Abstract

subunidades dos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) estão associados a diferentes aspectos do comportamento de fumar como bem como com distúrbios relacionados com o tabagismo. Várias destas subunidades foram encontrados para ser regulada positivamente em fumadores ou expresso diferencialmente em células tumorais de pulmão. Os mecanismos subjacentes a estas observações não são conhecidos, mas assumiu ser principalmente pós-transcricional. Muitos mecanismos pós-transcricional são iniciadas por motivos de sequências funcionalmente relevantes dentro das regiões de genes não traduzidas, tais como a montante quadros de leitura abertos (uORFs). Foi realizada uma busca sistemática em todas as neuronais subunidades de nAChR associada ao tabagismo e identificou uORFs funcionalmente relevantes em

Chrna4

e

CHRNA5

. luciferase experiências mostraram que estes uORFs são capazes de diminuir significativamente a expressão da proteína. Nossa quantitativa PCR em tempo real (qPCR) resultados sugerem fortemente que os efeitos observados se originam na tradução, em vez de no nível de transcrição. Curiosamente, o

Chrna4

uORF foi apenas funcionalmente relevante quando expresso no mais curto isoforma deste gene. Portanto, os dados apresentados neste estudo aponta fortemente para um papel importante da uORFs dentro da 5’UTR de

Chrna4

-isoform 1 e

CHRNA5

como reguladores da tradução da proteína. Além disso, o uORF compartilhada de

Chrna4

-isoform 1 /isoforma 2 representa o primeiro exemplo de um uORF sequência dependente do contexto

Citation:. Eggert M, Aichinger E, Pfaffl MW, Steinlein OK , PFOB M (2013) receptor de acetilcolina nicotínica subunidades α4 e α5 Associado com Comportamento Tabagismo e câncer de pulmão são regulados pela Upstream leitura aberta. PLoS ONE 8 (7): e66157. doi: 10.1371 /journal.pone.0066157

editor: Huibert D. Mansvelder, Neuroscience Campus Amsterdam, Universidade VU, Holanda The Sims

Recebido: 12 Março, 2013; Aceito: 02 de maio de 2013; Publicação: 02 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Eggert et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft [STE16511-2] eo Friedrich-Baur-Stiftung [no 57/12]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O tabagismo é conhecido como um importante fator de risco para doenças malignas doenças cardiovasculares e tabagismo-associados como câncer de pulmão [1]. No entanto, aproximadamente a cada três adultos em todo o mundo fuma eo número está a aumentar [2]. Portanto, não é de estranhar que grandes esforços são feitos para descobrir as causas da dependência da nicotina, bem como para desenvolver novas estratégias de prevenção e terapia. A nicotina actua como um agonista de acetilcolina que é capaz de se ligar a receptores de acetilcolina nicotínicos neuronais (nAChR). O nAChR formar canais iônicos pentam�ica heterogéneos e homogéneos com um padrão de expressão diversa em tecidos neuronais e não neuronais [3]. Consequentemente, muitos dos genes que codificam para subunidades de nAChR são suspeitos de desempenhar um papel fundamental em relação a dependência da nicotina. Vários genes de subunidades de nAChR já foram ligados ao tabagismo e as doenças relacionadas com o tabagismo. Por exemplo,

CHRNA7

, foi mostrado o gene que codifica a subunidade nAChR α7 para reprimir a proliferação das células basais e das vias aéreas para remodelar o epitélio pulmonar. Além disso, a hipótese de que surgiu expressão desregulada α7 dá origem a transformações pré-neoplásicas [4], [5]. variantes genéticas dentro da região de codificação, mas também na região promotora de

Chrna4

estão associados com ambas as respostas subjetivas para fumar e resultados de cessação do tabagismo [6] – [10]. No entanto, a maioria dos estudos que foram publicados sobre o tema de receptores colinérgicos e dependência de nicotina /doenças relacionadas com o tabagismo apontam para o cluster gene nAChR no cromossomo 15. Os polimorfismos dentro desta região que são mais consistentemente relatados para ser associado com a quantidade de fumar, dependência de nicotina , câncer de pulmão e doença arterial periférica estão localizados no

CHRNA5

ou

CHRNA3

gene [11] – [16]. Além disso, as associações entre

CHRNB3

polimorfismos e resposta ao uso do tabaco primeira vez foram descritos [17].

Os mecanismos pelos quais genes nAChR associados à dependência de nicotina são regulados não são conhecidos em detalhe até agora . Em geral, a expressão do gene podem ser modificados, quer pré ou pós-transcricionalmente. Os últimos mecanismos são muitas vezes mediada por motivos de sequências que actuam em cis localizadas no interior das regiões não traduzidas (UTR) que se encontram presentes a montante ea jusante da maior parte das regiões de codificação de genes eucarióticos. Vários motivos no 5’UTR responsáveis ​​pela regulação da translação foram identificados em genes eucarióticos, tais como locais internos de entrada de ribossoma, elementos responsivos de ferro a montante e sequências de leitura aberta (uORFs). Os últimos elementos podem desempenhar um papel crucial na regulação da expressão gênica. Um crescente corpo de evidências que mostra uORFs são capazes de afectar a tradução de proteínas de várias maneiras. ribossomos digitalização traduzindo um uORF pode não ser capaz de reiniciar mais a jusante na região codificadora ATG, ou pode parar na uORF, bloqueando outros ribossomos (obstáculo ribossomal). Alternativamente, o códon de parada do uORF pode ser confundido como uma mutação nonsense, provocando um absurdo decadência mediada. [18], [19]. Além disso, a proteína uORF si pode modular a tradução, como indicado por experiências de mutagénese que introduzem mutação sem sentido dentro de sequências uORF [20]. Todos estes mecanismos são susceptíveis de aumentar a variabilidade funcional de genes nas populações. A importância funcional dos uORFs é ainda mais enfatizada pela constatação de que mutações dentro deles são capazes de causar doenças humanas, como trombocitemia hereditária ou Marie Unna perda de cabelo hereditária [21], [22].

No presente estudo, realizada uma busca sistemática de uORFs funcionalmente relevantes em subunidades de nAChR que são suspeitas de estarem envolvidas na dependência da nicotina e doenças relacionadas ao fumo. Nossos experimentos revelaram que alguns uORFs contribuem para a regulação da expressão da proteína nAChR.

Materiais e Métodos

In silico

análise da uORFs putativos no 5’UTR de α3, α4, α5, α7, e SS3 subunidades de nAChR

5’UTRs de

CHRNA3, Chrna4

isoforma 1 e 2,

CHRNA5, CHRNA7

e

CHRNB3

(que codifica para nAChR subunidades α3, α4, α5, α7 e SS3) foram selecionados para começo de em-quadro e códons de terminação a montante do principal códon de iniciação com o StarORF Finder (https://star.mit.edu/orf/runapp .html). SNPs validados pela vista gene SNP da NCBI e situadas a sequência uORF ou criação /exclusão de um uORF foram considerados para investigação (Fig. 1).

‘UTRs de genes de subunidades nicotina associada à dependência de nAChR com uORFs putativos. A posição pb para cada uORF (start /stop) é descrita a partir da principal códon de iniciação em 5’direção.

Chrna4

isoforma 1 e 2 isoforma diferem na sua região de codificação, com mais de iniciação da tradução a jusante para a isoforma 2, que se alonga a sua 5’UTR.

Chrna4

isoforma 2 não foi publicado até 2012 e não foi funcionalmente analisado antes. Praças, uORFs; setas, SNPs

plasmídeo construção

Firefly luciferase vector pGL4.10 (AY738222.1) e pGL4.74 vector Renilla luciferase (AY738230.1) foram adquiridas da Promega (Mannheim, Alemanha). A sequência TK-Promotor foi cortada pGL4.74 com Kpnl e Xhol (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha), após geração de um sítio de restrição Xho I na posição 783 pb usando Geneart sistema de mutagénese dirigida ao local (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha ). Após Kpnl e Xhol digestão de pGL4.10, a sequência TK-promotor foi ligado no local de clonagem múltipla de pGL4.10 a montante da sequência de codificação de luciferase de pirilampo. As inserções 5’UTR de nAChR subunidades α4 isoforma 1 e 2, e SS3 α5 foram sintetizados (MWG Eurofins, Ebersberg, Alemanha) e clonado no pGL4.10 com XhoI e NcoI (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) directamente entre a TK-promotora e a sequência de codificação de luciferase de pirilampo. Após a clonagem das inserções foram confirmadas por sequenciação. Para criar as construções falta um certo uORF, o ATG do uORF foi mutado para TTG. Da mesma forma, os alelos SNP dentro uORFs foram trocados por mutagénese dirigida ao local. Para

Chrna4

isoforma 1 (NM_000744.6), abrigando um putativo uORF, duas construções foram criadas: uma com o mRNA do tipo selvagem (

Chrna4

-iso1-1) e um com o uORF mutado codão de início (

Chrna4

-iso1-2). Para um teste subsequente (ver resultados), mais duas construções foram criadas: uma em que o códon de parada do uORF foi mutado (TAG a TAC), mas o vaga-lume começar códon ficou intacta (

Chrna4

-iso1- 3), e uma falta tanto o codão de paragem da uORF e o codão de pirilampo iniciação (ATG TTG a) (

CHRNA4-

iso1-4).

para

Chrna4

isoforma 2 (NM_001256573.1), possuindo cinco uORFs putativos, seis construções foram criadas: uma com o mRNA do tipo selvagem (

Chrna4

-iso2-uORF1-5) e cinco construções em que cada um dos cinco uORFs foi desligado, numerado em consequência, começando com o uORF mais 5 ‘localizada (

Chrna4

-iso2-uORF1;

Chrna4

-iso2-uORF2;

Chrna4

-iso2 -uORF3;

Chrna4

-iso2-uORF4;.

Chrna4

-iso2-uORF5)

Para

CHRNA5

(NM_000745.3), abrigando um putativo uORF contendo um SNP, quatro construções foram criados: um com a guanina alelo e intacto /desligado uORF (

CHRNA5

-1;

CHRNA5

-2) e um com a adenina alelo e intacto /desligado uORF (

CHRNA5

-3;

CHRNA5

-4). Para um teste subsequente (ver resultados), mais duas construções foram criadas: uma em que o códon de parada do uORF foi mutado (TAG a TAC), mas o vaga-lume começar códon ficou intacta (

CHRNA5

-5) e uma falta tanto o códon de parada do uORF eo códon de vaga-lume começar (ATG para TTG) (

CHRNA

56).

para

CHRNB3

(NM_000749.3 ), que alberga uma uORF putativo e um SNP com a maior adenina alelo criação de um codão de iniciação uORF, foram usadas três construções: um com intacta uORF codão de iniciação gerado pela adenina alelo SNP (

CHRNB3

-1); um com o menor SNP guanina alelo exclusão do primeiro codão de iniciação uORF (

CHRNB3

-2) conduzindo assim a uma uORF truncado e uma terceira construção com o alelo SNP guanina na qual o codão de iniciação da uORF truncada é comutada off (

CHRNB3

-3). Uma visão geral das construções utilizadas nas nossas experiências é mostrado no Quadro 1.

cultura celular

As células de rim embrionário humano (HEK) 293 foram adquiridos num serviço de linhas celulares (CLS, Eppelheim, Alemanha). A cultura das células foi realizada em frascos T75 em monocamada com DMEM (Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemanha) contendo 4,5 g de glucose, 10% FBS, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2.

células HEK 293 foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter pGl4.10 + TK contendo o 5 ‘UTR de α4 isoforma 1 e 2, e SS3 α5, respectivamente, e o plasmídeo de controlo pGL4.74 numa proporção 20:01 usando o transporte ®-LT1 Transfection Reagent (MoBiTec, Gottingen, Alemanha) com 24 h antes da transfecção e ensaio da luciferase qPCR, respectivamente .

luciferase Assay

células

HEK293 foram semeadas 24 h antes da transfecção com 3 × 10

5 as células em placas de 24 poços (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha). As actividades de luciferase de pirilampo e Renilla foram medidos com a Tristar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha), mediante a Glow®-duplo sistema de ensaio de luciferase (Promega, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. A proporção de actividade de luciferase de Renilla luciferase e do pirilampo foi determinada e normalizada para pGL4.10 TK +. As várias construções 5’UTR são expressos como alteração de dobragem para pGL4.10 TK +.

Todas as experiências foram repetidas independentemente três vezes com amostras em triplicado. Um t-teste bilateral foi utilizado para comparar os valores das amostras de ensaio e as amostras de controlo. A

valor p

de

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os dados são expressos como alteração de dobragem e como média ± SEM.

qPCR

quantitativa PCR em tempo real foi realizado ensaio de luciferase se mostrou resultados significativos. A co-transfecção com as várias construções foi realizada como descrito acima. O ARN foi extraído utilizando um kit Qiagen RNAeasy, incluindo o tratamento de DNase de 10 min, de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). a síntese do ADNc da primeira cadeia foi realizada utilizando 1 ug de ARN total de cada transfecção como material de partida (kit de síntese de ADNc iScript ™, de Bio-Rad, Munique, Alemanha). PCR em tempo real foi realizado tendo como alvo luciferase de pirilampo (alvo) e luciferase de Renilla (controlo) sequência de codificação utilizando os seguintes iniciadores de pirilampo-FWD TGCAACACCCCAACATCTTC 5′-3 ‘e 5′-Rev pirilampo CCTTTAGGCACCTCGTCCAC-3’; Renilla-fwd 5’AATGGCTCATATCGCCTCCT-3 ‘e Renilla-rev 5′-CACGACACTCTCAGCATGGA-3’. eficiência de amplificação e linearidade de teste (coeficiente de correlação R

2) foram avaliados para cada par de iniciadores (Fig. S1). As reacções foram realizadas em volumes de 20 ul contendo 10 ul SsoFast

TM EvaGreen

® Supermix (Bio-Rad, Munique, Alemanha), 125 nM de cada iniciador, 7 ul de água de qualidade para biologia molecular e 1 ul de cada molde após a síntese de ADNc. ciclos térmicos consistiu de uma desnaturação (98 ° C durante 5 s), emparelhamento e extensão (60 ° C durante Renilla; 62 ° C durante pirilampo por 5 s), realizada em 50 passos do ciclo no reciclador Mini Opticon CFD-3120 (Bio Rad, Munique, Alemanha). Derreter análise da curva variou de 65 ° C a 95 ° C com intervalos de 0,5 ° C. Todas as experiências foram repetidas três vezes, independentemente, com amostras em triplicado técnicas. Um t-teste bilateral foi utilizado para comparar os valores das amostras-alvo e as amostras de controlo. A

p

valor de

p

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

CHRNA3

e

CHRNA7

In silico

análise mostrou que nem o 5’UTR de

CHRNA3

isoforma 1 (NM_000743.4) e isoforma 2 (NM_ 001.166.694,1), nem de

CHRNA7

isoforma 1 (NM_000746.5) e isoforma 2 (NM_001190455.2) conter uORFs putativos (Fig. 1). Portanto, estes dois genes subtipo não foram incluídos no estudo.

Chrna4

isoforma 1 5’UTR abriga um uORF funcional

Dois diferente

Chrna4

existem variantes de ARNm. Isoforma 1 (NM_000744.6) apresenta um comprimento de 231 nt 5’UTR ao passo que a isoforma 2 (NM_001256573.1) é caracterizada por uma 5’UTR mais longo (690 nt), devido a diferenças de codificação da região que resultará numa maior de iniciação da tradução a jusante. No 5’UTR de

Chrna4

isoforma 1 um putativo uORF de 60 comprimento nt pôde ser localizado

in silico

(Fig. 1). O seu codão de iniciação é englobado por uma sequência de consenso de Kozak adequado (por causa da guanina na posição -3). As construções

Chrna4

-iso1-1 e

Chrna4

-iso1-2 foram testados pelo ensaio de luciferase (Tabela 1 e S1). Os resultados revelaram que desligar o uORF significativamente aumentada

Chrna4

expressão da proteína -iso1-1 em 4,8 vezes (

Chrna4

-iso1-1 0,6 ± 0,09;

Chrna4 viajantes – iso1-2 2,9 ± 0,43;

p

= 0,013) (Fig 2A)

a: ensaio de luciferase de

Chrna4

isoforma 1 5’UTR resultou em aumento significativo.. na expressão da proteína quando desligar o uORF. Fold mudança de actividade de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, é ilustrado para as três construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2,

Chrna4

-iso1-1; 3,

Chrna4

-iso1-2. B: O uORF ATG de

Chrna4

-iso1 é capaz de iniciar a tradução, resultando numa proteína de pirilampo alongado. Fold mudança de actividade de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, está ilustrado para os cinco construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGl4.10; 3,

Chrna4

-iso1-2; 4,

Chrna4

-iso1-3; 5,

Chrna4

-iso1-4. C: qPCR relativa para

Chrna4-ISO1

5’UTR não apresentaram diferenças significativas de quantidade mRNA ao comparar intacto com uORF excluído. Fold mudança de ARNm de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, é ilustrado para as três construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2,

Chrna4

-iso1-1; 3,

Chrna4

-iso1-2. D: Nenhum dos cinco uORFs de

Chrna4

-iso2 5’UTR mostrou resultados significativos. Dobre mudança de actividade pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, é ilustrado para os sete construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2,

Chrna4

-iso2-uORF1-5; 3,

Chrna4

-iso2-uORF1; 4,

Chrna4

-iso2-uORF2; 5,

Chrna4

-iso2-uORF3; 6,

Chrna4

-iso2-uORF4; 7,

Chrna4

-iso2-uORF5. As barras de erro representam ± SEM de 3 réplicas biológicas. Os asteriscos indicam diferenças significativas (

p Art 0,05).

Alguns, mas nem todos os uORFs são traduzidos em proteínas. Num próximo passo, portanto, nós examinamos se o códon de iniciação ATG do

CHRNA4-

iso1-1 uORF é capaz de iniciar a tradução de proteínas, o que seria um pré-requisito para a tradução do próprio uORF. Um uORF traduzidas com um codão de paragem mutado, clonados em grelha com a ORF do pirilampo deverá conduzir à síntese de uma proteína de pirilampo alongado. As duas construções

CHRNA4-

iso1-3 e

CHRNA4-

iso1-4 foram comparados com

Chrna4

-iso1-2. O uORF foi definido no quadro com a ORF do pirilampo para todas as construções 3. Os resultados mostraram nenhuma diferença significativa na expressão da proteína muda entre

Chrna4

-iso1-2 e

CHRNA4-

iso1-3 nem entre

Chrna4

-iso1-2 e

CHRNA4-

iso1-4 (

Chrna4

-iso1-2 1,47 ± 0,59;

Chrna4

-iso1-3 0,94 ± 0,25;

p

= 0,542 ;

Chrna4

-iso1-2 1,47 ± 0,59;

Chrna4

-iso1-4 0,83 ± 0,26;

p

= 0,471). Comparação de

Chrna4

-iso1-4 com o vector de controlo pGL4.10 revelou um aumento na expressão da proteína que não atingiu significância (

Chrna4

-iso1-4 0,83 ± 0,26; pGL4.10 0,03 ± 0,01;..

P

= 0,067) (Figura 2B)

para analisar se os resultados do ensaio de luciferase foram devidas a um transcricional ou um efeito de translação, foi realizada verdadeira quantitativa relativa -tempo de PCR (qPCR). Ao comparar a quantidade de mRNA das células transfectadas com as construções

Chrna4

-iso1-1 e

Chrna4

-iso1-2 não foram observadas alterações significativas entre intacta e excluídos uORF (

Chrna4

-iso1-1 1,23 ± 0,29;

Chrna4

-iso1-2 1,05 ± 0,22;..

p

= 0,702) (Fig 2C)

O 5 ‘UTR de

Chrna4

isoforma 2 contém cinco uORFs putativos variando de 18 a 60 nt de comprimento (Fig. 1). A construção com apenas uORFs intacta foi comparado com construções em que cada um dos cinco uORFs foi desligado (Tabela 1) e S1. Os resultados não mostraram diferenças significativas quanto intacta contra uORF desligado. Isto é particularmente verdade para a maior 5 ‘uORF que está presente em ambos

Chrna4

isoformas. Este uORF apareceu para ser funcional na isoforma com a UTR 5 ‘mais curto (ver acima), mas não causou alterações na expressão da proteína quando desligado na isoforma com o mais UTR 5’ (Fig. 2D). (

Chrna4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

Chrna4

-iso2-uORF1 0,13 ± 0,02;

p

= 0,644;

Chrna4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

Chrna4

-iso2-uORF2 0,14 ± 0,03;

p

= 0,607;

Chrna4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

Chrna4

-iso2-uORF3 0,14 ± 0,02;

p

= 0,427;

Chrna4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

Chrna4

-iso2-uORF4 0,15 ± 0,03;

p

= 0,514;

Chrna4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

Chrna4

-iso2-uORF5 0,12 ± 0,02 ;.

p

= 0,926)

Ao comparar as duas isoformas de tipo selvagem

Chrna4

-iso1-1 e

Chrna4

-iso2-uORF1-5, os resultados mostraram que a expressão da proteína da última foi significativamente reduzida (

Chrna4

-iso1-1 0,6 ± 0,09;

Chrna4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

p

= 0,014).

CHRNA5

5’UTR contém um uORF pós-transcricional funcional

CHRNA5

5’UTR (NM_000745. 3) foi encontrado para abrigar uma putativa uORF de 30 nt de comprimento (Fig. 1). Dentro deste uORF a rs56182392 SNP com a guanina ancestral alelo (freqüência do alelo 99,4%) e os alelos raros adenina resulta em uma troca de aminoácido de alanina por treonina, quando traduzido

.

Para analisar o

CHRNA5

uORF e sua SNP no nível de proteína foi testada nossas construções por ensaios de luciferase (Tabela 1) e S1. As construções

CHRNA5

-2 e

CHRNA5

-4 resultou em um aumento de proteína de 50%, respectivamente, 65%, em comparação com

CHRNA5

-1, respectivamente

CHRNA5

-3 (

CHRNA5

-1 0,76 ± 0,03;

CHRNA5

-2 1,15 ± 0,06;

p

= 0,009;

CHRNA5

-3 0,63 ± 0,08;

CHRNA5

-4 1,04 ± 0,03;

p

= 0,006). Por conseguinte, em ambos os casos as construções que não possua o uORF produziram significativamente mais proteína do que as construções correspondentes com uORFs intactas. Ao comparar os dois alelos de rs56182392 (construções

CHRNA5

-1 e

CHRNA5

-3) as mudanças de proteína registrados não foram significativas (Fig. 3A).

‘UTR abriga um uORF funcional;

CHRNB3

uORFs não estão envolvidos no controle de translação. A: ensaio de luciferase de

CHRNA5

5’UTR resultou em aumento significativo na expressão da proteína quando desligar o uORF. Fold mudança de actividade de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, está ilustrado para os cinco construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA5

-1; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-3; 5,

CHRNA5

-4. B: O uORF começar códon de

CHRNA5

não iniciou a tradução de forma tão eficiente como o vaga-lume códon de iniciação. Fold mudança de actividade de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, está ilustrado para os cinco construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGL4.10; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-5; 5,

CHRNA5

-6. C: qPCR relativa para

CHRNA5

5’UTR não apresentaram diferenças significativas de quantidade mRNA ao comparar intacto com uORF excluído. No entanto, diferenças significativas foram avaliados para a transcrição dos dois variantes de alelos de SNP. Fold mudança de ARNm de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, está ilustrado para os cinco construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA5

-1; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-3; 5,

CHRNA5

-4. D: ensaio de luciferase de

CHRNB3

5’UTR não mostraram resultados significativos. Fold mudança de actividade de pirilampo normalizados para pGl4.10 + TK, está ilustrado para os quatro construções diferentes; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNB3

-1; 3,

CHRNB3

-2; 4,

CHRNB3

-3. As barras de erro representam ± SEM de 3 réplicas biológicas. Os asteriscos indicam diferenças significativas (

p Art 0,05).

Mais uma vez, para avaliar se o ATG início do

CHRNA5

uORF é capaz de iniciar proteína tradução, as duas construções

CHRNA5

-5 e

CHRNA5

-6 foram comparados com

CHRNA5

-2. O uORF foi definido no quadro com a ORF do pirilampo para todas as construções 3. Os resultados revelaram que, enquanto o vaga-lume códon de iniciação estava intacta a proteína luciferase foi altamente expresso (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30;

CHRNA5

-5 1,55 ± 0,46;

p

= 0,736). No entanto, a expressão da proteína caíram mais de 90% quando apenas o ATG do uORF estava presente (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30;

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01;

p

= 0,029). Comparação de

CHRNA5

-6 com a pGL4.10 controle de vetores não apresentaram diferenças significativas (

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01; pGL4.10 0,03 ± 0,01;

p

= 0,069) (Fig. 3B).

em seguida, executados relativamente qPCR para descartar um efeito sobre o nível de RNA como uma causa para os nossos resultados. Ao comparar a quantidade de mRNA das células transfectadas com as respectivas construções (

CHRNA5

-1;

CHRNA5

-2;

CHRNA5

-3;

CHRNA5

-4) pela relativa qPCR foram observadas alterações não significativas entre intacta e excluídos uORF (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01;

CHRNA5

-2 0,97 ± 0,01;

p

= 0,369;

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01;

CHRNA5

-4 1,10 ± 0,05;

p

= 0,459) (Fig 3C).. Assim, o uORF quantitativamente não altera o nível de ARNm. Construir

CHRNA5

-3 contendo o raro alelo A rs56182392 rendeu transcrições significativamente mais firefly luciferase do que

CHRNA5

-1 (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01;

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01;

p

= 0,011). No entanto, não houve diferenças significativas entre os dois alelos foram observados no nível de proteína e, portanto, é improvável que rs56182392 tem um impacto importante no

CHRNA5

função.

CHRNB3

uORF faz não influenciar a expressão da proteína

O 5’UTR desta subunidade (NM_000749.3) contém um único uORF putativo. Ele abriga um SNP (rs4950 adenina /guanina) com a guanina alelo menor exclusão do primeiro codão ATG de início da uORF putativo, criando uma truncada, uORF putativo (Fig. 1). As três construções (

CHRNB3

-1;

CHRNB3

-2;

CHRNB3

-3) foram comparados entre si por ensaio luciferase (Tabela 1 e S1). Não foram observadas diferenças significativas entre as três variantes diferentes (

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17;

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02;

p

= 0,495;

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17;

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19;

p

= 0,778;

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02;

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19;

p

= 0,726). Assim, nossos resultados indicam que nem o uORF mais nem a versão uORF truncado desempenhar um papel na regulação da tradução de proteínas (Fig. 3D).

Discussão

Os dados aqui apresentados sugerem fortemente que uORFs dentro da 5’UTR de

Chrna4

-iso1 e

CHRNA5 Quais são importantes reguladores da tradução da proteína. Além disso, eles indicam que os dois conhecido

Chrna4

isoformas diferem no que diz respeito ao seu efeito sobre o nível de expressão do gene. A influência de

Chrna4

-UTR na expressão do gene foi também previamente relatada por Briggs et ai. Eles expressaram ferret

Chrna4

e

CHRNB2

juntamente com /ou sem suas UTRs correspondentes em oócitos. Curiosamente, exclusivamente a alta sensibilidade e nenhum tipo receptor de baixa sensibilidade foi detectado quando a UTR estava presente. No entanto, os elementos reguladores putativos UTR não foram analisados ​​em detalhe neste estudo [23].

Em comparação com a isoforma mais curta, a presença da 5’UTR longo de

Chrna4

significativamente reduzida expressão de luciferase . Nenhum dos cinco uORFs presentes neste isoforma mostrou qualquer efeito na expressão do gene quando batido para fora individualmente. Isso torna improvável que eles são responsáveis ​​por níveis reduzidos de expressão de genes associados com o mais

Chrna4

isoforma. Não se pode excluir totalmente a possibilidade de que uma pancada simultânea de todos os cinco uORFs teria tido um efeito sobre a expressão do gene, contudo, a presença de outros motivos de sequências reguladoras de repressão ou de ARN dobrar eventos que ou desestabilizam o ARNm ou retardar a tradução parecem ser pelo menos como possíveis explicações.

Curiosamente, o uORF encontrado para ser funcional na

Chrna4

isoforma com a UTR 5 ‘mais curta também está presente no longo 5’UTR-isoforma mas não faz parecem reduzir a expressão do gene no último contexto sequência. Para nosso conhecimento, este apresenta o primeiro exemplo de um uORF com relevância funcional específico da isoforma. As razões por trás dessa observação são até agora desconhecido. As nossas experiências sugerem que o alongamento do ATG da isoforma curta é capaz de iniciar a tradução do uORF. No entanto, este efeito foi bastante pequena e os resultados não foram significativos. Portanto tradução da proteína uORF pode contribuir, mas é improvável que seja a principal causa para essa observação. É também possível que a sequência de consenso de Kozak adequado [24] compreendendo o codão de iniciação uORF permite o reconhecimento do ribossoma suficiente. Paragem do ribossoma tem, portanto, a ser considerado como um mecanismo alternativo para os efeitos observados ao nível da proteína. Ela só pode ser especulado que o mesmo uORF parecia ser não funcional quando analisado no longo 5’UTR-

Chrna4

isoforma. Uma possível razão poderia ser a presença de motivos regulamentares adicionais, até agora desconhecido que só existem no longo 5’UTR-

Chrna4

5’UTR e são capazes de inibir a função uORF. Já foi demonstrado que o papel regulador de, pelo menos, alguns uORFs pode estar estreitamente ligada a outros motivos de sequências UTR 5 ‘[25]. No entanto, o uORF descrita neste relatório anterior foi apenas funcional se motivos regulamentares adicionais estavam presentes. O

Chrna4

uORF discutido aqui exigiria o mecanismo oposto, ou seja, uma repressão pela sequência motifs desconhecido.

No que respeita à única uORF de

CHRNA5

, nossos experimentos mostraram nenhuma indicação clara uORF que o codão de iniciação é capaz de iniciar a tradução do gene do pirilampo clonado a jusante do mesmo. A explicação mais provável para esta observação seria a baixa força sequência de Kozak em torno do uORF-ATG. Este motivo de sequência fraca é susceptível de reduzir a probabilidade de que ribossomos reconhecer o uORF-ATG e iniciar a tradução neste site. No entanto, o fato de que não foram capazes de observar uma diferença significativa nos níveis de expressão entre o vector de controlo e uma construção em que o uORF começar códon serviu como local de iniciação da tradução só funcionamento (

CHRNA5

-6) faz não implicam necessariamente que a tradução do uORF está completamente excluída como possível mecanismo. No entanto, dado o efeito impressionante na expressão da proteína do uORF mostrou, na presença do seu próprio codão de paragem intacto, é pouco provável que este efeito forte resultou exclusivamente a partir de um fraco de tradução da proteína uORF. Isto sugere que, ao contrário do

Chrna4

uORF descrito acima, o

CHRNA5

uORF não faz parte do grupo de uORFs dependentes da sequência que permitam atingir os seus efeitos através da codificação de pequenas proteínas que desempenham papéis ativos no mecanismos de controlo da tradução. Assim, outros mecanismos têm de ser tidos em consideração, incluindo bloqueamento dos ribossomos no uORF ou exame permeável. O mecanismo de adiamento ocorre quando ribossomos parar de se mover durante uORF tradução [26]. No entanto, um códon de início que é incapaz de alcançar tradução suficiente também é improvável que cause ribossomo significativa parando. exame permeável parece ser uma explicação mais plausível para os efeitos observados. Este mecanismo particularmente ocorre se o codão de iniciação da uORF é englobado por um codão de início de sequência contexto pobre como presente na uORF de

CHRNA5

. Como resultado, alguns ribossomas reconhecer o codão de iniciação da uORF e iniciar, outros ignorar-lo e iniciar a próxima codão de iniciação.