Abstract

Fundo

Cysteamine, um aminotiol anti-oxidante, é a tratamento de escolha para a cistinose nefropatas, uma doença de depósito lisossômico rara. A cisteamina é um agente de quimio-sensibilização e radioprotecção e os seus efeitos anti-tumorais foram investigadas em várias linhas de células de tumor e química induzida carcinogénese. Aqui, nós investigamos se cisteamina tem efeitos anti-tumorais e anti-metastáticos no câncer pancreático humano transplantáveis, uma doença metastática agressiva.

Metodologia /Principais Achados

efeitos anti-invasão de cisteamina foram estudados por invasão de matrigel e migração celular ensaios em 10 linhas celulares de cancro do pâncreas. Para estudar mecanismo de acção, examinámos a viabilidade celular e a actividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) nas células tratadas com cisteamina. Também examinamos efeito anti-metástase de cisteamina em dois modelos de murino ortotópico de câncer pancreático humano medindo metástase peritoneal e sobrevivência dos animais. A cisteamina inibida tanto a migração e a invasão de todas as dez linhas celulares de cancro pancreático em concentrações ( 25 mM) que causou nenhuma toxicidade para as células. Ele diminuiu significativamente a actividade MMPs (

IC

50 38-460 mM) e da actividade gelatinase zymographic de uma forma dependente da dose

in vitro

e

in vivo

; enquanto de ARNm e de proteína dos níveis de MMP-9, MMP-12 e MMP-14 foram ligeiramente aumentada utilizando a maior concentração de cisteamina.

In vivo

, cisteamina diminuiu significativamente a metástase em dois modelos de tumor pancreático estabelecidos, embora não afetou o tamanho dos tumores primários. Além disso, cisteamina sobrevivência prolongada de ratinhos de um modo dependente da dose, sem causar qualquer toxicidade. Similar aos

in vitro

resultados, a atividade MMP foi significativamente diminuída em tumores de animais tratados com cisteamina. Cysteamine não teve efeitos adversos clínicos ou pré-clínicos no hospedeiro, mesmo na dose mais elevada.

Conclusões /Significado

Os nossos resultados sugerem que a cisteamina, um agente com um perfil de segurança comprovada, pode ser útil para inibição de metástase e prolongar a sobrevivência de um host com câncer pancreático

Citation:. Fujisawa T, Rubin B, Suzuki a, Patel PS, Gahl WA, Joshi BH, et al. (2012) Cysteamine Suprime invasão, metástase e prolonga a sobrevivência por inibição das metaloproteinases da matriz em um mouse modelo de cancro do pâncreas humano. PLoS ONE 7 (4): e34437. doi: 10.1371 /journal.pone.0034437

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 02 de junho de 2011; Aceito: 02 de março de 2012; Publicado: 20 Abril 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Competir interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes .

Introdução

Cysteamine é um aminotiol simples e anti-oxidante que tem potencial para o tratamento de doenças provocadas pela radiação, distúrbios neurológicos e câncer. Cysteamine também é aprovado pela Food and Drug Administration para o tratamento de pacientes com cistinose, uma doença autossômica recessiva caracterizada pela acumulação de cistina nos lisossomos [1], [2]. A farmacocinética e os efeitos adversos da cisteamina foram muito bem estudados [3] – [5]. No campo do câncer, muitos estudos têm relatado efeitos anti-câncer de cisteamina com respeito ao desenvolvimento e proliferação do câncer. A cisteamina impedida não só o desenvolvimento de metaplasia mas também carcinogénese tumorais e cancros gástricos mamários induzidos quimicamente e por radiação [6] – [8]. Cysteamine por si só ou conjugada com nanopartículas ou outros compostos suprimem a proliferação de células cancerígenas derivadas de tumores neoplásicos neurais [9], SMMC-7721 de carcinoma hepatocelular [10], o cancro da mama [11], e melanoma linhas celulares [12]

in vitro

. Estes derivados parecem inibir o crescimento de células cancerosas, sinergizar o efeito de outras drogas anti-cancerosas, induzem a apoptose ou exercem efeitos citotóxicos sobre a replicação do ADN. A cisteamina é também encontrada para exercer um efeito bifásico sobre o autofagia por indução da formação de autofagossomas em pontos de tempo iniciais, mas a degradação autophagic em pontos de tempo posteriores [13]. A cisteamina é conhecido por inibir a neoplasia intestinal induzida por irradiação-X [6] e carcinogénese gástrica induzida por N-metil-N’-nitrosoguanidina em ratos [9], [14]. No entanto, não há relato na literatura abordando os efeitos anti-invasivas ou anti-metastáticos de cisteamina em cancros humanos.

A. Para o ensaio de invasão em matrigel, as células foram incubadas com concentrações crescentes de cisteamina na câmara de Matrigel durante 24 horas. O número de células invadidas no lado oposto da membrana foi contado. B e C. cicatrização de feridas ensaio. As células foram cultivadas até à confluência e riscado usando uma ponta amarela esterilizado. Eles foram incubadas durante 24 horas com 0-5 mM de cisteamina e a área da ferida entre as camadas celular foi medida. As linhas horizontais preta na figura (veículo) descrevem a área no tempo 0 ferida quando foi feita e indicar a área do ferimento, quando as células foram riscados (B). D. Para o ensaio de viabilidade de células, as células cancerígenas pancreáticas foram incubadas com várias concentrações de cisteamina e o número de células vivas foi contado após 24 e 48 horas. Os dados são expressos como a média ± S.D. de determinações em triplicado. significâncias estatísticas são mostradas por †: P 0,01 e ‡:. P 0,001

O câncer de pâncreas é caracterizada por invasão local de estruturas adjacentes e metástases para linfonodos e fígado nos estágios iniciais. No momento do diagnóstico, a maioria dos cancros pancreáticos são já metastático, fazendo com que o tumor não operável [15], [16]. Portanto, os esforços devem centrar-se não só visando o tumor primário, mas também controlar metástases com sucesso para tratar o câncer de pâncreas.

As metaloproteinases de matriz (MMP) são um grupo de endopeptidases dependentes de zinco implicados na angiogênese de mamíferos, cicatrização de feridas, e remodelação do tecido [17]. No cancro, as MMPs têm um papel importante na invasão celular e metástase, controlando a degradação da matriz extracelular [18]. Em particular, de MMP-9 desempenha um papel central na invasão do cancro do pâncreas, e diminui a sua inibição de metástases do fígado de cancro pancreático [15], [19]. Por isso, muitos inibidores de MMP de largo para estreitar especificidade têm sido investigados por seus efeitos anti-câncer. Alguns inibidores de MMP suprimir com sucesso o crescimento de tumores e metástases em modelos animais [20] – [22], mas eles não conseguem mostrar efeitos anti-câncer em ensaios clínicos. Uma das razões é os seus efeitos adversos graves, particularmente aqueles que envolvem dor articular e muscular [23], [24]. Portanto, é importante para identificar inibidores de MMP com poucos efeitos colaterais ou nenhuns.

. Para medir a actividade total de MMPs em linhas celulares de cancro do pâncreas, células foram incubadas com 0-5 mM de cisteamina durante 24 horas, extraiu-se a proteína total e a actividade medida usando substrato fluorogénico. O efeito de cisteamina em MMP-9 no nível de proteína por ELISA (B), MMP-9, MMP-12 e os níveis de MMP-14 de ARNm (C) e as actividades de gelatinase zymographic (D) foi determinada após a incubação de células de cancro pancreático com cisteamina para 24 horas. MMP-9 A actividade foi determinada por ELISA e ARNm por qRT-PCR. β-actina foi utilizada para um gene de referência em qRT-PCR. Os dados representam a MMP-9 em proteína de lisado de células totais pg /ug e razão percentual de mRNA de RFU /β -actina. Os dados são expressos como a média ± S.D. de determinações em triplicado e as experiências foram repetidas três vezes. significâncias estatísticas são mostradas por *: P 0,05, †: p 0,01 e ‡:. P 0,001

IC

50 de MMPs foi determinada por incubação de cada enzima MMP com várias concentrações de cisteamina e batimastat em um ensaio fluorimétrico como descrito em materiais e métodos.

IC

50 é a concentração de inibidor em que 50% de inibição da proteólise ocorre.

No presente estudo, nós examinamos os efeitos anti-invasivos de cisteamina, que tem um excelente perfil de segurança, em linhas celulares de cancro do pâncreas

in vitro

. Investigou-se também o efeito anti-metastastic- de cisteamina em modelos animais de cancro pancreático humano, a determinação se especificamente que pode diminuir a metástase de cancros em modelos ortotópicos de cancro do pâncreas em ratos imunodeficientes. Finalmente, a segurança de cisteamina subcutânea foi avaliada em ratos portadores de tumores.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

linhas celulares de cancro pancreático (Hs766T, MIA-PaCa2 , Panc-1, ASPC-1, 1-PK, Mpanc96, BxPC-3, KLM, HPAF-II e SW1990) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). cloridrato de cisteamina foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e dissolvido em água destilada.

A migração celular Ensaio

ensaio de migração celular é um ensaio de cicatrização da ferida clássica [25]. Para este ensaio, as células foram cultivadas em placas de petri de 10 cm até que eles estivessem completamente confluentes. As monocamadas de células foram raspadas com uma ponta de micropipeta amarelo estéril e lavados três vezes com PBS; As células foram então cultivadas em meio contendo 0-5 mM de cisteamina durante 24 horas. Cinco campos aleatórios foram seleccionados e as fotografias foram tiradas utilizando um microscópio invertido. A área média (mm

2) da diferença entre as camadas de células foi calculado usando software de imagem IPlab (BD Biosciences-BioImaging, Rockville, MD).

Células

Hs766T e MIA-PaCa2 (2 × 10

6) foram implantados diretamente no pâncreas de nus

nu /nu

camundongos fêmeas de 5-6 semanas de idade e, em seguida cavidade peritoneal e pele foram fechados com grampos. Doses crescentes de cisteamina foram injectados s.c. tal como descrito em materiais e métodos. Os tumores primários e lesões metastáticas de ≥ 5 mm foram contados em ratos de veículos e cisteamina tratada.

a

: P 0,05,

b

: P 0,01 e

c

: P 0,05,

d:

P 0,001. +: Ascite moderada, ++: ascite grave, -:. Sem ascite

Hs766T e células MIA-PaCa2 (2 × 10

6) foram implantados diretamente no pâncreas de 5-6 semanas de idade nu feminino

nu /nu

ratos e usando clipes seguida cavidade peritoneal e pele foram fechados. A partir do dia 4 após a implantação do tumor, os ratinhos foram tratados duas vezes por dia com o veículo ou 25, 100, 250 mg /kg /dia de cisteamina até ao final da experiência. Os ratinhos com tumores foram sacrificados 4 semanas após a implantação da célula. A. Um rato representante de cada grupo de tratamento de tumores MIA abrigando-PaCa2 é mostrado. Setas amarelas indicam tumores primários no pâncreas e triângulos azuis indicam lesões metastáticas. Noutra experiência, o controlo e ratinhos de cisteamina tratados foram seguidos para sobrevivência. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratos portadores Hs766T (B) e MIA-PaCa2 (C) tumores.

Matrigel ensaio de invasão

invasão celular foi ensaiada em câmaras de invasão BD BioCoat Matrigel ( BD Biosciences; 24 poços, 8 um de tamanho de poro), conforme descrito anteriormente [26]. Resumidamente, as células foram incubadas com diferentes concentrações de cisteamina (0-5 mM) durante 24 horas. As células não invadidos foram removidos a partir da superfície superior da membrana com um esfregaço de algodão, e as células na superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas com H E. Três campos aleatórios por câmara foram contados. Os dados foram apresentados como média ± S.D. de determinações em triplicado.

ratinhos com tumores Hs766T foram tratados com doses crescentes de cisteamina e pesos corporais foram medidos no dia 10 e dia 25 após a implantação do tumor. Não houve diferença significativa entre os grupos de tratamento.

Tumor rolamento camundongos foram tratados com doses crescentes de cisteamina e soro foi coletado de veias da cauda duas vezes, ou seja, o tratamento pré-cisteamina (dia 4) e pós tratamento (dia 18). Fígado, músculo e da função renal biomarcadores foram avaliados após tratamento cisteamina. A alanina aminotransferase (ALT), creatina-quinase (CK), aldolase, e creatinina (Cr) foram medidos em cada grupo. Não houve diferenças significativas entre os grupos de tratamento.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular das linhas celulares de cancro do pâncreas foi medida pela contagem do número de células viáveis. Resumidamente, 3 × 10

5 células foram semeadas por poço numa placa de 6 poços com 2,0 mililitro de meio completo e incubadas durante a noite para o chapeamento. As células foram tratadas com diferentes concentrações de cisteamina durante 24-48 horas. Após a incubação, as células foram descoladas com tripsina, lavadas e coradas com 0,4% de azul de tripano. O número de células foi contado manualmente, utilizando um hemocitómetro e apresentados como número de células viáveis ​​por mililitro.

. No dia 30 após o implante ortotópico de células de cancro do pâncreas, tumores foram colhidos, proteína total extraído e actividade de MMP determinada utilizando substrato fluorogénico MMP. B. níveis de MMP-9 de ARNm foram determinados no ARN total extraído de tumores por qRT-PCR. β-actina foi utilizada para um gene de referência. C. nível de proteína de MMP-9 foi determinada por ELISA. D. Ensaio Zymographic foi realizada em tumores tratados cisteamina. Os dados são expressos como a média ± S.D. de triplicado para quadruplicar determinações. Experiência foi repetida duas vezes. significância estatística são mostrados por *: P 0,05, †: p 0,01 e ‡:. P 0,001

Medição da actividade de MMP

atividade de MMPs foi medida por MCA-KPLGL -Dpa-AR-NH2 Péptido Fluorogenic Substrate (R D systems, Emeryville, CA). proteína celular total a partir de cada linha celular de cancro pancreático foram obtidos utilizando tampão de lise (contendo Tris-HCl 50, 10 mM de CaCl

2, 0,05% de Brij35 e 0,25% de Triton-X) sem um inibidor de MMP. Substrato e 10 ^ g de proteína celular total no tampão foram misturadas numa parede preta-placa de 96 poços. Após 1 hora de incubação, unidades de fluorescência foram determinados utilizando excitação /emissão = 320/405 nm.

gel Substrato ensaio zymographic para a atividade MMP

gel Gelatina zimografia foi realizada em lisados ​​celulares de HS7666 e MIA -PaCa2 linha celular de cancro pancreático com ou sem adição de cultura com a concentração diferente de cisteamina, essencialmente como descrito por D’Angelo et al [27]. Resumidamente, 50 ug de proteína total foram submetidos a electroforese em 10% SDS-PAGE contendo 0,1% de gelatina como substrato. Após a lavagem com 1% de Triton X-100 em Tris 50 mM /HCl, pH 7,5 durante 1 hora para remover o SDS, os géis foram incubados durante a noite a 37

° C em Tris /HCl a 50, pH 7,5, contendo 150 mM de de NaCl, 10 mM de CaCl2 e 0,1% de Triton X-100, antes da coloração com mancha azul simplesmente segura. Os géis foram lavados com água desionizada à temperatura ambiente. enzimas de degradação de gelatina foram identificados pela sua capacidade para digerir gelatina como demonstrado por zonas claras de gelatina digerida. intensidades de bandas relevantes foram quantificados por varrimento densitométrico análise e normalizado ao número de células.

quantitativa de transcrição reversa-PCR

reversa quantitativa PCR de transcrição-(qRT-PCR) foi realizada como descrito anteriormente utilizando SYBR QuantiTect verde PCR Kits (QIAGEN, Valencia, CA) [28]. iniciadores específicos de gene para MMP-9 humana, a MMP-12, MMP-14 e β-actina ou foram adquiridos de Qiagen ou sintetizado na instalação núcleo CBER. a expressão do gene foi normalizada para p-actina antes foi determinada a mudança vezes na expressão do gene.

ligado a enzima ensaio imunoenzimático (ELISA)

O nível de proteína MMP-9 foi determinada utilizando Human MMP total de kit -9 DuoSet (R D systems, Emeryville, CA) seguindo as instruções do fabricante. Dez microgramas de proteína total foi aliquotado em cada poço e a concentração de MMP-9 foi determinada pelo método colorimétrico.

IC

50 de cisteamina contra a actividade MMPs

IC

50 de cisteamina e batimastat foi determinada usando um kit de perfil inibidor MMP fluorimétrico (Enzo Life Science, Farmingdale, NY), seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, cada uma das enzimas MMP foi misturada com várias concentrações de cisteamina e batimastat em uma placa de parede preta-96 e incubada durante 30 minutos. Após a administração de substrato fluorogénico, uma velocidade de aumento fluorescente foi medido utilizando excitação /emissão = 320/405 nm.

Medição de metástase, sobrevivência e peso corporal de animais implantados com câncer pancreático ortotópico no rato modelo

fêmea nu

nu /nu

ratos idades entre 5 e 6 semanas foram mantidas em uma instalação de barreira na cremalheira HEPA-filtrado. Todos os estudos com animais foram realizados sob protocolo aprovado # 2000-06 pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use CBER de acordo com os princípios e procedimentos estabelecidos no

o NIH Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório

. Para a injecção de células tumorais ortotópico, o pâncreas foi cuidadosamente exposto, e de 2,0 × 10

6 de células MIA Hs766T-PaCa2 e foram injectados no órgão. O pâncreas foi em seguida, devolvido para a cavidade peritoneal, e a parede abdominal e a pele foram fechadas com agrafos para pele [29], [30]. A partir do dia 4 após a implantação do tumor, doses crescentes de cisteamina (0, 25, 100, ou 250 mg /kg /dia) foram injectados subcutaneamente duas vezes por dia até ao fim da experiência. No dia 30, os ratinhos foram sacrificados e o número de nódulos metastáticos visíveis a olho nu e cujos tamanhos eram 5 mm de diâmetro contadas. O peso total do tumor primário e nódulos metastáticos também foram medidos. Fotos foram tiradas imediatamente após o sacrifício dos animais. Além disso, o tempo de sobrevivência do mouse foi monitorada por uma experiência independente. Os ratinhos foram sacrificados quando eles tinham ascite ou caquexia. Ratos em ambos os modelos de tumores foram pesados ​​no dia 10 e no dia 25 após o tratamento Cysteamine.

Medição de enzimas no soro de ratinho

sangue

Mouse foi recolhido da veia da cauda. Os níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT), creatina quinase (CK), aldolase e creatinina (Cr) foram medidos usando diferentes kits obtidos a partir de Pointe Scientific, Inc. (Canton, MI) e Caldon Biotech, Inc. (Vista, Ca), seguindo as instruções do fabricante.

actividade MMP e MMP-9 expressão em tumores primários

Quando os ratos foram sacrificados no dia 30, os tumores primários foram recolhidos. Para a extracção da proteína total, o tumor foi embebido com tampão de lise e homogeneizou-se utilizando TissueRuptor (Qiagen); o sobrenadante foi recolhido. O RNA total foi extraído usando o kit de FastRNA Pro verde (MP Biomedicals, Solon, OH) seguindo as instruções do fabricante. actividade de MMP, gelatina hidrolisar a actividade das MMP e os níveis de mRNA e proteína de MMP-9 foi determinada como acima mencionado.

A análise estatística

Os dados para a actividade enzimática, ELISA, e qRT-PCR eram comparação entre cada grupo de variância. As curvas de sobrevida foram gerados pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank.

Resultados

Cysteamine inibe a migração de células de câncer pancreático e invasão sem ser citotóxico para as células

o primeiro examinado o efeito de cisteamina na invasão de células de cancro pancreático utilizando o ensaio de invasão de Matrigel. Para este ensaio, utilizou-se 10 linhas celulares de cancro pancreático diferentes numa câmara de invasão de Matrigel. Como mostrado na Fig. 1A e Figura S1, cisteamina inibiu a invasão de células de um modo dependente da concentração. Mesmo a concentração mais baixa de cisteamina (0,05 mM) inibiu significativamente a invasão de células em todas as linhas de células do cancro do pâncreas.

próxima examinou o efeito de cisteamina na migração das mesmas 10 linhas celulares de cancro pancreático no ensaio de invasão. Para o ensaio de migração, foi utilizado um ensaio de cicatrização da ferida. As imagens representativas de cicatrização de feridas celular em células Hs766T são mostradas na Figura 1B. A migração celular foi significativamente inibida a e acima de 0,05 mM de cisteamina em todas as linhas 10 celulares (Figura 1C e Figura S2). As linhas horizontais pretas na figura 1B (veículo) retratam a área no momento 0, quando ferida foi feita. Desde cisteamina mediada efeitos semelhantes em todas as 10 linhas de células nestes ensaios, escolhemos duas linhas celulares aleatórios para todos os outros ensaios.

Também examinamos a citotoxicidade de cisteamina contra duas linhas celulares de cancro do pâncreas (Hs766T e MIA-PaCa2 ). Número de células viáveis ​​após o tratamento com 24 e 48 horas foram contadas cisteamina. A cisteamina mostrou toxicidade celular em 12,5 mM de concentração em ambas as linhas celulares testadas, mas não foi observada nenhuma evidência de toxicidade a concentrações mais baixas como número de células viáveis ​​foram semelhantes com células não tratadas (Figura 1D). Estes resultados sugerem que tanto a migração celular e invasão foram inibidos a uma concentração não citotóxica de cisteamina.

A cisteamina inibe a actividade enzimática da MMP em linhas celulares de cancro pancreático

Para investigar o mecanismo de inibição da migração celular e invasão por cisteamina, examinámos o efeito de cisteamina na actividade enzimática da MMP. A cisteamina inibiu a actividade de MMP em duas linhas celulares de cancro pancreático testadas representativos de uma forma (Figura 2A), dependente da concentração. O

IC

50 {a concentração de cisteamina em que 50% a actividade da enzima MMP (proteólise) é inibida} foi calculada por ELISA (Figura 3). Cysteamine inibiu diretamente cada atividade enzimática MMP, com um

IC

50 de 38-460 mM. Uma vez que a MMP-9 desempenha um papel central na invasão do cancro do pâncreas, examinámos os seus níveis de ARNm e de proteína em ambas as linhas celulares. Em contraste com a actividade enzimática, os níveis de ARNm de MMP-9 e proteínas foram modestamente aumentada na concentração mais elevada de cisteamina (5 mM) (Figura 2B e 2C). Observou-se também que os ARNm para duas outras MMPs (MMP-12 e MMP-14) mostraram um aumento modesto semelhante a MMP-9 em resposta à cisteamina de tratamento (Fig. 2C). Em contraste, gelatina zymographic resultados da actividade de hidrólise para a MMP-9 diferiu significativamente da expressão de ARNm e tanto pró activas e MMP-9 actividades diminuíram significativamente de um modo dependente da dose (Figura 2D).

A cisteamina diminui a metástase e prolonga a sobrevivência de ratinhos imunodeficientes implantados ortotopicamente com cancro pancreático humano

investigou-se o efeito anti-metástases de cisteamina em dois modelos ortotópicos de ratinho utilizando linhas de células de cancro pancreático humano. Os ratinhos foram tratados duas vezes por dia por via subcutânea com cisteamina a partir do dia 4 após a implantação do tumor até ao final da experiência. No dia 30, o número e peso dos nódulos tumorais metastáticas e primárias foram medidos (Figura 4). Em ambos os modelos de tumor, o tamanho eo peso dos tumores primários não mostraram qualquer diferença entre controle e grupos tratados. No entanto, cisteamina diminuiu significativamente o número de nódulos metastáticos de uma forma dependente da dose. Na dose mais elevada (250 mg /kg /dia), cisteamina diminuiu significativamente o número de metástases de tumor Hs766T por ~ 90% (34-3,6). O peso total de nódulos metastáticos de tumores MIA-PaCa2 também foi reduzida em -90% na dose mais elevada. Além disso, dois dos cinco ratinhos no modelo de tumor Hs766T e 4 de 5 ratinhos em modelo de tumor MIA-PaCa2 desenvolvido ascite na cavidade peritoneal. No entanto, nenhuma ratinhos desenvolveram ascite na dose de 100 e 250 mg /kg /dia, em qualquer modelo de tumor. Uma imagem representativa de quatro ratinhos com o tumor MIA-PaCa2 é mostrado na Figura 5A. Nós também comparou a sobrevivência de murganhos entre os diferentes grupos de tratamento. tempo de sobrevivência do ratinho foi significativamente prolongado quando tratados com ≥100 mg /kg /dia de cisteamina em ambos os modelos de tumor (Figura 5B e 5C).

também monitorizada cuidadosamente a condição geral e o peso corporal de ratinhos ao longo do período experimental . Não houve diferença significativa na aparência geral e o peso corporal entre os quatro grupos de animais de ambos os modelos de tumor (Figura 6). Do mesmo modo, não houve alteração no enzimas séricas que representam a função do fígado (ALT) ou dano muscular (aldolase) nem evidência de lesão do músculo esquelético ou função renal (creatinina quinase e creatinina) nos grupos tratados com cisteamina (Figura 7). Além disso, nenhuma toxicidade de órgãos foi detectada em nenhum dos órgãos vitais, tais como o fígado, rim, cérebro, coração, pulmão e nos ratinhos tratados com cisteamina, quando avaliados por exame histológico (Figura S3).

A cisteamina diminui a actividade da MMP nos ortotópicos tumores primários

actividade de MMP nos tumores primários ortotópicos foi medido no dia 30. a cisteamina diminuição da actividade das MMPs em ambos os tumores (Hs766T e MIA-PaCa2) a 100 e 250 mg /Kg de doses de cisteamina (Figura 8A). Nas mesmas amostras, medimos níveis de proteína de ARNm por Q-RT-PCR e de MMP-9 pelo método ELISA. Em contraste com a

in vitro

resultados, cisteamina não afetou os níveis de mRNA e de proteína de MMP-9 em tumores primários colhidos de ratinhos (Figura 8B e 8C). No entanto, o ensaio de zimografia para MMP-9 mostrou uma diminuição dependente da dose na actividade gelatinase (Fig. 8D).

Discussão

Nós demonstramos que cisteamina inibe a migração de células de câncer pancreático e invasão através da inibição direta de atividade enzimática MMP

in vitro

. Esta propriedade recém-descoberto de cisteamina resultou na inibição de metástase das células cancerosas pancreáticas humanas ortotopicamente implantados no pâncreas de ratos imunodeficientes; o efeito foi dependente da dose de cisteamina. A cisteamina diminuída não só o número de metástases no interior da cavidade peritoneal, mas também diminuiu os ascite gerados por metástase de tumor pancreático agressivo. Em contraste, não se observou qualquer alteração significativa no tamanho ou peso do tumor pancreático primário. Consistente com esta observação, cisteamina não causou qualquer efeito na viabilidade celular em linhas de cancro do pâncreas até uma concentração que provocou uma inibição significativa da migração celular e invasão. Os ratinhos tratados com cisteamina sobreviveram mais tempo em comparação com os ratinhos de controlo tratados com excipiente. Ambos

in vitro Comprar e em tumores primários

in vivo

, atividade enzimática MMP diminuíram com o tratamento de cisteamina, enquanto a sua expressão no mRNA e os níveis de proteína não se alterou. resultados confirmados Zymographic cisteamina MMP induzida inibição

In vitro

e

In vivo.

Estas observações indicam que o bloqueio de actividades catalíticas de MMPs por cisteamina é crítica na inibição da metástase do tumor no modelo animal de pâncreas câncer.

Os efeitos anti-metastáticos de cisteamina foram mediados sem quaisquer sinais visíveis de toxicidade. Os ratinhos tratados com a dose mais elevada, mesmo de cisteamina (250 mg /kg /dia) não apresentava sinais de efeitos adversos relacionados com a aparência geral, peso do corpo, o dano muscular, enzimas séricas e os níveis de creatinina no soro. Além disso, os principais órgãos de animais tratados não mostrou qualquer evidência histológica de lesões. Estas observações são consistentes com o perfil de segurança conhecido de cisteamina em seres humanos [2], [3]. A cisteamina causou apenas sintomas gastrointestinais em sujeitos, uma vez que o aumento da produção de ácido gástrico e diminuição da motilidade gastrointestinal [31]. No entanto, estes efeitos foram controladas pelo uso concomitante de inibidor da bomba de protões [32]. Vale ressaltar que cisteamina migração de células de câncer suficientemente inibido e invasão

in vitro

a 50 mM, uma concentração que pode ser alcançado

in vivo

. A administração oral de cisteamina (administrado a cada 6 horas a 60 a 90 mg /kg de peso corporal por dia) pode aumentar o nível de plasma de cisteamina até -50 pM [3], [33] – [35]. Além disso, 100 mg /kg /dia s.c. injecção de cisteamina em animais é semelhante à dosagem utilizada para cistinose, e esta dose produziu uma redução significativa na metástase do tumor e prolongamento da sobrevivência. Consideramos que a cisteamina pode ser administrado com segurança na clínica para controlar metástases do cancro do pâncreas.

Ambos os níveis de ARNm e proteína para a MMP-9 foram modestamente para upregulated moderadamente

In vitro

na dose mais elevada de cisteamina. Do mesmo modo, o ARNm de MMP-12 e 14 foram também modestamente regulada positivamente na dose mais elevada. não foi observado esse aumento na MMP-9

in vivo

, talvez porque as células de câncer pancreático foram incubadas com cisteamina apenas para 24 horas, enquanto

in vivo

tumores foram expostos à cisteamina continuamente por 27 dias. Nós não tente medir os níveis de cisteamina em tumores

in vivo

porque destino metabólico intracelular de cisteamina

in vivo

é muito complexo e difícil de medir, uma vez que se liga a libertar tiol, particularmente as cisteínas de proteínas celulares. Em vez disso, que dependia principalmente sobre os efeitos biológicos de cisteamina em actividades de MMP e o crescimento do tumor. No entanto, o aumento da MMP-9, MMP-12 e MMP-14 níveis no maior concentração

In vitro

pode representar um efeito de compensação temporária das células, devido a uma diminuição súbita da actividade de MMP pela cisteamina. Em contraste, a actividade catalítica de MMP-9 para hidrolisar gelatina em ensaio não mostraram zimografia tal regulação positiva após o tratamento com a dose mais elevada de cisteamina de linhas celulares de cancro do pâncreas e

In vitro

, bem como tumores ortotópicos

in vivo

. De facto, no ensaio de zimografia para MMP-9, a cisteamina causou uma diminuição dependente da dose na actividade da gelatinase. Estes resultados sugerem que a inibição enzimática da MMP-9 por cisteamina podem estar envolvidos na redução da invasão e metástases de cancro pancreático. MMP1, MMP2, MMP7, MMP9 e também têm demonstrado ser expresso no tumor pancreático [36], [37], mas o efeito de cisteamina em níveis de ARNm de todas estas MMPs proteína e não foi examinada excepto para MMP9. Assim, o presente estudo carece de dados sobre o efeito de cisteamina em níveis de ARNm de proteína e para todas as MMPs incluindo MMP2. No entanto, é importante salientar que a cisteamina inibiu a actividade enzimática das MMPs, que inclui todas as MMPs.

A actividade anti-MMP de cisteamina foi menor do que a de inibidores específicos de MMP, tais como o batimastat e marimastat (

IC

50

nM a baixas uM em comparação com gama alta M para cisteamina), mas cisteamina pode ser melhor tolerada

in vivo

. Na verdade, batimastat teve problemas de biodisponibilidade pobres oral [24] e marimastat falhou na clínica como maior dose produziram altos toxicidades músculo-esqueléticas e menor sobrevida em pacientes com metástase do câncer de mama [38]. No presente estudo, os ratos tolerado até 250 mg /kg /dia de cisteamina sem qualquer evidência visível, bioquímica ou histológica de toxicidade ou dano muscular.

Em estudos de tratamento de câncer anteriores, cisteamina foi utilizado devido à sua anti- oxidativo e efeitos radioprotetores [39]. Durante estes estudos, observou-se que a cisteamina também tinha actividades anti-cancerígenas e anti-proliferativos em uma variedade de cancros. Temos agora relatam que cisteamina exerce efeitos anti-metastáticos anti-MMP e. No entanto, cisteamina não afectou o tamanho do tumor pancreático primário, o que sugere que ele deve ser usado em conjunto com outros agentes anti-tumorais, tais como gemcitabina para efeitos anticancerígenos óptimas [13].