinomas ovarianos epiteliais com uma histologia seroso papilar. Dos 24 pacientes da Itália, 10 tinham doença em estágio inicial (6 com estágio I, e 4 com a fase II), 13 tinham doença avançada (12 com estágio III, e 1 com estágio IV) e 1 teve estágio desconhecido. Dezoito pacientes apresentaram carcinomas epiteliais ovarianos (serosa, endometrióides, mucinoso, escamosas, indiferenciadas), um com tumor de células germinativas, quatro apresentaram tumores (metástase) secundárias, e 1 paciente teve histologia desconhecida. O tecido epitelial de ovário normal foi obtido a partir de 13 pacientes que se submeteram a cirurgia profilática para qualquer condição benigna no Hospital San Jose Tec de Monterrey, no México. Um resumo detalhado do conjunto de treinamento de pacientes está disponível na Tabela 1 (A).
Validação Independente (IV) Set.
Foram analisados um conjunto de validação independente para o mais promissor genes. Este conjunto independente consistiu de 372 tumores ovarianos, 17 tumores borderline e 18 cystadenomas ovarianos (todos preservados como amostras congeladas frescas). Estes pacientes foram submetidos a cirurgia no Centro Médico da Universidade de Groningen, Groningen (UMCG), Países Baixos. A informação demográfica e clínica foi obtida a partir do registro no Departamento de Oncologia Ginecológica, UMCG, Países Baixos. Um resumo detalhado dos parâmetros demográficos e clínico-patológicos destas amostras é apresentada na Tabela 1 (B).
A aprovação para pesquisa em seres humanos foi obtida a partir da Universidade Johns Hopkins conselhos de revisão institucional. Este estudo beneficiar de uma isenção no âmbito do Departamento de Saúde e Serviços Humanos política EUA para protecção dos seres humanos [45 CFR 46,101 (b)]. diretrizes IRB foram seguidos em cada uma das instituições envolvidas. Todos os materiais humanos utilizados no estudo do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Universidade Campus Bio-Medico de Roma, Itália, foram recolhidos de acordo com as orientações do Comitê Local de Ética do Campus Bio-Medico de Roma. As orientações do Comitê de Ética Local, que estão em padrão compatível com a Autoridade de Protecção de Dados italiano, determina que as amostras coletadas retrospectivamente a partir do Departamento de Patologia (fixado em formol e-embebidos em parafina de tecido) não precisa ter qualquer aprovação e são dispensados de obter consentimento informado por escrito. De acordo com as regras de proteção italiana Autoridade de Dados (https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home_en~~number=plural doc web n 1.884.019), instituições italianas estão no padrão autorizado a usar as amostras e os dados clínicos correspondentes incluídos no estudo. Todas as amostras colhidas do Hospital San Jose Tec de Monterrey, Monterrey, México foram coletados seguindo as regras do Comitê de Ética. De acordo com as diretrizes da lei mexicana para Pesquisa em Saúde (Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud, artigo 23
rd, 2
nd título, 1
capítulo st: estudos retrospectivos são considerados como estudos de não-risco e, portanto, não requerem um consentimento informado por escrito dos participantes ou aprovação da Comissão de Ética. as amostras provenientes do México eram de amostras arquivadas (, tecido embebido em parafina fixado em formalina) e foram recuperadas do arquivo de patologia dos hospitais . para os pacientes obtidos a partir da UMCG na Holanda, os pacientes deram consentimento informado para a coleta e armazenamento de amostras de tecido em um banco de tecidos para pesquisas futuras. Todos os dados do paciente relevantes foram recuperados e transferidos para um anônimo, protegido por senha, banco de dados. o . identidade dos pacientes era protegido por códigos, único do doente específico do estudo e sua verdadeira identidade só foi conhecido por dois gerentes de dados dedicados Segundo os regulamentos holandeses, estas precauções significou era necessária mais nenhuma aprovação de revisão institucional (http: //www.federa .org /). Todos os dados dos pacientes foram de-identificados para os pesquisadores em todas as 4 instituições.
Gene Seleção
No presente estudo, foram selecionados um total de 13 genes para analisar o seu estado de metilação (usando QMSP ) por uma abordagem do gene candidato. Os genes foram seleccionados com base na sua metilação específico do cancro em OC e /ou quaisquer outros tipos de cancro sólido. Os genes selecionados foram:
PGP9.5
,
HIC1
,
aim1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1, VGF
e
FKBP4
. Um resumo detalhado de informações sobre estes genes está disponível na Tabela S1 S1 Arquivo.
Com base nas alterações dos genes acima mencionados em câncer (mais discutidos na seção de discussão), analisamos todos estes 13 genes em um conjunto de treinamento de amostras e selecionados dois genes (
VGF
e
PGP9.5
) para posterior análise de um grande conjunto independente bem anotada de amostras. Os critérios de selecção dos genes a ser testado no conjunto de validação independente foram: a) a frequência de metilação em amostras de tumor no conjunto de treinamento; b) a frequência de metilação em amostras normais; C) novidade do gene para OC; D) Conhecido funções de cada gene por pesquisa bibliográfica /PubMed.
DNA extração
Depois de paciente de-identificação inicial, todas as lâminas histológicas OC originais foram revisados para confirmar o diagnóstico por um patologista sênior. Um bloco representante foi recuperada para extração de DNA. lâminas histológicas do tecido fixado em formol e embebido em parafina foram tomadas. As lâminas foram microdissecadas obter 70% de células neoplásicas. O epitélio normal do ovário microdissecados foi isolado a partir de tecido de ovário ressecada durante a cirurgia, confirmando depois a ausência de qualquer maligno e /ou processo de pré-malignas no tecido. O DNA foi extraído usando o protocolo de extracção com fenol-choloroform seguido por precipitação com etanol, como descrito anteriormente [15]. Para as amostras UMCG, o ADN foi isolado utilizando a extracção de sal-clorofórmio e precipitação com isopropanol padrão. O ADN precipitado foi ressuspenso em tampão Tris-EDTA (Tris 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0). O ADN genómico foi amplificado num PCR multiplex de acordo com o protocolo BIOMED-2, para verificar a qualidade do ADN [16].
Tratamento Bissulfito de sódio
DNA extraído a partir de tumores primários e epitélio do ovário normal foi de submetido a tratamento com bissulfito de sódio, o qual converte os resíduos de citosina não metilados em uracilo resíduos, conforme descrito anteriormente [17]. Para isso, o kit EpiTect bissulfito (Cat No. 59104, QIAGEN Inc., Valencia, CA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Para as amostras UMCG, tratamento com bissulfito foi realizada com o kit EZ metilação do DNA de acordo com o protocolo do fabricante (Zimogénio, BaseClear, Leiden, Países Baixos). Após o tratamento, o ADN foi armazenado a -80 ° C até serem usadas.
análise de metilação
Bissulfito-tratada DNA foi utilizado como um molde para a real-time PCR-based fluorescência, tal como descrito anteriormente [ ,,,0],17]. reacções de amplificação foram realizadas em triplicado num volume final de 20 mL que continham 3 ul de ADN-bissulfito modificado; 600 concentrações nM de iniciadores directos e inversos; 200 sonda nM; 0,6 U de polimerase Taq Platinum (Invitrogen, Frederick, MD); 200 uM concentrações de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP; e MgCl 6,7 mM
2. Iniciadores e sondas foram concebidos para amplificar especificamente os promotores dos 13 genes de interesse e o promotor de um gene de referência,
ACTB
; sequências iniciadoras e sonda e temperaturas de recozimento são fornecidos na Tabela S2 em S1 Ficheiro. As amplificações foram realizadas utilizando o seguinte perfil: 95 ° C durante 3 minutos, seguido por 50 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. reacções de amplificação foram realizadas em placas de 384 poços em um detector de sequências 7900HT (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Beverly, MA) e foram analisadas por um sistema de detecção de sequência (SDS a 2,4; Applied Biosystems). Cada placa incluiu amostras de DNA de pacientes, positivo (
in vitro
DNA metilado leucócitos) e negativo (DNA de leucócitos normal ou DNA a partir de uma linha celular não metilado conhecido) controles, e vários espaços em branco de água. ADN de leucócitos de um indivíduo saudável foi metilado
In vitro
com excesso metiltransferase SSSI (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) para gerar ADN completamente metilado, e diluições em série (90-0,009 ng) de ADN foram este utilizado para construir uma curva de calibração para cada placa. Todas as amostras estavam dentro do intervalo do ensaio de sensibilidade e reprodutibilidade com base na amplificação do padrão de referência interno (valor de ciclo limiar [CT] para
de ACTB 40). O nível relativo de ADN metilado para cada gene em cada amostra foi determinado como uma proporção de gene amplificado por PCR específica para a metilação
ACTB
(gene de referência) e depois multiplicado por 1000 para apuramento mais fácil (valor médio de triplicados de gene de interesse dividido pelo [valor médio de triplicados de
ACTB
] × 1000). As amostras foram classificadas como não metilado ou metilado com base na sensibilidade do ensaio
.
Para
VGF
, análise da sequência de bissulfito também foi realizada para confirmar o estado de metilação nas linhas celulares derivadas de cancro do ovário (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP de 2008 e 2008 C13) e de linhas de células normais do epitélio de superfície do ovário (OSE) (OSE2A, OSE2B e OSE7). ADN tratado com bisulfito foi amplificado para a região 5 ‘que incluem, pelo menos, uma parte da ilha de CpG dentro de 1 kb do local de início da transcrição proposto (TSS), contemplando a mesma área que os iniciadores e sonda QMSP. Os iniciadores foram concebidos não para conter locais de CpG, e considerando o bissulfito sequência de tratados, de modo a amplificar a região independentemente do seu estado de metilação, o que nos permite observá-lo sem um viés reação. A sequência de iniciadores foram: directo 5’-TTTGTTTTTGTTAGGGGGTTGTT-3 ‘e reverso 5′- AACACCAATAAAAACTAATACTA-3’. Os produtos de PCR foram purificados em gel utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra de ADN amplificado foi sequenciado pelo analisador de ADN Applied Biosystems 3700 utilizando iniciadores para a frente ou para trás e BD Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Três reações independentes foram realizados para confirmar os dados observados.
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada com IBM SPSS Statistics 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Para cada gene de um limiar de metilação (cut-off) acima do valor mais elevado no grupo controle foi utilizado para atingir 100% de especificidade no conjunto de treinamento e os mesmos valores de corte foram aplicados para
VGF Comprar e
PGP9.5
no conjunto de validação independente, a análise também foram realizadas utilizando um corte na 75
percentil de valores de metilação. As diferenças na proporção de metilação entre normais e cânceres foram avaliados pelo teste exato de Fisher. Além disso, os valores para cada hipermetilação de genes também foram comparadas entre o cancro e normal pelo teste de Mann-Whitney. Correlações dos níveis de metilação dos genes foram avaliados com coeficientes de correlação de Spearman. A associação entre a hipermetilação e as características clínico-patológico foi avaliada por meio de regressão logística, qui-quadrado e teste exato de Fisher, conforme apropriado. A sobrevida global (OS) foi definido como o tempo desde o diagnóstico até a morte de qualquer causa ou a última visita de acompanhamento vivo. sobrevida específica de doença (DSS) foi definido como o período desde o diagnóstico até a morte como consequência de OC. Diferenças no OS e DSS acordo com as características clínicas e metilação dos genes foram analisados usando análise de regressão de Cox. Todas as variáveis significativas com um
valor P Art 0,05 na análise univariada foram incluídas na análise multivariada.
valor P
s de foram consideradas estatisticamente significativas 0,05. Todo o
Os valores de P Quais são frente e verso.
5-aza-2′-desoxicitidina tratamento de células e transcrição reversa-PCR e em tempo real transcrição reversa-PCR
Nós semeado (densidade: 1 × 10
6) seis linhas ovarianos de células de câncer (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP de 2008 e 2008 C13) linhas em seu respectivo meio de cultura e manteve-los por 24 h antes de tratá-los com 5? M de 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC; Sigma) durante 5 a 7 dias. Nós renovada meio contendo 5-aza-dC a cada 24 horas durante o tratamento. Nós tratadas a células de controlo (simulado tratado), da mesma forma, sem a adição de 5-aza-dC. Nós também tratados com 5-aza-dC em combinação com a tricostatina A (TSA, Sigma, St. Louis, MO), um inibidor da histona deacecetylase, e TSA por si só. As soluções de reserva de 5-aza-dC foram dissolvidos em solução salina de fosfato tampão PBS (pH 7,5). Nós preparamos RNA total usando Qiazol (Qiagen Inc. Valencia, CA), seguindo as instruções do fabricante.
A transcrição reversa-PCR (RT-PCR)
cDNA foi sintetizado usando Superscript III (Invitrogen, Vida Technologies, Carlsbad, CA), com um montante inicial de 1 ug de RNA, seguindo o seu protocolo padrão. RT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [18]. Um microlitro de cada ADNc foi utilizado para o tempo real de RT-PCR utilizando iniciadores específicos e sonda TaqMan para o gene de interesse. As amplificações foram realizadas em placas de 384 poços em um sistema 7900HT Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de genes em relação a desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi calculada com base no ciclo limiar (Ct) de 2
-Δ (ΔCt), onde ôc
T = C
t, gene- C
t, GAPDH e Δ (ôc
t) = ôc
t, aZA-ôc
T, M (H, tratamento simulado; aza, 5-aza-dC tratamento) [19] .
Colony ensaio foco
Nós comparamos o perfil de metilação e expressão de
VGF
em 3 linhas normais de células do epitélio de superfície do ovário (OSE) (OSE2A, OSE2B e OSE7) e 3 pares de linhas isogênicas celulares OC (A2780 e A2780CP de 2008 e 2008C13 e IGROV e IGROV CP) diferentes no que diz respeito à sensibilidade cisplatina. Nós, então, realizada ensaio de formação de focos de VGF usando duas linhas de células (2008 e 2008C13) que foram metilado e não expressando
VGF.
linhas celulares OC 2008 e 2008C13 foram semeadas em placas de 10 cm e transfectada com o vector de expressão de VGF (pCMV6-AC-FCV-GFP) e o vector vazio (pCMV6-AC-GFP) (Origene, Rockville, MD). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram divididas em vários pratos. A partir do dia seguinte, as células foram cultivadas durante 2 semanas em meio contendo 400 ug /mL e 30 ug /mL de G418 (Cellgro, Manassas, VA) para 2008 e 2008C13 respectivamente. Após 2 semanas, as células foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com ácido acético 25% e 75% de metanol à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois coradas com 0,1% de violeta de cristal. As colónias foram contadas e o número de colónias por placa foi em média de três experiências independentes (colónias 2 mm de diâmetro foram considerados positivos). Para confirmar a expressão de VGF, as células foram colhidas 48 horas após a transfecção e análise por Western blot foi realizada, utilizando-se de VGF anticorpo (Santa Cruz, CA), normalizada por níveis de p-actina (anticorpos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
resultados
frequência geral de metilação em amostras de OC e amostras ovariana normal (conjunto de treinamento)
Treze genes (
PGP9.5
,
HIC1
,
aim1
,
APC
,
PAK3
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1
,
MGMT, VGF
e
FKBP4) foram analisadas para PH usando QMSP em dois conjuntos diferentes de amostras. As frequências de metilação observadas de cada gene para o conjunto de treino são resumidos na Tabela 2A. Resumidamente, no conjunto de treinamento (total), os genes mais frequentemente metilados foram:
PGP9.5
,
HIC1
,
ESR1 e VGF
. A frequência observada de metilação neste conjunto foi de 19% (11/57) para o
ESR1
, 67% (38/57) para o
HIC1
, 28% (16/57) para
PGP9.5
e 37% (21/57) para o
VGF
. Cada um dos últimos 4 genes foram significativamente mais metilado em OC do que o normal (p = 0,05 para cada gene). Combinando todos os 4 genes analisados no conjunto de treinamento, observamos metilação em pelo menos 1 dos 4 genes em 81% (46/57) das amostras de OC, com uma especificidade de 100%.
este conjunto de amostras de tumor foram analisadas para o gene único propósito de pré-selecção. Para maximizar a especificidade, um valor de corte empírica foi determinada acima do valor mais elevado no grupo de controlo para cada gene. O valor de corte de cada gene é mostrada na Tabela 2A.
Associação entre as mudanças de metilação de DNA e fatores clínico-patológicos no conjunto de treinamento
Nós comparamos o estado de metilação de dois genes (
PGP9.5
e
VGF
) em 57 amostras de OC da formação definida como demográficas e os parâmetros clínico, tais como idade, estágio, tipo histológico, grau, tabagismo e histórico de consumo de álcool dos pacientes, pela logística análise de regressão.
VGF
metilação foi mais frequentemente presentes em fases anteriores (fase I e II) de OC em comparação com a fase tardia (Fase III e IV) de tumores [14/26 (54%) versus 6/30 (20 %) metilado] (odds ratio, OR = 0,21, 95C.I. [0,07-0,7],
p
valor = 0,011). Correlações com todos os outros parâmetros clínico-patológicas não foram significativas com a metilação de qualquer um dos outros genes (Tabela 3A).
frequência de metilação do
VGF
e
PGP9.5
na validação independente (IV) conjunto de amostras e correlação clínico-patológico
com base na disponibilidade de amostras e novidade dos genes para OC e metilação frequências no conjunto de treinamento, foram selecionados 2 genes (
VGF
e
PGP9.5
) para testar em uma coorte independente de amostras compostas de 372 carcinomas, 18 tumores borderline e 17 cystadenomas. Ambos
VGF
e
PGP9.5
metilação mostrou um padrão específico de câncer, com 43% e 85%, respectivamente frequência em tumores, enquanto 0% em indivíduos normais, como afirmado anteriormente (Tabela 2B) ( Figura 1). Curiosamente alta frequência de metilação foi observado para ambos os genes em tumores borderline e cystadenoma (Tabela 2B) (Figura 1).
Cálculo do
PGP9.5
ou
VGF
gene
rácios
p-actina foi com base nos valores de intensidade de emissão de fluorescência para ambos os genes obtidos por análise de PCR em tempo real quantitativa específica-metilação. Os rácios obtidos foram multiplicados por 1,000 para tabulação mais fácil. Zero valores são indicados na parte inferior do gráfico, mostrando a quantidade de amostras, uma vez que não podem ser correctamente representada graficamente numa escala logarítmica. (A)
PGP9.5
valores de metilação em amostras normais (0/13, 0%), cystadenomas (12/17, 71%), tumores borderline (18/18, 100%) e tumores do ovário ( 316/372, 85%). (B) A metilação do
PGP9.5
ao longo dos tipos histológicos (O.R = 0,24, 95% C.I [0.14-0.40],
p
. 0,001). (C)
PGP9.5
metilação foi significativamente correlacionada com menor grau (O.R = 0,24, 95% C.I. [0,14-0,40],
p
= 0,012). (D)
PGP9.5
metilação foi significativamente correlacionada com ausência de doença residual (inferior a 2 centímetros) (OR = 0,41, 95% CI [0,24-0,68],
p
= 0,001) . (E)
PGP9.5
metilação foi significativamente correlacionada com estágio precoce de tumores (OR = 0,26, IC 95% [0,16-0,45]
p
. 0,001 (E)
VGF
valores de metilação e freqüências em amostras normais (0/13, 0%), cystadenomas (5/16, 31%), tumores borderline (6/18, 33%) e tumores do ovário (158/366, 43 %).
no conjunto de validação independente, usando análise de regressão logística univariada, comparamos o estado de metilação de
VGF
e
PGP9.5
para demográficas e os parâmetros clínico, tais como idade, estágio, tipo histológico, grau e presença de doença residual após a cirurgia.
PGP9.5
metilação (usando o corte acima do percentil 75 do rácio de metilação) foi significativamente correlacionada com grau inferior e estágio precoce de tumores (OR = 0,52, IC 95% [0,31-0,86],
p
= 0,012) e (OR = 0,27, IC 95% [0,16-0,45],
p
0,001), respectivamente, bem como com a ausência de doença residual (OR = 0,41, IC 95% [0,24-0,68],
P
= 0,001) e o tipo histológico (não-serosa) (OR = 0,24, IC 95% [0,14-0,40],
P
0,001) (Tabela 3B) (Figura 1). Um resumo das metilação do
VGF
e
PGP9.5
com correlação clínico-patológico no conjunto de validação independente são apresentados na Tabela 3B.
Todos os 372 casos de carcinoma de ovário do conjunto de validação independente estavam disponíveis para acompanhamento análise. Usamos Cox proporcional Hazard modelo para prever a sobrevida global (SG) e sobrevida específica da doença (DSS) desses 372 pacientes associados com PH de
PGP9.5
e
VGF
. Mediano de acompanhamento para estes pacientes foi de 30 meses, variando de 1 a 234 meses. Consistente com a observação anterior, por uma análise de regressão de Cox univariada, encontramos correlação entre a sobrevivência pobre com posterior estágio (III /IV) do tumor (Hazard Ratio (HR) CI 8,22, 95% [4,91-13,76], p 0,001),