Sumário
A inactivação do gene p53 supressor de tumores é frequentemente observada no cancro da próstata humana e está associada com a resistência à terapêutica. Temos anteriormente demonstrado que os polifenóis do chá verde (GTP) induzir a apoptose em células de cancro da próstata, independentemente do status de p53. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a estas observações são ainda imperceptíveis. Aqui nós investigamos os mecanismos de apoptose induzida por GTP em células LNCaP de cancro da próstata humana estavelmente transfectadas com short hairpin RNA contra p53 (LNCaPshp53) e vetor de controle (LNCaPshV). tratamento de GTP estabilização induzida por p53 e activação de alvos a jusante de p21 /WAF1 Bax e de uma forma dependente da dose, especificamente em células LNCaPshV. No entanto, induzida por FAS GTP regulação positiva através da activação de cinase de c-Jun N-terminal resultou na fosforilação FADD, a activação de caspase-8 e truncagem de uma oferta, que conduz a apoptose em ambas as células e LNCaPshV LNCaPshp53. Em paralelo, o tratamento de células com GTP resultou na inibição da via de sobrevivência, mediada por desactivação Akt e perda de fosforilação BAD mais proeminentemente em células LNCaPshp53. Estas rotas distintas de morte celular convergiram para uma via comum, conduzindo a uma perda de potencial mitocondrial transmembranar, a libertação do citocromo c e activação de caspases terminais, resultando em PARP-clivagem. A apoptose induzida por GTP foi atenuada com inibidor de JNK, SP600125 em ambas as linhas celulares; Considerando inibidor de PI3K-Akt, LY294002, resultou num aumento da morte celular proeminentemente em células LNCaPshp53, que estabelece o papel de duas vias distintas de apoptose mediada por GTP. Além disso, a exposição de GTP resultou em inibição da classe I de proteína de HDAC, a acumulação de acetilada histona H3 em cromatina celular total, resultando num aumento da acessibilidade dos factores de transcrição para se ligar com as sequências do promotor de p21 /WAF1 e Bax, independentemente do estado de p53 de células, consistentes com os efeitos induzidos por um inibidor de HDAC, a tricostatina A. Estes resultados demonstram que o GTP induz a morte celular do cancro da próstata por dois mecanismos distintos, independentemente do estado de p53, identificando, assim, os mecanismos moleculares bem definidas específicas que podem ser orientadas por quimiopreventivo e /ou estratégias terapêuticas
Citation:. Gupta K, Thakur VS, Bhaskaran N, Nawab A, Babcook MA, Jackson MW, et al. Os polifenóis (2012) Chá Verde Induzir p53-dependente e p53-Independent apoptose em células de cancro da próstata através de dois mecanismos distintos. PLoS ONE 7 (12): e52572. doi: 10.1371 /journal.pone.0052572
editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 29 de agosto de 2012; Aceito: 19 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Gupta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. A pesquisa trabalho é apoiado pelo Estados Unidos Saúde Pública Subsídios para Serviços SR1 CA115491, CA108512 SR1, SR1 AT002709 e R21 CA109424 e fundos de doações para SG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores são gratos ao Dr. Mark W Jackson, que está cumprindo uma co- autor neste manuscrito e é um editor acadêmico da PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Com limitadas opções de tratamento disponíveis para o câncer de próstata, os pacientes com recidiva de doença são tratados com anti -androgens. No entanto, a resposta clínica inicial é muitas vezes seguida pelo surgimento de câncer [1] hormônio-refratário e resistente quimioterapia eventualmente. Está bem estabelecido que as células cancerosas podem adquirir quimiorresistência através de uma variedade de mecanismos, a maioria deles implicando um programa apoptótico alterada [2]. Estudos recentes têm demonstrado que o estado de p53 pode ser um determinante crítico para a quimio-sensibilidade em tumores humanos [3], [4]. Mais de 50% dos cancros humanos, incluindo o cancro da próstata, perda de exposição das funções normais de p53 e /ou defeitos na via de sinalização de p53, assim como as mutações ou deleções missense; estas alterações moleculares está associada com a resistência à morte da célula [4], [5]. A ineficácia relativa dos actuais regimes quimioterapêuticos justifica uma pesquisa contínua de agentes seguros e eficazes que possam melhorar o tratamento e /ou inibir o desenvolvimento de resistência à quimioterapia.
A proteína p53, um supressor de tumor, funções na transcrição de genes inibidor do crescimento envolvidas em apoptose, a paragem do ciclo celular e de reparação do ADN [4] – [6]. A função supressora de tumores de p53 é atribuído principalmente ao seu papel em um de dois mecanismos: ou promover a sobrevivência e reparação de células danificadas, ou promoção da remoção de células permanente irreparavelmente danificadas através da apoptose [6], [7]. Por exemplo, p53 provoca paragem do ciclo celular, principalmente através da activação da transcrição de um inibidor de ciclina-dependente cinase, p21 /WAF1, e induz a apoptose através da activação da transcrição dos genes da família pró-apoptóticos Bcl2, Bax, PUMA e Noxas [7]. Uma via alternativa e complementar de sinalização que conduz a morte celular programada inclui a via extrínseca de receptor de morte. A via extrínseca é iniciada quando da ligação do receptor do ligando FAS /CD95 mediada por um domínio de morte molécula adaptadora FAS-associado (FADD) que liga o receptor com o efetor a jusante, caspase 8, resultando na montagem da morte de indução de sinalização complexo [ ,,,0],7], [8]. As vias de apoptose extrínsecas e intrínsecas são ligados pela clivagem de caspase-8-mediada do pró-apoptótica membro da família Bcl-2 Bid. Truncado Bid (tBid) transloca-se para as mitocôndrias, onde induz a libertação de citocromo C, seguido pela indução de apoptose [9].
A desregulação da via p53 numa célula cancerosa é um evento comum e pode contribuir a resistência aos medicamentos, são necessárias estratégias quimioterápicos destinadas a este mecanismo defeituoso. Por exemplo, uma nova abordagem terapêutica, que envolve a inibição farmacológica de histona desacetilases (HDACs), permite remodelação local da cromatina e alterações dinâmicas no empacotamento nucleossomal, através de acetilação /de-acetilação da proteína do núcleo de histona, e assim desempenha um papel fundamental na regulação de acessibilidade a ADN cromossómico, e, assim, na regulação da transcrição de genes [10]. Entre as mais importantes reguladores de tais fenómenos são enzimas específicos que regulam a acetilação N-terminal de resíduos de lisina em histonas H3 e H4, a histona acetiltransferase (HATs) e HDAC [10], [11]. Estas enzimas podem ser recrutados para modificar genes específicos em complexos por factores de transcrição específicos de sequência. A inibição da actividade de HDAC provoca paragem do ciclo celular e a apoptose em células cancerosas, principalmente por meio de activação da transcrição de resposta pró-apoptótico mediado por p53 e a indução do ciclo celular de inibidor de cinase de p21 /WAF1 e Bax, bem como através de ligação directa transcricionalmente-independente de p53 a Bax, Bcl-2 e Bcl-
xL [12], [13].
ao lado de inativação de elementos de sinalização apoptóticos tumores também desenvolvem resistência à quimioterapia pela ativação de sobrevivência sinalizando como o phosphatidylinositide 3-quinase ( PI3K) /Akt [14]. A activação de PI3K por tirosina-cinases receptoras conduz ao recrutamento da proteína quinase B (PKB /Akt) para a membrana do plasma onde ele é subsequentemente activada por fosforilação em resíduos de Thr308 e Ser473, que são por sua vez fosforiladas por cinases dependentes de fosfoinositido. Activado Akt aumenta a sobrevivência de células tanto pela inibição de proteínas pró-apoptóticas
viz. BAD ou caspase-9 e pela ativação de proteínas anti-apoptóticos, promovendo assim a sobrevivência da célula [14], [15].
Nas últimas décadas, uma série de compostos polifenólicos naturais foram avaliados quanto à sua possível utilização na prevenção e tratamento de cancro [16]. polifenóis de chá verde, o constituinte principal das quais é epigallocatechic-3-galato (EGCG), têm sido mostrados para induzir a paragem do ciclo celular e a apoptose em diversos tipos de células de cancro [17]. Nosso laboratório tem realizado extensas investigações sobre os mecanismos subjacentes aos efeitos anti-cancerígenos de polifenóis do chá verde em células cancerosas humanas da próstata [12], [13]. Nós anteriormente demonstrado que os polifenóis do chá verde causar apoptose em células de cancro da próstata, independentemente da associação de andrógeno eo status p53 [13]. Além disso, demonstrou-se que o GTP e a actividade transcricional de p53 aumento EGCG e acetilação suprimindo histona desacetilases de classe I [12]. No presente estudo, os nossos resultados demonstram que os polifenois do chá verde induzir apoptose em células de cancro da próstata através da activação do receptor de morte FAS /caspase-8 e inibir a via de P-Akt /via de sobrevivência de células P-BAD. Os nossos resultados acumulados têm implicações importantes para a compreensão do mecanismo molecular da quimiorresistência em células de cancro da próstata, e em particular, o papel de p53 e Akt no presente processo. Desde chemoresistance é um fator limitante nos esforços para proporcionar o sucesso do tratamento para câncer de próstata, é fundamental para entender como GTP diferencialmente supera resistência terapêutica e induz a apoptose em células de câncer de próstata com diferentes tipos de anormalidades p53.
materiais e métodos
Cultura de células e Reagentes células
e LNCaPshV LNCaPshp53 foram gerados através da infecção de células LNCaP de cancro da próstata humanas obtidas de American Type Culture Collection (Manassas, VA) com lentivírus shp53 preparados no laboratório por transfecção células 293T com vectores lentivirais pLVTHSiGFP ou pLVTHMshp53RNA e construções de empacotamento, como descrito anteriormente [18], [19]. As células foram cultivadas e mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone, Thermo Fischer, Logan, UT) suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (Foundation, West Sacramento, CA) a 50-70% de confluência. As células receberam os seguintes tratamentos: 20 ng /ml de tricostatina A (Sigma, St Louis, MO), dissolvido em DMSO; 20-80 ug /ml Polyphenon E® (Mitsui Norin, Japão), a seguir referida como polifenóis do chá verde (GTP) para tempos indicados. As concentrações de 10 ug /ml a Polyphenon E correspondem a 14 uM EGCG como determinado por análise de HPLC. Os constituintes presentes em Polyphenon E® são previamente descrito [20]. Os anticorpos para o anti-p53 (SC-126), anti-p21 /WAF1 (SC-397), anti-Akt (SC-8312), anti-Bax (SC-493), anti-BID (SC-6538), anti -HDAC1 (SC-7872), anti-HDAC2 (SC-6296), anti-HDAC3 (SC-11417), anti-HDAC8 (SC-11405), anti-FAS (SC-715), anti-FADD (SC- 5559), anti-P-FADD Ser194 (SC-12439), anti-caspase-8 (SC-7890) e anti-β-actina (SC-47778) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anticorpos para H3 anti-histona (05-928), anti-histona acetil H3 Lys9 /18 (07-593) a partir de Upstate (EMD Millipore, Billerica, MA) e BID (44-4334) foi obtido a partir de Invitrogen Corporation (Camarillo , CA). Os anticorpos para o anti-caspase-9 (# 9502), anti-caspase-3 (# 9662), clivado da PARP (# 9544), anti-c-IAP (# 3130), anti-X-IAP (# 2045), anti -SAPK /JNK (# 9258), anti-p-JNK Thr183 /Tyr185 (# 9251), anti-P-Akt Ser473 (# 4051), anti-BAD (# 9292), anti-P-BAD Ser136 (# 9295 ) e anti-VDAC (# 4866) foram adquiridos de sinalização celular Technologies (Danvers, MA).
geração de LNCaPshV e LNCaPshp53 células
células de empacotamento 293T foram colocadas em placas de 100 mm a dia antes da transfecção em meio DMEM contendo 10% de FBS inactivado pelo calor, sem penicilina-estreptomicina. As células foram transfectadas com 6 ug de ARN shp53 ou shGFP (controle) juntamente com construções de empacotamento de segunda geração (pCMV-dR8.74 e pMD2G) usando Lipofectamin Além disso reagente (Invitrogen Corp.) de acordo com o protocolo proporcionado pelo fornecedor. Durante dois dias subsequentes, o meio foi recolhido e em camadas sobre as células LNCaP após a adição de 10 uL de 4 mg /ml de polibreno por 10 ml e esterilizar por filtração.
Ensaio de Proliferação
O efeito de GTP sobre a proliferação celular foi determinada por MTT [brometo de 3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazoliumbromide] e ensaio de inibição do crescimento foi avaliada como a percentagem de viabilidade em que as células tratadas com o veículo foram tomados como 100 % viáveis, tal como anteriormente descrito [21].
azul de metileno de coloração e quantificação
As células foram plaqueadas em placas de cultura de 6 poços e tratadas com várias concentrações de camptotecina (50-200 ng /ml) durante 24 h. O meio foi então removido e as células fixadas com solução de azul de metileno após o tratamento e as placas foram mantidas num agitador durante 1 h. As placas foram lavadas suavemente com água duplamente destilada para remover o excesso de corante, seco e analisado.
Microscopia de Luz
células
LNCaPshV LNCaPshp53 e foram cultivadas até 70% de confluência e tratadas com 20-40 ug /ml de concentração de GTP durante 24 h. As fotografias foram capturadas com uma ampliação de X40 usando microscopia de luz.
ADN A fragmentação Ensaio
As células foram cultivadas a cerca de 70% de confluência e tratadas com 40 ug de concentração /ml de GTP durante 48 h. As células foram então submetidas a processamento para o isolamento de ADN e o ensaio de fragmentação. As bandas foram visualizadas sob um transiluminador de UV, seguido por fotografia digital tal como anteriormente descrito [21].
A morte celular Ensaio
apoptose celular foi medida por
In vitro de determinação
associada-histona-DNA fragmentos citoplasmáticos (mono e oligonucleosomes) após a indução da morte celular através de um imunoensaio enzimático utilizando fotométrico celular kit ELISA de detecção de morte a partir de Roche (Cat # 11774425001), conforme o protocolo do fornecedor. Resumidamente, as células foram tratadas com 20? M ou LY294002 20 uM SP600125 durante 8 h e 40 ug /ml de GTP durante 16 h ou em combinação, durante 24 horas e os extractos celulares citoplasmáticos foram transferidas para as placas de micropoços revestidas com estreptavidina com o imuno-reagente contendo anti- histona-biotina, anti-ADN-POD. Após a incubação, a reacção enzimática foi realizada e a cor foi lida a 405 nm, utilizando o comprimento de onda de referência como 490 nm. Os valores de fundo (só tampão de incubação), e foram subtraídos os valores de DO que representam fragmentos de ADN nucleossomais em amostras tratadas foram comparados com os valores obtidos a partir de células de controlo não tratadas, e expresso como vezes de aumento.
Western Blot Análise
as células foram lisadas em ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão (contendo 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS em PBS, e adicionada de fresco completo de cocktail inibidor de protease (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). a concentração de proteína na ligado celular foi determinada utilizando o ensaio de proteína compatíveis com detergentes a partir de Bio-Rad (Hercules, CA). As amostras de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose. a membrana foi incubada com o anticorpo primário durante a noite bloqueada em leite magro a 5% em PBS. membrana dia seguinte foi removido do anticorpo primário, lavou-se com tampão de lavagem e subsequentemente incubadas com peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Membrana foi então desenvolvido com reagente de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e exposto a filme de autorradiografia Hyblot CL (Denville Scientific, Metuchen, NJ). digitalização de imagem e quantificação foram realizadas com sistema de imagem Kodak de 2000.
Extração e Expressão da acetilado histona Proteínas
cancerosas humanas da próstata células LNCaPshV e LNCaPshp53 foram tratados com 20-80 mg /ml GTP para 24 h e foram colhidas em seguida, lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) suplementado com de butirato de sódio 5 mM. Após lavagem, as células foram ressuspensas em tampão de extracção de Triton [PBS contendo 0,5% de Triton X-100 (v /v), fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 0,02% (p /v) de NaN3] e lisadas em gelo durante 10 min com agitação suave, centrifugado a 2000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Sedimento foi lavado em tampão de extracção de Triton e, em seguida, ressuspenderam-se em HCl 0,2 N. As histonas foram ácido extraída durante a noite a 4 ° C e centrifugou-se a 2000 rpm durante 10 min a 4 ° C. As amostras foram processadas para a análise de imunotransferência utilizando histonas.
imunoprecipitação da cromatina (ChIP) Ensaio
de cancro da próstata humano e células LNCaPshV LNCaPshp53 foram tratados com doses de 20-80 ug /ml de GTP dissolvidos em PBS ou apenas com PBS (controlo), durante 3 dias. No final do tratamento, as células foram incubadas em soro contendo 1% de formaldeído durante 15 minutos à temperatura ambiente, durante a reticulação. A reacção foi então parada utilizando 0,125 M concentração final de glicina. A cromatina foi digerido com a enzima nuclease monococcal e incubadas com anti-histona H3 acetilada (Cat # 07-593; Upstate Biotechnology) anticorpo durante a noite a 4 ° C. A reticulação foi invertida por incubação das amostras durante a noite a 65 ° C. O ADN foi purificado utilizando uma solução de fenol-clorofórmio-isoamilo com a extracção seguida por precipitação com etanol. O DNA foi então ressuspenso em água isenta de nuclease. Os iniciadores utilizados para o promotor do gene de p21 /WAF1 foram como se segue: iniciadores directos 5′-GTGGCTCTGATTGG CTTTCTG-3 ‘, os iniciadores reverso 5′-GTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3′ e para o promotor do gene Bax, iniciadores directos 5’-TAATCCCAGCGCTTTGGAA-3 ‘e os iniciadores reverso 5’-TGSF GAGACCTGGATCTAGCAA-3 ‘, respectivamente. ADN imunoprecipitadas, grânulos ou controles de entrada foram submetidos a reacção em cadeia da polimerase (PCR) amplificação de 30 ciclos dos seguintes condições de ciclo: Fase-1-95 ° C durante 2 min (1 ciclo), Stage-2-95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min (30 ciclos), Stage-3-72 ° C durante 3 min (1 ciclo). Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese utilizando gel de agarose a 2%.
Análise do Ciclo Celular e Apoptose Detecção
O efeito de GTP no ciclo celular e subG1 foi medido através da realização do ensaio de citometria de fluxo. células LNCaPshV e LNCaPshp53 foram tratados com GTP e foram colhidas por tripsinização pós-tratamento (ambos ligados e as células flutuantes da mídia pós-tratamento) foram coletados. As células foram lavadas duas vezes com PBS. Aproximadamente, 1 × 10
6 as células foram fixadas em metanol frio 90% e deixada sobre gelo durante pelo menos 30 minutos, e armazenados a -20 ° C até processada para ciclo celular. As células foram sedimentadas, lavadas e ressuspensas em 0,04 ug /mL de iodeto de propídio e 100 ug /ml de RNase em PBS. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 min e citometria de fluxo foi realizada no fluxo EPICS XL-MCL citómetro e analisados utilizando o software Modfit celular Análise quest para determinar o número de células em cada fase do ciclo celular.
Análise estatística
Todas as experiências foram repetidas pelo menos duas vezes em duplicado. Os resultados são expressos como valores médios ± DP. As imagens foram digitalizadas e a quantificação foi realizada utilizando um programa de software com um sistema de imagem Kodak 2000. As comparações estatísticas foram feitas por ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett.
P
valores . 0,05 foram considerados significativos
Resultados
Embora a eficácia de GTP na indução de apoptose numa variedade de tipos celulares de cancro tem sido bem documentada [22] – [24], o efeito de GTP na ausência de anomalias p53 não foi investigado em pormenor. Estudos anteriores demonstraram que a inactivação de p53 por ARNsi em células LNCaP de cancro da próstata humano aumento da resistência a apoptose mediada por EGCG [25]. Para estabelecer de forma inequívoca o papel da p53 e investigar as vias responsáveis pelo aumento da resistência celular, geramos células isogênicas com fundo do vetor lentivírus por p53 permanentemente knockdown em células LNCaP para gerar LNCaPshp53 e transfectadas com vector de controlo para gerar células LNCaPshV. Para determinar se os níveis de p53 afectar a resposta a morte celular, as células foram tratadas com isogénicas camptothechin, um agente anti-cancro que danificam o ADN que provoca a apoptose em várias células de cancro humano [26]. Como mostrado na Figura 1A, o tratamento com 50 e 100 ng /ml durante 24 h camptothechin resultou no aumento significativo de células LNCaPshV na fase G1 do ciclo celular. Em comparação com o controlo não tratado, a percentagem de células em fase G1 aumentou de 67,36% para 79,62% e 86,22%, após tratamento com concentrações de 50 e 100 ng /ml de camptotecina. Da mesma forma, as células exibiram LNCaPshp53 prisão fase G1 depois do tratamento com camptotecina 74,43% e 71,42% após o tratamento com 50 e 100 ng camptotecina /ml, em comparação com células não tratadas com 62,51% na fase G1. Além de prisão fase G1, camptotecina também causou acumulação significativa de células em fase subG1, indicativo de apoptose. Em comparação com células não tratadas (3,37%), o tratamento de células com camptotecina LNCaPshV aumentou de 34,91% a 50 ng /ml e 51,97% a 100 ng /ml na fase sub-G1. No entanto, as células LNCaPshp53 foram mais resistentes a apoptose mediada por camptothechin com 23,87% e 29,59% a 50 ng /ml e 100 doses ng /ml na fase subG1, em comparação com 1,71% nos controlos não tratados. Resultados similares foram observados no ensaio clonogénico onde knockdown de p53 resultou num aumento da resistência à camptothechin mediada por morte celular (Figura 1B).
isogénicas células com vector de fundo-lenti vírus foram gerados por knockdown permanente de p53 em LNCaP células [LNCaPshp53] e transfectadas com vector de controlo, as células LNCaPshV. [A] Células tratadas com 50 e 100 ng camptotecina /ml durante 24 h foram colhidas, coradas com PI e analisadas por citometria de fluxo para medir a sub-população G1 e G1. [B] As células foram tratadas com 50, 100 e 200 ng /ml de camptotecina, durante 24 h e coradas com azul de metileno. A intensidade de azul de metileno absorvido pelas células vivas foi medida após spectrophotometerically eluindo o corante em HCl 0,1 N e em comparação com células não tratadas. [C] Knockdown de p53 regulada Akt sinalização /BAD em células de câncer de próstata. células LNCaPshV e LNCaPshp53 foram lisadas e Western blot foi realizada para p53, Akt, proteínas p-Akt (Ser473), mau, p-BAD (Ser136). Actina foi utilizado como controlo de carga interna. [D] intensidades relativas de P-Akt e proteína p-Bad em células LNCaPshV e LNCaPshp53RNA onde as bandas foram normalizados para a actina e expressas em valores relativos, em comparação com a proteína nativa. Os detalhes são descritos na secção de materiais e métodos.
knockdown de p53 aumenta a sobrevivência de Akt via de sinalização
Uma vez que estudos têm mostrado que activado Akt pode levar a infra-regulação dos níveis de p53 [27 ], o próximo determinado o efeito de knockdown p53 sobre os níveis de Akt e seus alvos a jusante. Como mostrado na Figura 1C, knockdown de p53 provocou um aumento significativo na expressão de P-Akt (Ser473) e p-BAD (Ser136) em células LNCaPshp53, em comparação com células LNCaPshV. Um aumento nos níveis de 2,0 vezes P-Akt e 3,78 vezes de aumento nos níveis de p-BAD foram observados após knockdown p53 em células LNCaPshp53, em comparação com células LNCaPshV (Figura 1D).
polifenóis de chá verde induzir a apoptose em ambos os LNCaPshV e células LNCaPshp53 independente do estado de p53
Para caracterizar o estado de p53 sobre o efeito do tratamento de GTP, estudos subsequentes foram realizados em células LNCaPshV e LNCaPshp53. Como mostrado na Figura 2A, realizado um ensaio MTT após 24 h de tratamento com 20-80 ug de concentração /ml de GTP exibiam uma inibição dependente da dose da viabilidade celular de 100% a 33,98% em LNCaPshV e 100% para 66% em células LNCaPshp53. Em comparação com células LNCaPshp53, células LNCaPshV foram mais sensíveis à exposição ao GTP nas primeiras 24 horas de tratamento. Para estudar os efeitos da exposição mais prolongada ao GTP, estudos dependentes do tempo foram realizados com 40 ug /ml de dose de GTP. O tratamento de células com acumulação de GTP causada acentuada de células em G0 /G1 fase; 71,02% a 84,57% em células LNCaPshV, em comparação com 78,39% a 81,19% em células LNCaPshp53 entre 48-96 h, respectivamente (Figura 2B). O número de células em subG1 também aumentou significativamente a 96 h de tratamento pós-GTP em ambas as linhas de células; 0,53% a 66,97% em células LNCaPshV e 0,31% para 83,94% em células LNCaPshp53, independentemente do seu estatuto p53 (Figura 2C). tratamento de GTP também resultou na apoptose das células ambos LNCaPshV e LNCaPshp53 como observada por microscopia de luz e ensaio de fragmentação de ADN (Figura 2 D E).
[A] As células foram expostas a uma concentração de 20-80 ng /ml de GTP durante 24 h, e a viabilidade das células foi determinado pelo ensaio de MTT. viabilidades celulares são descritos como percentagens; As células tratadas com o veículo foram considerados como 100% viáveis. As barras representam a média ± DP de pelo menos duas experiências independentes, cada uma realizada em duplicado, **
P
0,001 representa diferenças significativas em comparação com o grupo de controlo sem tratamento de GTP. [B] celular foram tratadas com 40 ug /ml de GTP para 24, 48, 72 e 96 h e distribuição das células foram registados em diferentes fases do ciclo celular analisada utilizando análise de FACS. [C] As células foram tratadas com 40 e 80 ug /ml de GTP durante 96 h e o número de células que sofrem apoptose foi determinada por medição da população de células em fase G1 sub do ciclo celular. As barras representam a média ± DP de pelo menos duas experiências independentes, cada uma realizada em duplicado, **
P
0,001 representa diferenças significativas em comparação com o grupo de controlo sem tratamento de GTP. [D] imagens microscópicas de Luz de células LNCaPshV e LNCaPshp53 tratados com 40 e 80 ug /ml de GTP por 96 h. tratamento de GTP apresenta alterações morfológicas consistentes com apoptose em ambas as células. [E] ensaio de DNA fragmentação. As células foram tratadas com 40 ug de concentração /ml de GTP durante 48 h, recolhido para o isolamento de DNA e submetido a electroforese em gel de agarose, seguindo-se a visualização das bandas com luz UV. Os detalhes estão descritos na secção de materiais e métodos.
Anteriormente, relatou que, em células cancerosas humanas da próstata contendo p53 funcional, GTP tratamento EGCG constituinte regula positivamente a p53 e sua fosforilação em resíduos de serina críticos e p14
regulação negativa mediada por MDM2 IRA de um modo dependente da p53 [28]. O tratamento de células com LNCaPshV /concentrações de 20-80 ug ml de GTP durante 24 h exibiu um aumento dependente da dose na p21 /WAF1, Bax e PUMA, alvos a jusante bem conhecidas de p53, ao passo que não houve alterações significativas foram notadas em p-BAD e níveis de P-Akt. Em células LNCaPshp53, tratamento GTP também resultou num aumento dependente da dose, na expressão de p21 /WAF1, Bax e PUMA, embora não na extensão observada em células LNCaPshV, indicando tanto p53-dependente e de p53 independente da indução de citocinas pró-apoptótica proteínas nessas células (Figura 3a). A seguir ao tratamento com GTP uma diminuição significativa da fosforilação de Akt e BAD era evidente em células LNCaPshp53. Consistente com a apoptose, os aumentos dependentes do tempo na caspase clivada da caspase 9 e 3 foram observados em ambas as linhas celulares (Figura 3B).
[A] As células foram tratadas com 20-80 ug /ml de concentração de GTP para 24 h e Western blot foi realizada para p53, Akt, p-Akt (Ser473),,, p21 WAF1, proteínas BAD p-BAD (Ser136) /Puma e Bax. [B] As células foram tratadas com 40 ug /ml de concentração de GTP para 3, 6, 9, 12, 24 e 48 h e transferência de Western foi realizada para pro-caspase-9 clivada, caspase-9 e proteínas clivada da caspase-3. Uma mancha típica actina demonstra controle de carga interna. Citocromo c libertação da mitocôndria para o citosol foi determinada por Western blot em células tratadas GTP. Uma mancha típica actina demonstra o controle de carregamento interno para citosol enquanto VDAC como controle de carga interna das mitocôndrias. [D] As células foram tratadas com 20 concentração uM de inibidor de PI3K-Akt LY294002 durante 8 h e com 40 ug /ml de GTP durante 16 h sozinho, ou LY294002 durante 8 h seguido pelo tratamento de GTP em combinação seguido por transferência de Western para P-Akt , Akt, p-BAD e proteínas ruim. As expressão das proteínas nativas foram considerados como controlos de carga. [D] medição da morte celular foi realizada por imunoensaio enzima fotométrico celular ELISA kit de detecção da morte. As barras representam a média ± SD de pelo menos duas experiências independentes, cada realizadas em duplicado, **
p Art 0,001 representa diferenças significativas em relação ao grupo controle. [E] de luz imagens microscópicas de células LNCaPshV e LNCaPshp53 tratados com LY294002 e GTP isoladamente ou em combinação. Os detalhes são descritos na secção de materiais e métodos.
Em seguida, foram analisados os efeitos da exposição de GTP na via apoptótica jusante, especificamente, os efectores da cascata de morte mitocondrial, avaliando a libertação do citocromo C no citosol. O tratamento de células e LNCaPshV LNCaPshp53 com GTP aumentou significativamente os níveis de citocromo C no citosol, que atingiu um máximo de 12 h de exposição pós-GTP. Translocação de citocromo C da mitocôndria para o citosol foi observada em ambas as linhas celulares de uma forma dependente do tempo (Figura 3B).
Chá Verde polifenóis Inibição de Akt Ser473 fosforilação e a jusante alvos em células LNCaPshp53
anteriormente, demonstrou que a p53 knockdown resultou em aumento da expressão da Akt e aumentou sua fosforilação em Ser473. Em seguida, tratada com ambas as linhas celulares de GTP e /ou LY294002, um inibidor específico de PI3K-Akt. A fosforilação de Ser473 e T308 activa Akt para fosforilar proteínas alvo através da sua actividade de cinase para promover a sobrevivência e inibir a apoptose [29]. Como mostrado na Figura 3C D, o tratamento de células com LY249002 causado uma redução nos níveis de p-Akt e resultou num aumento da apoptose em ambas as linhas celulares, embora a extensão da apoptose em células foi maior LNCaPshp53. Da mesma forma, o tratamento de GTP inibiu a fosforilação de Akt Ser473 no, que foi consistente com o aumento da apoptose, e tratamento combinado com GTP e LY294002 resultou em um nível ainda mais elevado de morte celular em células em células que LNCaPshp53 LNCaPshV. Consistentemente, a fosforilação de Bad foi diminuiu significativamente como resultado da diminuição da fosforilação da actividade de quinase de Akt por LY294002 e GTP; esta correlacionada com simultâneo aumento da morte celular de células LNCaPshp53. Efeitos similares foram observados de menor magnitude em células LNCaPshV (Figura 3 D E). Estes resultados demonstram que, embora a magnitude da morte celular provocada pela exposição ao GTP é semelhante em ambas as linhas celulares, as vias que levam à apoptose é diferente e pode ser influenciado pelo estado de p53.
polifenóis de chá verde Induzir o receptor de morte via em células cancerosas humanas da próstata
a fim de explorar possíveis mecanismos envolvidos na apoptose induzida por GTP, o próximo focada na via extrínseca através da FAS. Como mostrado na figura 4A, o tratamento com GTP provocou indução do FAS dentro de 10 minutos em ambas as linhas celulares, seguido por um aumento dos níveis de FADD fosforilada na Ser194, ao passo que os níveis totais de FADD manteve-se inalterada. No entanto, os níveis basais de FADD eram muito mais elevados em células LNCaPshp53 em comparação com células LNCaPshV. Procura os efectores a montante da FAS regulação positiva revelou que a JNK foi activada por GTP, como se tornou evidente a partir do aumento em estado p-JNK.