Sumário

A apoptose pode ser desencadeada de duas maneiras diferentes, através do intrínseca ou a via extrínseca. A via intrínseca é mediada pelas mitocôndrias através da libertação de citocromo C, enquanto que a via extrínseca é solicitado por sinais de receptor de morte e ignora as mitocôndrias. Estes dois percursos estão intimamente relacionadas com a proliferação celular e sobrevivência cascatas de sinalização, que, assim, constituem possíveis alvos para a terapia do cancro. Em estudos anteriores, introduziu duas plantas flavonóides isoméricas derivadas, flavona A e B flavona que induzem a apoptose em células de cancro altamente tumorigénicas da mama, do cólon, do pâncreas, e da próstata. Flavona A apresentou actividade citotica potente contra carcinomas mais diferenciados do cólon (Caco-2) e do pâncreas (Panc28), ao passo que flavona acção B citotóxica é observada em carcinomas pobremente diferenciadas do cólon HCT (116) e pâncreas (MIA PACA). A apoptose é induzida por flavona A em cancro do cólon melhor diferenciado Caco-2 e do cancro do pâncreas Panc 28 células através da via intrínseca pela inibição das formas activadas de quinase extracelular regulada por sinal (ERK) e PS6, e subsequente perda de fosforilação de Bcl -2 promotor morte associada (BAD) de proteína, enquanto que a apoptose é desencadeada por flavona B em pouco diferenciado HCT câncer de cólon 116 e MIA PACA pancreáticas células cancerosas através da via extrínseca com a regulação positiva concomitante das formas fosforiladas de ERK e c-JUN em serina 73. Essas mudanças nos níveis de proteína, finalmente, levar à ativação da apoptose, sem o envolvimento de AKT

Citation:. LeJeune TM, Tsui HY, Parsons LB, Miller GE, Whitted C, Lynch KE, et al. (2015) Mecanismo de ação de dois flavonas Is�eros Segmentação células cancerosas com Variando Estado de Diferenciação Celular. PLoS ONE 10 (11): e0142928. doi: 10.1371 /journal.pone.0142928

editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicina da Universidade, TAIWAN

Recebido: 29 Abril, 2015; Aceito: 28 de outubro de 2015; Publicação: 25 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 LeJeune et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade de East Tennessee State Gatton faculdade de Farmácia (https://www.etsu.edu/pharmacy/), concessão 82.171 das principais Bolsas de Programa Comitê Universidade Development Research East Tennessee State (https://www.etsu.edu/research/rdc/) e do Departamento de Química da Universidade de Ciências Aplicadas y Ambientales (http: //www. udca.edu.co/)

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a prevalência de câncer tem aumentado de forma constante ao longo do passado. décadas [1]. Enquanto as terapias actuais são eficazes a vários níveis, muitos destes tratamentos estão também não específica em relação ao seu mecanismo de acção. Isto por sua vez aumenta os resultados indesejáveis ​​experimentados pelos pacientes tratados; efeitos colaterais severos e baixas taxas de eficácia são algumas das muitas razões pelas quais os tratamentos mais específicos em oncologia foram procurados. Entre esses esforços, os produtos naturais [2] têm sido estudados extensivamente na esperança de identificar novas entidades moleculares com propriedades anti-neoplásicos. Destes produtos naturais, flavonóides, uma classe de compostos polifenólicos encontrados em plantas, têm sido mostrados para exercer antineoplásicos [3-9] propriedades, bem como antioxidante [10, 11], anti-inflamatório [12], antimicrobiana [13] e antiviral [14, 15] atividades.

Durante os últimos cinco anos, a nossa investigação centrou-se sobre as plantas das montanhas andinas em grande parte conhecidos como

vira Viras

. Estas plantas têm sido utilizados pelos povos nativos desta região para fins medicinais, como no tratamento de câncer, como relatado em vários estudos etnobotânicos [16, 17]. Eles pertencem à família

Asteraceae

, gêneros

Gnaphalium

,

Achyrocline

, e

Gamochaeta

. Nosso foco no que diz respeito às plantas Vira-vira foi colocado em

Gnaphalium elegans

e

Achyrocline bogotensis

a partir do qual dois compostos ativos foram isolados, 5,7-di-3,6,8-trimetoxi (5,7-di-hidroxi-3,6,8-trimethoxyflavone ou flavona A) [18], e 3,5-di-hidroxi-6,7,8-trimetoxi-2- 4-ona 2-fenil-4H-cromen- (3,5-di-hidroxi-6,7,8-flavona trimethoxyflavone ou B), respectivamente [19] 4-ona fenil-4H-cromen-. Tem sido proposto no nosso trabalho anterior que estes dois isómeros flavona pode ser relevante para as actividades anti-neoplásicos destas plantas [20]. Com efeito, flavonas A e B demonstrou actividade citotóxica contra linhas celulares derivadas de cancros do cólon, do pâncreas, da mama, da próstata e que foram categorizados como sendo altamente tumorigénicas, os resultados mais promissores em cancros do cólon e do pâncreas. Elevados níveis de expressão de aldeído desidrogenase (ALDH) é considerado como um marcador muito específico utilizado na detecção de células de cancro de iniciação como subpopulações em tumores, e tem sido demonstrado especificamente nas linhas celulares estudadas [21-23]. Entre estas linhas de células altamente tumorigénicas, os dois isómeros mostram actividade antineoplásica flavona preferencial em células com diferente estado de diferenciação. Flavona A apoptose induzida nas linhas celulares melhor diferenciados, mas não em linhas celulares pouco diferenciadas, enquanto flavona B mostrou ser activo contra fracamente diferenciado, mas não contra as células mais diferenciadas. Além disso, estes dois isómeros de flavona de não induzir a apoptose em células normais e exibem uma actividade apoptótica significativamente menos em linhas de células tumorigénicas menos [20].

Sabe-se que a gestão de apoptose mitocondrial pode ser controlada através da actividade de sobrevivência factores, tais como factores de crescimento ou citocinas, via receptores extracelulares de activação de cascatas de eventos de proteína que eventualmente levam à clivagem da Caspase-3. Estas vias foram sondadas por investigar os efeitos dos dois isómeros de flavona sobre cinases reguladas por sinais extracelulares (ERK), proteína quinase B (AKT), S6 proteína ribossómica (S6), e Bcl-2 promotoras de morte associada (BAD). A indução preferencial de apoptose em células altamente tumorigénicas com diferente estado de diferenciação por flavona A e B flavona, dois compostos estruturalmente semelhantes, sugerem que a activação de diferentes vias celulares por cada composto. Este estudo mostra que flavona A exerce o seu efeito citotóxico sobre as células cancerosas melhor diferenciados através de uma via apoptótica intrínseca Considerando flavona B ignora a via mitocondrial para induzir apoptose através de uma via extrínseca em células de cancro mal diferenciados.

Materiais e Métodos

Extração, purificação e identificação de flavonas

As flavonas foram obtidos como descrito anteriormente [20]. Resumidamente, flavona A foi purificado a partir de 1,5 kg de

L

.

elegans

flores secas extraídos com CHCl

3. O extracto foi concentrado por vácuo seco, dissolvido em metanol, e filtrou-se para eliminar as gorduras e hidrocarbonetos. Depois concentrou-se e dissolveu-se em C

6H

6 seguido por cromatografia em gel de sílica utilizando C

6H

6: Me

2CO (19: 1) como eluente. A partir deste, a 50 mg de flavonóides foi purificado a partir das fracções 12 a 18 por cristalizações em hexano. O composto foi identificado por suas propriedades físicas e espectroscópicas como 5,7- di-hidroxi-3,6,8 trimethoxyflavone, pf 171C 170, 1H RMN (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,20 (3H, s), 7,50 7,6 (3H, m), 8,08 8,16 (2H, m). Flavona B foi purificada a partir de 200 g de folhas frescas de

A

.

bogotensis

. As folhas foram submersas em CHCl

3 durante 20 minutos e depois filtrou-se, concentrou-se, e dissolveu-se em metanol quente. A fim de eliminar as gorduras e hidrocarbonetos, o extracto fria foi filtrada e concentrou-se novamente. O sólido resultante foi então dissolvido em hexano quente e recristalizações sucessivas em hexano produziu 100 mg de flavonóide purificada. O composto foi identificado por suas propriedades físicas e espectroscópicas como 3,5-di-hidroxi-6,7,8-trimethoxyflavone, pf 149 150 ° C, 1H RMN (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 3,99 ( 3H, s), 4,12 (3H, s), 7,30 7,45 (3H, m), 8,70 8,82 (3H, m), 11,46 (1H, s).

linhas de células e condições de cultura.

cólon (Caco-2, HCT116) e pâncreas (MIA PaCa-2) linhas celulares foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e foram cultivadas de acordo com as instruções da ATCC. A linha celular Panc28 foi uma oferta do Dr. Paul Chiao (University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX), e foi cultivado da mesma maneira como a linha de células pancreáticas MIA Paca-2. As células foram cultivadas em meio suplementado com 10% de soro (Gibco, Grand Island, NY) e penicilina /estreptomicina (Hyclone, Logan, UT). Todas as células foram semeadas e deixou-se atingir 75% de confluência antes do tratamento com flavona A, B, ou veículo (sulfóxido de dimetilo) a uma concentração final máxima de 0,27% nas cavidades tratadas (Sigma Aldrich, St Louis, MO).

Detecção de apoptose por microscopia de fluorescência

a apoptose foi detectada utilizando o kit de anexina V-FITC da Abcam (Cambridge, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de 4-5×10

4 /poço, em 12 mm lamelas circulares (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), deixa-se atingir 75% de confluência e tratadas com quer veículo, Flavone A, ou flavona B a uma concentração de 40 uM. Seis horas após a dosagem, as células foram incubadas em tampão e FITC-anexina V conjugada com ligação durante cinco minutos no escuro. As células foram depois fixadas com 2% de p-formaldeído e as imagens foram obtidas utilizando um microscópio de fluorescência EVOS (AMG, Bothell, WA).

Análise do ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo

Células cultivadas em placas de seis poços, foram tratados com veículo, seja de dissolução, flavona a, ou flavona B. Depois de nove horas de incubação, as células foram retiradas da placa com tripsina, e ensaiadas para a quantificação de distribuições de apoptose e o ciclo celular utilizando um anexina V- kit de FITC de Abcam (Cambridge, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram suspensas em tampão de ligação e de anexina V-FITC e iodeto de propidio foram adicionados, seguido por uma incubação de cinco minutos no escuro. A contagem de células foi obtida utilizando fluxo BD Accuri C6 citômetro (BD Biosciences, San Jose, CA) e analisados ​​com cflow Plus (BD Biosciences).

Anticorpos e reagentes

O mecanismo de ação foi avaliada usando anticorpos contra ERK2 de Santa Cruz (Dallas TX), AKT da Millipore (Billerica, MA), c-JUN e BAD de sinalização celular (Beverly, MA), fosforilada c-JUN (T91 /93) a partir Abcam (Cambridge, MA ), fosforilada c-JUN (S63 /73), as formas fosforiladas de ERK, proteína ribossômica S6 (91B2) e BAD, de sinalização celular, fosforilada AKT S473 da Millipore, BH3-interagindo agonista morte de domínio (Bid) a partir de R D Systems (Minneapolis, MN), formas inactivas e activas da caspase 3 a partir de Santa Cruz e R D Systems, caspase 8 e caspase 10 de MBL (Woburn, MA), e caspase 9 a partir de Cell Signaling e α-tubulina e β -actina a partir de Sigma (St. Louis, MO). Todos os anticorpos secundários foram purificados por afinidade sem reactividade cruzada com outras espécies. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase foram obtidos a partir de Pierce (Rockford, IL), Promega (Madison, WI), e Jackson ImmunoResarch (West Grove, PA). Alexa Fluor anticorpos secundários 488 e 594-conjugados (Molecular Probes, Eugene, OR) foram usados ​​tal como especificado pelo fabricante. Tamoxifeno utilizado para obter um sinal de controlo positivo para a análise da fosforilação de c-Jun foi da Sigma.

PAGE e Immunoblot

As células tratadas foram lisadas com tampão de lise que consiste em imidazol a 20 mM, 100 mM de KCl, 1 mM de MgCl

2, 10 mM de EGTA, 0,2% de Triton X-100, inibidores de fosfatase e protease (Sigma Aldrich). A concentração de proteína dos lisados ​​celulares foi medida espectrofotometricamente (Cary 50; Varian, Palo Alto, CA) usando um ensaio de proteína do citoesqueleto (Denver, CO, EUA). As amostras foram corridas em SDS-PAGE e, em seguida, transferido para nitrocelulose ou PVDF folhas. O sinal do monoclonal primário ou anticorpos policlonais foi detectada utilizando cabra purificado por afinidade, anti-ratinho secundário ou imunoglobulinas anti-coelho acoplado a peroxidase e um sistema quimioluminescente (Pierce; Grand Island, NY) e expostas em filme de raios X (Kodak; Rochester, NY). A intensidade das bandas foi estimada através da digitalização da imagem (imagem J-) a partir de uma película de raios-x. Depois de subtrair o fundo, todas as intensidades de bandas foram comparados com o controlo.

Imunofluorescência

A imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, as células foram fixas com 3% de p-formaldeído, durante 20 min à temperatura ambiente. Após lavagem, as células foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 durante 5 min ou 0,1% de saponina durante todo o procedimento. A permeabilização foi seguida por têmpera dos grupos aldeído em 50 mM NH

4Cl. As células foram então incubadas com anticorpo primário diluído em 1% de BSA, durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavagens e de incubação com o anticorpo secundário, as células foram montadas em 10% de álcool polivinílico, 30% de glicerol, 1% de gaiato de n-propilo, e Slow Fade (Molecular Probes, Invitrogen) a uma diluição de 5: 1. imagens de fluorescência foram obtidas utilizando um microscópio de fluorescência EVOS (AMG, Bothell, WA).

Resultados

Flavone A e B Flavone induzir a apoptose e ciclo celular turno

O nosso anterior dados sugerem que flavonas A e fragmentação do DNA B causa em células melhor e pouco diferenciados, respectivamente [20]. Os ensaios de anexina V foram realizados para confirmar a indução da apoptose em células tumorigénicas estado após a dosagem com as flavonas. A apoptose foi detectada 6 horas após o cancro do pâncreas Panc-28 (Figura 1A) e células de cancro do cólon de Caco-2 (Fig 1B) foram doseados com 40 pM de flavona A. Do mesmo modo, a apoptose foi detectada 6 horas após o cancro do pâncreas MIA Paca -2 (Figura 1C) e células de cancro do cólon HCT116 (Figura 1D) foram doseados com 40 pM de flavona B. Para quantificar as alterações apoptóticas induzidas por as flavonas, células doseados com o veículo ou flavona, foram analisadas 6, 9 e 12 horas após o tratamento por meio de citometria de fluxo utilizando iodeto de anexina V /propídio. Aos 9 horas, Panc 28 células tratadas com flavona A tinha 2,9 vezes de aumento na apoptose (Fig 2A e 2C). Da mesma forma, em 9 horas, HCT 116 células tratadas com flavona B tinha um aumento de 2,3 vezes na apoptose (Fig 2B e 2C).

efeito apoptótico de flavona A a uma concentração de 40 uM, no pâncreas mais diferenciada Panc28 e cólon Caco 2 células de cancro (FIG 1A e 1B), como determinado por ensaio de Anexina V (canal verde) seis horas após o tratamento. DAPI (azul canal) é usada para localizar os núcleos das células. As células tratadas apenas com veículo (DMSO a uma concentração final de 0,27%) serviu como um controlo. A activação da apoptose no pâncreas pouco diferenciada MIA PACA e de células de cancro do cólon HCT116 (Figuras 1C e 1D) por flavona B a uma concentração de 40 uM, tal como determinado pelo ensaio de Anexina V (canal verde) seis horas após o tratamento. condições de controle são os mesmos como descrito acima e Dapi foi usado para localizar núcleos.

A. A apoptose foi detectada utilizando Anexina V-FITC e iodeto de propídio em Panc 28 células tratadas com 40 pM flavona A, 9 horas após o tratamento. B. Detecção de apoptose em células HCT 116 tratadas com 40? M B flavona, 9 horas após o tratamento. C. Bar representação gráfica da apoptose em Panc 28 e HCT 116 células tratadas com flavona A e B, respectivamente. D-E. determinação do ciclo celular utilizando iodeto de propídio em 28 células tratadas Panc 40 uM flavona A. F-G. determinação do ciclo celular em células HCT 116 tratadas com 40? M flavona B.

Para testar se o tratamento com flavona A ou flavona B tinha um efeito sobre a distribuição do ciclo celular, citometria de fluxo ensaios utilizando iodeto de propidio foram realizadas. células pancreáticas melhor diferenciados células Panc 28 foram tratados com flavona A (Fig 2D e 2E). Após 9 horas, uma mudança de fase G0 /G1 para a S e fases G2 é claramente visto. Mal células cancerígenas do cólon diferenciada HCT 116 foram tratados com flavona B. Uma mudança similar da fase G0 /G1 a S e fases G2 é aparentes 9 horas após o tratamento (Fig 2F e 2G).

Flavone A tem um inibidor efeito sobre a ERK fosforilada e S6, mas não tem efeito sobre a AKT ou c-jun em Panc28 melhor diferenciados e Caco-2 células cancerosas

a fim de determinar o mecanismo responsável pelo efeito citotóxico sobre as células cancerosas melhor diferenciados observado após o tratamento com uma flavona, proliferativa, sobrevivência, e as vias de sinalização de apoptose foram examinados. O cancro do cólon células de cancro do pâncreas Panc28 Caco-2 e foram doseados com 40 pM de flavona A e níveis de AKT activado, ERK, S6, e c-Jun foram analisadas. Como mostrado na Fig 3A e 3C, a dosagem células Panc 28 com flavona A induziu uma redução média da forma fosforilada da ERK a 64,27% (51,84% -74,83%; P = 0,0029) e de 52,58% para PS6 (37,90% -62,50 %; p = 0,012), em comparação com o controlo. Nas células Caco-2, a redução média de ERK fosforilada por flavona A foi de 42,58% (25,38% -55,64%; P = 0,0031) e 57,99% (43,84% -77,36%; P = 0,0138) para PS6, como comparado para o controlo. Nenhuma mudança foi observada nos níveis das proteínas unphosphosphorylated analisados ​​(Fig 3A) de expressão. Estes resultados de imunotransferência foram confirmados por imunofluorescência. Fosforilados resultados ERK em células Caco-2 são mostrados na Fig 3E. Além disso, as formas activadas de AKT na serina 473 e c-jun na serina 73, também foram estudados uma vez que estas proteínas regulam tanto a sobrevivência celular e a apoptose induzida por stress, respectivamente. Nenhuma destas alterações significativas demonstradas em Panc-28 e Caco-2 linhas de células (Fig 3A e 3C)

A e B:. A detecção das formas activadas e não fosforilados de ERK, c-Jun, S6, AKT por imunotransferência de extractos totais de SDS. 2 e Panc28 células Caco melhor diferenciados foram tratados com 40μM de flavona A (+ a), e fracamente diferenciado MIA PACA e células HCT116 com flavona B (+ B), ou DMSO (-) do veículo de dissolução. Após a lise e SDS-PAGE, as membranas foram sondadas com o anticorpo indicado. As membranas foram sondado para a actina como um controlo de carga, e uma imagem representativa é fornecido. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. C e D: para a quantificação (gráficos) as densidades de banda de as condições tratados /não tratados identificados por (+) ou (-), foram normalizados e calculadas como percentagens do valor para as células não tratadas (100%), e as médias mostradas ± desvio padrão de três experiências independentes (* p 0,05). E e F:. Detecção de ERK fosforilada após o tratamento de CaCO 2 células com células HCT116 A e B de flavona com flavona por imunofluorescência

A expressão aumentada da substância fosforescente-c-Jun (S73) e foram ERK observados após tratamento de células pouco diferenciadas MIA PACA e câncer HCT116 com Flavone B

Um aumento médio de 190,19% da ERK ativado no câncer de pâncreas células MIA PACA (175,32% -204,08%; p = 0,0036; n = 3 ), e 160,23% em células HCT116 do cancro do cólon (144,99% -174,22%; p = 0,012; n = 3) foram observadas após o tratamento com flavona B (Figura 3B e 3D), em comparação com os controlos. Nenhuma mudança foi observada nos níveis das proteínas unphosphosphorylated analisados ​​(Fig 3B) Expressão. Estes resultados de imunotransferência foram confirmados por microscopia de fluorescência e os resultados ERK fosforiladas são mostrados por HCT-116 células (Fig 3F). Também foram observados níveis aumentados da forma fosforilada da proteína c-Jun (S73) em MIA PaCa a 170,83% dos níveis de controlo (162,27% -181,90%; p = 0,0008; n = 3), e em HCT116 a 271,34% (222,95 % -312,93%; p = 0,0028; n = 3), como mostrado na Figura 3B e 3D

Flavone B tem efeitos diferentes em PS6 em MIA PACA e células HCT-116, mas não tem efeito sobre a AKT fosforilado

Após o tratamento das células MIA PACA com flavona B, os níveis médios de PS6 diminuem a 51,68% (19,95% -77,77%; P = 0,0237; n = 3) em relação ao controlo como pode ser visto na Fig 3D. Por outro lado, após o tratamento de células HCT116, um aumento de 149,88% (136,54-170,22; p = 0,0116; n = 3) observa-se, em comparação com os controlos. Os níveis de fosfo-AKT 473 expressão, estavam inalterados após tratamento de células MIA PaCa e HCT116 com flavona B como mostrado na Figura 3B e 3D.

Flavone Um modula a fosforilação de Bad na serina 112 mas não flavona B

Para investigar mais as diferenças de efeito celular de flavona a e B flavona, o estado de fosforilação de Bad em serina 112 foi estudado. linhas de células Panc-28 e Caco-2 doseado com flavona Uma exposição de um declínio na BAD fosforilada na serina 112 (Fig 4A). Esta redução tinha uma média de 35,91% (34,21% -37,61%; P = 0,006; n = 3) em Panc-28, e 57,03% (42,12% -71,62%; P = 0,0068; n = 3) em células Caco-2 células (Figura 4C). Estas observações foram confirmadas através de imunofluorescência para Panc-28, como mostrado na figura 4E. Por outro lado, dosagem MIA PACA-2 e HCT116 células tumorigénicas com 40 mM de flavona B não produziu alterações significativas no valor total de Bad fosforilada na serina 112 como mostrado por western blot (Fig 4B e 4D) e imunofluorescência para MIA Paca-2 ( Figura 4F). Embora não haja uma alteração significativa observada nos níveis de Bad fosforilada expressão em células melhor diferenciados (Fig 4A), um ligeiro aumento é observado nas células pouco diferenciados (Fig 4B)

A e B:. Detecção de a perda de fosforilação do BAD por immunoblot do total de extractos de SDS. Melhor células diferenciadas Panc 28 CaCo e 2 foram tratadas com 40μM de flavona A (+ a), e fracamente diferenciado MIA PACA e células HCT116 com flavona B (+ B), ou DMSO (-) do veículo de dissolução. Após a lise e SDS-PAGE, as membranas foram sondadas com um anticorpo específico para BAD fosforilada na serina 112 ou da proteína não fosforilada. As membranas foram sondado para a actina como um controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. C e D: para a quantificação (gráficos) as densidades de banda de as condições tratados /não tratados identificados por (+) ou (-), foram normalizados e calculadas como percentagens do valor para as células não tratadas (100%), e as médias mostradas ± desvio padrão de três experiências independentes (* p 0,05). E e F: Detecção de Bad fosforilada na serina 112 (canal vermelho), após o tratamento de Panc 28 células com células MIA PACA com flavona B por imunofluorescência flavona A e. DAPI (canal azul) foi utilizado para localizar o núcleo.

Flavone A pode induzir a apoptose via caspase 9

Para determinar se caspase 9 participa na cascata apoptótica iniciada por flavona A, células Caco-2 e Panc28 foram doseados e analisadas por SDS PAGE seguida de imunotransf erência para a presença de fragmentos clivados de 37 e 17 kDa com um anticorpo capaz de detectar a caspase activado. Figura 5A mostra uma imunotransferência representante de Caco-2, e A Fig 5B para células Panc28 de lisados ​​tomadas em diferentes pontos de tempo após a dosagem com flavona A. Ambas as linhas celulares exibir os fragmentos grandes, 37 e 35 kDa, detectada pelo anticorpo (Fig 5A e 5B). O fragmento de 37 kDa é aparente no controlo (células doseados com veículo) sugerindo desregulação da proteína nestas linhas celulares. No entanto, uma redução progressiva do nível de expressão de procaspase 9 (47kDa) é evidente a partir de 3 horas após a administração.

A detecção de caspase ativada 9 por imunotransferência de extractos de SDS de A. CaCo 2 e B. Panc 28 células 1,5, 3, 6, 9 e 12 horas (pistas 2-6) após o tratamento com flavona a ou veículo (DMSO) para o controle (C, pista 1) e SDS-PAGE. As membranas foram sondadas com um anticorpo capaz de detectar tanto o procaspase (47 kDa) e as grandes fragmentos resultantes após a activação (37 e 35 kDa). As membranas foram sondado para a actina ou tubulina como um controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. As membranas foram sondado para a actina ou tubulina como um controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Flavone B nem fosforilar c-JUN na treoninas 91 e 93 nem ativar caspases 8 e 10 em HCT 116 ou células MIA PACA

para confirmar a activação flavona B do programa apoptótico através da via extrínseca, sem o envolvimento da via intrínseca, estudou-se formas de fosforilação de c-Jun relevantes para o engate das mitocôndrias através da clivagem de caspase 8 [25, 26]. HCT 116 e MIA PACA células doseados com flavona B não mostram a activação de c-Jun em treoninas 91 e 93 como mostrado na Fig 6A através de imunof luorescência em células HCT 116. células cancerosas da mama SKBR3 doseados com tamoxifeno, um controlo positivo para esta activação [27], foram processados ​​do mesmo modo como descrito acima (Fig 6B). Este resultado foi confirmado por imunotransferência como se mostra na figura 6C. O exame do estado de activação das caspases 8 e 10 nestas células após o tratamento com flavona B não mostraram clivagem desta proteína tanto na HCT 116 ou as células MIA PACA. Isto é evidente pela presença das caspases não clivadas em diferentes pontos de tempo abrangendo desde 1.5-12 horas. imunotransferências de experiências representativas decurso de tempo para as caspases 8 e 10 em células HCT 116 são mostrados na Figura 6D e 6E, respectivamente.

A e B. A imunofluorescência de células tratadas mostram a expressão de fosfo-c-Jun (T91 /T93 ) em células SKBR3 (canal verde) mas não em células HCT116. DAPI (azul canal) foi utilizado para localizar os núcleos. C. Imunotransferência de fosfo-c-Jun (T91 /T93) utilizando extractos de SDS de células HCT116 pobremente diferenciadas tratadas com 40μM de flavona B (+ B), ou o veículo de dissolução de DMSO (-). Os lisados ​​de SDS de células SKBR3 tratadas com tamoxifeno 10 uM (+) foram utilizadas como um controlo positivo. Após SDS-PAGE, as membranas de nitrocelulose foram sondadas com um anticorpo específico para esta forma fosforilada. D. Detecção da caspase 8 por imunotransferência de lisados ​​de SDS de células HCT116 de 1,5, 3, 6, 9 e 12 horas (pistas 2-6) após o tratamento com flavona B ou veículo (DMSO) para o controlo (C, pista 1) e SDS-PAGE. As membranas foram sondadas com um anticorpo capaz de detectar tanto o procaspase (54/55 kDa) e os fragmentos resultantes após a activação (43 e 18 kDa). As membranas foram sondado para a actina ou tubulina como um controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Discussão

Nós tínhamos mostrado anteriormente diferencial efeitos antineoplásicos de flavonas A e B em células cancros da mama (MCF-7, SKBR3) , cólon (Caco-2, HCT116), pâncreas (Panc 28, MIA PACA) e próstata (LnCaP, PC3) com o estado de diferenciação diferentes. As flavonas foram extraídos de

G

.

elegans Comprar e

A

.

bogotensis

, plantas com propriedades medicinais como esse são, portanto, utilizados indistintamente de acordo com estudos etnobotânicos. No entanto, as flavonas não são exclusivos para estas espécies. Flavona A foi encontrada em

ainsliaea henryi

[28] e em

decumbens Helichrysum [29]

enquanto flavona B foi isolado de

Helichrysum graveolens

[30], como bem como

Helichrysum odoratissimum

[31], e

Helichrysum compactum

[32]. Flavonas A e B demonstraram um efeito citotóxico significativo contra linhas de células altamente tumorigénicas, enquanto poupando células epiteliais normais. Especificamente, demonstrou flavona Uma alta citotoxicidade contra a Panc28 mais diferenciado e células Caco-2, enquanto flavona B mostraram uma preferência por pouco diferenciado MIA PaCa, HCT 116, e células SKBR3 [20]. Tempo de duplicação celular, e a presença de marcadores de diferenciação e de polaridade específicos são utilizados para determinar o estado de diferenciação celular. Entre as células testadas, Panc28 foi anteriormente descrito como pouco diferenciado, principalmente devido à ausência de marcadores de polaridade presentes em outras linhas de células pancreáticas tais como Capan-1, apesar do facto de que tem um tempo de duplicação de células bastante longo. No entanto, é do consenso geral que as células Panc 28 tem um estado de diferenciação mais elevada do que as células MIA PACA [33], e os nossos resultados sugerem que as flavonas podem ser sensíveis a esta diferença. Para entender melhor o mecanismo pelo qual o programa apoptótica é iniciada por flavonas A e B em suas células-alvo, que avaliou o efeito de cada flavona em extrínseca chave e proteínas via apoptótica intrínsecas, tais como ERK, PS6, AKT, BAD, e c -jun nas suas formas activadas.

os nossos resultados sugerem que Flavone a pode induzir apoptose em células de cancro do cólon e pancreáticos melhor diferenciados, através da via intrínseca mitocondrial. Isto é evidente pela diminuição da ERK fosforilada e S6 e subsequente perda de BAD activado. A fosforilação mantém BAD no citoplasma, e os seus resultados de perda de ligação e inactivação das proteínas de sobrevivência de Bcl-xL ou Bcl-2 depois de atravessar a membrana mitocondrial [34] activando assim a apoptose. Uma diminuição significativa de Bad fosforilada na serina 112 é observada no cancro pancreático Panc 28 e do cancro do cólon células Caco-2, após tratamento com flavona A. A activação de Bad na serina 112 é mediado por via de MAPK, especificamente através da activação de ras- RAF-ERK [35]. Assim, a inibição da fosforiladas ERK e S6 observada após tratamento com flavona A, pode estar a montante da perda de Bad activado na serina 112 e o início subsequente da apoptose por meio da ruptura da integridade da membrana mitocondrial e à libertação de citocromo c e outra apoptótica factores. Estes eventos podem levar à activação da caspase 9 e caspases efectoras. No entanto, caspases são altamente desregulamentado no cancro através de várias mutações ou perda de expressão [36]. No caso da caspase 9, estes são incomuns, e é a revogação de actividades funcionais mitocondriais pós que favorecem a progressão tumoral [37]. Este pode ser o caso em nossos resultados da caspase 9, em que a caspase está presente em activado controlo e as células tratadas, o que pode sugerir a perda da função apoptótica. É importante notar que a integridade mitocondrial auditivos pode desencadear um programa independente de caspase-9 padrão de morte celular [38]. Se a apoptose ocorre independentemente da caspase 9 actividade ou pela criação de uma proporção favorável de caspase activa vs inactivo, como pode ser visto nos resultados, nós apresentamos provas que suportam a activação de uma via intrínseca. Além disso, os nossos resultados mostram também que nem nem AKT c-Jun estão envolvidas no mecanismo de acção proposto para Flavone A.

Por outro lado, flavona B induz a apoptose em células cancerosas pouco diferenciados do pâncreas e do cólon através de um via extrínseca.