Abstract

A proteína do citoesqueleto Wave3 promove invasão e metástase do câncer. Mostrámos que a activação Wave3-mediada de invasão de células de cancro é devido, em parte, a sua regulação da expressão e actividade de metaloproteinases da chave (MMP), incluindo a MMP9, que está envolvida centralmente na degradação mediada por invadopodia da matriz extracelular ( ECM). MMP9 é também um importante gene alvo NFkB, sugerindo uma ligação potencial de Wave3 para esta via, que procurou investigar. Mecanisticamente, verificou-se que a perda de Wave3 em células cancerosas conduz à inibição da sinalização de NFkB, como resultado de uma diminuição da translocação nuclear de NFkB e, por conseguinte, a perda de activação de genes alvo de NFkB. Por outro lado, a sobre-expressão de Wave3 foi suficiente para aumentar a actividade de NFkB. Ambas as manipulações farmacológicas e genéticas das moléculas efectoras NFkB mostram que a consequência biológica de perda de função Wave3 na via de NFkB resultar da inibição da formação e da degradação de ECM invadopodia pelas células cancerosas, e estas alterações são uma consequência da diminuição da expressão de MMP9 e actividade. Perda de Wave3 também sensibilizados células cancerosas à apoptose e morte celular impulsionado por TNFa, através da inibição da via de pro-sobrevivência AKT. Nossos resultados identificar uma nova função de Wave3 na sinalização de NFkB, onde sua atividade é essencial para a regulação da invadopodia e degradação ECM. Portanto, alvo de inibição terapêutica de Wave3 vai sensibilizar células cancerosas à apoptose e morte celular, e suprimir invasão e metástase de câncer

Citation: Davuluri G, Augoff K, Schiemann WP, Plow EF, Sossey-Alaoui K (2014. ) Wave3-NFkB Interplay é essencial para a sobrevivência e invasão das células cancerosas. PLoS ONE 9 (10): e110627. doi: 10.1371 /journal.pone.0110627

editor: Chengfeng Yang, Michigan State University, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Julho, 2014; Aceito: 16 de setembro de 2014; Publicação: 16 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Davuluri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho recebeu apoio de HL073311 subsídios P01 e R01 HL096062, Instituto Nacional de Saúde, NIH.gov, EFP; e CA43703 P30 concessão, caso do Comprehensive Cancer Center, Case.edu, a KS-A e WPS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a metástase é um processo complexo que exige células cancerosas para escapar de seu site principal, sobreviver no sistema sanguíneo /linfa e, em seguida, para estabelecer um novo nicho em um local distante [1]. Durante este processo, também referida como a cascata de invasão de metástases, células de cancro utilizam saliências ricos F-actina especializadas chamadas invadopodia, concentrar-se a actividade enzimática das MMPs para degradar a ECM, permitindo assim que as células de cancro para invadir e migram através do seu microambiente [2], [3]. As proteínas WASP /WAVE desempenham um papel central em vários processos celulares, incluindo a forma celular, motilidade, citocinese, bem como a invasão de células do cancro [4] – [6]. Wave3, em particular, tem sido demonstrado ser essencial para a motilidade e invasão de células cancerosas [7] – [9], contribuindo para a formação de extensões lamellipodia no bordo de ataque de células invasivas [8], [10]. A expressão de Wave3 também é fortemente enriquecido em vários tipos de câncer, incluindo câncer de mama (CM) [11] – [14]. Na verdade, foi mostrado expressão e atividade da Wave3 aprimorado para contribuir com a metástase do câncer de mama triplo-negativo (TNBC), o subtipo mais agressiva do BC [14] – [16].

activação NFkB fator nuclear é bem conhecido por estar implicado na sobrevivência, invasão e metástase de vários tipos de cancros [17], [18]. A activação da via de NFkB é necessário por diversas respostas fisiológicas e patológicas que vão desde a montagem de uma resposta imunitária bem sucedida e para a sobrevivência e proliferação de células cancerosas [19] – [21]. A família NFkB de fatores de transcrição é composto por cinco membros, p50, p52, RELA (p65), RelB e c-Rel, que formam dímeros homoméricos ou heteroméricos para activar a transcrição dos genes-alvo [22]. Nas células em repouso, NFkB é mantida num estado quiescente transcricionalmente por ser sequestrado no citoplasma em complexos de proteína com os inibidores de membros de família IkappaB (IkB), incluindo IκBα, IκBβ, IκBε. Na via clássica, o TNFa pode induzir IkB cinase (IKK) mediada por fosforilação e proteossómica degradação de IκBα, seguida de fosforilação e a translocação nuclear do heterodímero p50-p65 para activar a transcrição de genes alvo NFkB [23]. O NFkB tem sido mostrado que estimula a produção de MMPs, incluindo MMP1, MMP3 e MMP9 [24] – [26]. Curiosamente, nós e outros têm mostrado que Wave3 também pode regular a expressão e actividade destes MMPs, sugerindo potencial papel Wave3 /NFkB interacção na regulação da MMP9 e atividade invadopodia em células cancerosas [8], [10].

Aqui nós apresentamos evidências de que a atividade metástase promoção de Wave3 é alcançado em parte através do seu regulamento de NFkB sinalização em células cancerosas. Mostra-se que a perda de Wave3 no BC metastático MDA-MB-231 células resulta na inibição da actividade de NFkB. Por outro lado, a sobre-expressão da sinalização de NFkB Wave3 aumenta. Mostramos que a modulação Wave3 mediada por NFkB é necessário para a formação invadopodia bem como a expressão de MMP9 e actividade que são necessários para as células cancerosas de degradar a ECM. Finalmente, mostra-se que a inibição do alvo-Wave3 sensibiliza as células cancerosas à apoptose e morte celular através da inibição de AKT e sobrevivência de caspases a jusante de vias de NFkB. Assim, nossos dados estabelecer uma nova função para Wave3 que é fundamental para a regulação da sinalização de NFkB e apoiar o uso de inibidores Wave3 em terapias de combinação para alvejar especificamente a metástase do câncer.

Procedimentos Experimentais

Antibodies

rabbit anti-Wave3 (1:1000), de coelho anti-MMP9 (1:1000), de coelho anti-MMP2 (1:1000), de coelho anti-p38 (1:1000), de coelho anti p38 fosfo (1:1000), ERK fosfo coelho (1:1000), ERK coelho (1:1000), de coelho anti AKT fosfo (Ser473; 1:1000), de coelho anti panAKT (1:1000), de coelho anti JNK Phospho (1 :1000), de coelho anti-JNK (1:1000), p65 de rato anti-fosfo (Ser536) (1:1000), de coelho anti-Cortatcin são de sinalização celular Technologies. (Danvers, MA); de ratinho anti-GFP, de ratinho anti-WAVE2 (1:3000), de ratinho anti-WAVE1 (1:3000) são da Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA); p65 de coelho anti-NFkB (1:5000) de BioLegend (San Diego, CA), de coelho anti NAP1 (1:2000), de coelho anti ABI1 (1:5000), de coelho anti CYFIP2 (1:3000), de ratinho anti-actina (1:5000), de coelho anti-Myc (1:1000) são a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); rábano de cabra conjugado com peroxidase de IgG anti-ratinho (1:5000) e de rábano de cabra anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (1:5000) de Calbiochem; e Alexa 488-conjugado anti-IgG de coelho e Alexa 568-conjugado anti-rato IgG Alexa 568-faloidina conjugada são a partir de Invitrogen. Vecta-protetor com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole foi de Vector Laboratories (Burlingame, CA). reagentes eletroforese em gel foram de Bio-Rad (Hercules, CA).

siRNA e shRNA expressão gênica knockdown

Foi utilizado o On-Targetplus SmartPool (Thermo Scientific) siRNA L-012141-00- 0010, L-1012301-00-0010, CYFIP2HSS120271, ABI1HSS11589 (Invitrogen), e SignalSilence IκBα siRNA (Cell Signaling Technology) para knockdown transiente da expressão de WAVE2, Wave3, CYFIP2 e ABI1, respectivamente, como descrito anteriormente (14). knockdown estável de Wave3 foi alcançada através de transfecção das células MDA-MB-231 e BT549 BC quer com o controlo não-segmentação shRNA ou os clones Wave3 MISSÃO shRNA (Sigma) seguido por selecção de puromicina de clones positivos como anteriormente descrito (12).

Cultura celular

células humanas MDA-MB-231 BT549 e MCF7 BC foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC) e foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de fetal de soro de bovino (FBS), 100 unidades de penicilina /ml, 100 ug de estreptomicina /ml. Por estimulação com TNFa, as células foram primeiro submetido ao soro de fome durante a noite em DMEM sem soro fetal de bovino, e, em seguida, tratado com 50 ng /ml de TNFa ou o diluente DMSO (condições basais) como controlo negativo do tratamento durante 15 min. Para a inibição da síntese de proteínas, células foram tratadas com ciclo-heximida (CHX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 50 ug /ml e incubou-se durante 24 h. Para a inibição de proteassoma, as células foram tratadas com MG-132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a uma concentração de 20 uM e incubou-se durante 24 h. A Akt-inibidor de MK-2206 (SELECT Chemicals, Yorktown, TX) foi usada numa concentração final de 10 uM para o tratamento de células durante 16 h enquanto o IKKβ-inibidor (Merck Millipore, Billerica, MA) foi usada numa concentração final de 10 uM para o tratamento de células durante 24 h.

a citometria de fluxo

-231 MDA-MB ou BT549 células, transfectadas quer com o shRNA controlo não segmentação ou o shWAVE3, foram tratadas com TNF durante 3 h e propagados em meio de cultura de Dulbecco modificado por meio Eagle (DMEM) suplementado com 10% FBS e puromicina (5 ug /ml). culturas de células subconfluentes foram descoladas por tripsinização e lavadas com solução salina equilibrada de Hank com Ca2 +, Mg2 +, e 0,1% de BSA. As células foram processadas por citometria de fluxo, tal como descrito pelo fabricante (Roche In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein). Iodeto de propídio foi usado para detectar células mortas. Todos os dados foram adquiridos em um instrumento BD LSRII e analisados ​​com software 7.6.3 FlowJo (Treestar). A ligação não específica do anticorpo secundário sozinho com as células foi subtraída de todos os dados de citometria de fluxo para se obter os valores de intensidade de fluorescência resultantes que são exibidos.

A análise de imunotransferência

lisados ​​de células inteiras contendo quantidades similares do total proteína (~ 50 ug) foram resolvidas num gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio-10%, seguido por transferência para nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA) ou Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA) utilizando membranas da Bio-Rad gel e aparelho de transferência. As membranas foram incubadas em 5% de leite inteiro ou de albumina de soro bovino durante 1 hora à temperatura ambiente, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguido de incubação com o anticorpo primário (tal como especificado) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram então lavadas e incubadas em anticorpo secundário adequado, à temperatura ambiente durante 1 hora, e os imunocomplexos foram visualizados utilizando o kit de detecção de quimioluminescência luzes ocidentais da Perkin-Elmer (Boston, MA). Os sinais foram quantificados utilizando o software ImageJ de acordo com os parâmetros descritos no guia do usuário ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Os valores médios de 3 blots diferentes são apresentados.

NFkB Luciferase Reporter Assay

Cignal NFkB kit de ensaio de repórter de Qiagen Inc. (Valencia, CA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, MDA-MB 231 ou células BT549 foram co-transfectadas com siWAVE3 ou siWAVE2 com repórter NFkB, controlos negativos e positivos, juntamente com um repórter de luciferase de Renilla construir por normalização interna. Após 24 h, as células foram tratadas com 50 ng /ml de TNF humano recombinante durante 30 min a menos que especificado de outra forma. Os ensaios de luciferase duplo (Promega, Madison, WI) foram realizadas numa placa de 96 poços utilizando Veritas Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA), e os valores de actividade de promotor são expressos em unidades arbitrárias após a normalização para a actividade da luciferase do repórter de Renilla. As experiências foram realizadas em triplicado e os desvios padrão dos valores são indicados.

Microscopia de imunofluorescência

As células foram cultivadas em lamelas de vidro e fixados em paraformaldeído a 4% durante 20 min em PBS à temperatura ambiente e lavou-se com PBS. As células permeabilizadas foram em seguida em 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 15 min, lavou-se novamente com PBS, e incubadas na solução de bloqueio contendo 5% de albumina de soro de bovino (Sigma) em PBS durante 2 h à temperatura ambiente. Primária, assim como anticorpos secundários foram diluídas até à concentração recomendada em 5% de albumina de soro bovino em PBS. As células foram incubadas com o anticorpo primário durante 1 h, lavou-se com PBS e depois incubadas com o anticorpo secundário durante 1 h. os filamentos de actina (actina F) foram coradas com faloidina-rodamina conjugada (Molecular Probes, Eugene, OR) em PBS. As lamelas foram montadas em lâminas de objectos utilizando meio de montagem Vectashield contendo 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As imagens de fluorescência foram capturadas usando uma Nikon microscopia TE2000-E invertido. Os sinais foram quantificados utilizando o software ImageJ de acordo com os parâmetros descritos no guia do usuário ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Os valores médios de 5 imagens diferentes foram representados graficamente.

Gelatina zimografia

geles de acrilamida a zimografia de gelatina (10%) foram preparados de acordo com procedimentos padrão [8]. A gelatina foi adicionada à solução de gel de gelatina a uma concentração final de 1 mg /ml. O sobrenadante isento de células foi misturado com 2 × tampão de amostra, incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos, e 25 ul de mistura foram carregadas nos geles. Após a electroforese, o gel foi incubado em tampão de renaturação zimograma com agitação suave durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de incubação em tampão de desenvolvimento zimograma a 37 ° C durante pelo menos quatro horas. actividade de gelatinase foi visualizado por coloração dos géis com Azul Brilhante de Coomassie G250 e descorados em ácido acético-metanol-DH

2O (01:03:06). Áreas de actividade protease foram fotografados com uma câmera SLR.

Invadopodia formação Ensaio

ensaios de degradação FITC-gelatina foram realizados de acordo com o procedimento do fabricante (Invitrogen). Em breve, lamelas (18 mm de diâmetro) foram revestidas com 50 ug /ml de poli-L-lisina durante 20 min à temperatura ambiente, lavou-se com PBS, fixadas com glutaraldeído a 0,5% durante 15 min e lavadas com PBS 3 vezes. Após a lavagem, as lamelas foram invertidas sobre uma gota de 0,2% de FITC gelatina conjugado em PBS contendo 2% de sacarose, incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente, lavou-se com PBS durante 3 vezes, extinguiu-se com boro-hidreto de sódio (5 mg /ml) durante três min e finalmente incubou-se em 2 ml de meio completo durante 2 h. As células (2 x 10

5 cada poço) foram plaqueadas em lamelas de cobertura revestidas com gelatina FITC e incubadas a 37 ° C durante 12 h. Invadopodia e ECM degradação foram documentadas usando microscopia de fluorescência confocal como descrito [27], [28]. análise de sinais e reconstrução de imagens em 3D foram realizadas utilizando o software ImageJ.

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de pelo menos três experiências independentes. Os resultados foram testadas para significância usando

t

teste de um Student não pareado. A

p

valor menor que 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Wave3 é necessária para a actividade NFkB

Para documentar a interação entre a sinalização Wave3 e NFkB , foi utilizado um ensaio de repórter NFkB-base de luciferase para avaliar alterações na actividade de NFkB na presença e ausência de Wave3. Como um controlo positivo para a activação de NFkB, utilizou-TNFa, um estimulador conhecido da sinalização de NFkB. Descobrimos que o tratamento com TNFa de MDA-MB-231 ou células BT549 aumento da actividade de NFkB em pelo menos 3 vezes em ambas as linhas celulares, em comparação com células não estimuladas (Fig. S1 S1 no ficheiro). No entanto, no Wave3-knockdown células (SH-W3) (Fig. 1A inserção), a actividade de luciferase, e, por conseguinte, a actividade de NFkB, foi reduzida em, pelo menos, 4 vezes em comparação com células MDA-MB-231 transfectadas com o controlo não-segmentação shRNA (Ctrl-sh) (Fig. 1A). Assim, Wave3 foi necessária para a actividade de NFkB. Esta inibição da actividade de NFkB era específica para a perda de Wave3 desde knockdown de expressão WAVE2, outra isoforma ONDA, não teve efeito sobre a actividade de NFkB (Fig. S2 em S1 do ficheiro).

à base de luciferase (A) ensaio de repórter NFkB no MDA-MB-231 células com transfecção estável de um shRNA não-alvo (Ctrl-sh) ou o Wave3-trageting shRNA (sh-W3). (Inserção) análise de transferência de Western de lisados ​​de proteína das células descrito em (a) com anticorpo anti-Wave3. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. (*, P 0,05). (B) Análise de Western blot com os anticorpos indicados de lisados ​​de proteína de Ctrl-sh MDA-MB-231 e dois clones shWAVE3 derivados diferentes (sh-W3-1 e sh-W3-2), antes e após o tratamento TNFa (50 ng /uL durante 15 min). Os números abaixo da p-p65 e painéis Wave3 indicar a alteração de dobragem P-p65 e níveis Wave3, respectivamente, em comparação com as células não tratadas Ctrl-SH. (C) Quantificação dos níveis de p-p65 nas condições indicadas. (D) Análise por Western blot com o anticorpo p65 de lisados ​​de fracções nucleares do Ctrl-SH e as células SH-W3 MDA-MB-231, com ou sem tratamento com TNFa. H2B foi utilizado como um controlo de carga para a fracção nuclear. Os números por baixo do painel de H2b indicar os níveis de dobragem mudança de p65 em relação às células não tratadas Ctrl-SH. (E) imuno-coloração para a translocação nuclear (setas brancas) da proteína p65 (vermelho) em Ctrl-SH e células shWAVE3 MDA-MB-231. Células núcleos são contra-coradas com DAPI (azul). (F) Quantificação da coloração nuclear p65. Todos os dados são representativos de 3 expericias independentes, ou são a média ± SD (n = 3; *, P 0,05; teste t de Student)

A fosforilação da subunidade p65 de NFkB na serina 536 e a sua translocação nuclear são medidas necessárias para a activação de NFkB. Encontrámos perda de Wave3 em células MDA-MB-231 para inibir de forma significativa os níveis de fosforilação de p65 (diminuição de 3 a 8 vezes) (Fig. 1B e 1C). Mesmo após estimulação com TNF, os níveis de p65 de fosforilação em células Wave3-knockdown não pôde ser restaurado aos níveis encontrados em não-alvo células shRNA-transfectadas (Fig. 1B e 1C). Resultados semelhantes foram encontrados em células BT549 (Fig. S3 no arquivo S1). Além disso translocação, nuclear de p65, que é o passo final na cascata da activação de sinalização de NFkB, foi também inibida de forma significativa em células MDA-MB-231 Wave3-knockdown, como medido pelos níveis de proteína p65 no núcleo (10 vezes diminuição), tanto por imunotransferência da fracção nuclear de lisados ​​celulares (Fig. 1D) e análise imunocoloração (decréscimo de 5 vezes) de células inteiras (Fig. 1E, 1F e a Fig. S4 no ficheiro S1). Mais uma vez, a estimulação de células Wave3-knockdown com TNFa não conseguiu aumentar p65 dentro da fracção nuclear para níveis encontrados nas células de controlo transfectadas com o controlo não-shRNA direccionamento (Fig. S4 no ficheiro S1). Juntos, estes dados suportam ainda o envolvimento de Wave3 na ativação da via de sinalização de NFkB.

Wave3 superexpressão ativa atividade de sinalização de NFkB

Para entender melhor como Wave3 modula a sinalização de NFkB, aplicamos uma combinação de meios genéticos e farmacológicos para manipular moléculas efectoras na via de NFkB. Em primeiro lugar, examinamos se superexpressão de Wave3 exógena pode afectar a actividade NFkB. Para fazê-lo, que sobre-expressa qualquer GFP sozinho ou proteína de fusão GFP-Wave3 em células MDA-MB-231 e avaliados para a actividade de NFkB. Utilizando o ensaio de repórter NFkB-base de luciferase descrito na Figura 1A, encontramos a sobre-expressão de Wave3 (Fig. 2A) estimulou a actividade de NFkB por aumento de 3 vezes (Fig. 2B). Consistente com esta observação, Wave3-overexpresion também estimulada ( aumento de 3 vezes) fosforilação p65 sem afectar os níveis de expressão total de p65 (Figura 2C.). Por outro lado, o tratamento com um inibidor específico de IKKβ (IKKβ-I), o activador a montante da sinalização de NFkB, embotada da estimulação mediada pelo TNFa de fosfo-p65 nos Wave3-sobre-expressam as células MDA-MB-231 (alteração de 0,9 vezes na TNFa e células-I-tratados vs. IKKβ alteração de 3,2 vezes em células tratadas apenas TNFa (Fig. 2D)). Assim, estes dados suportam ainda mais o papel da Wave3 na regulação da sinalização de NFkB. A seguir, a fosforilação da proteína p65 monitorizada e volume de negócios no GFP e Wave3-sobre-expressam as células MDA-MB-231 após tratamento com ciclo-hexamida (CHX), um potente inibidor de

de síntese de proteínas Novo. Embora os níveis de fosforilação de p65 foram aumentados (~3- para aumento de 4 vezes) nas células que sobre-expressam Wave3, o tratamento com CHX não afectou os níveis de p65 total (Fig. 2E) de expressão. Da mesma forma, o tratamento com MG-132, um composto que inibe a degradação de proteínas mediado por proteassoma, não afectou o aumento Wave3 mediada por p65 fosforilada na Wave3 células que sobre-expressam (Fig. 2F), enquanto que os níveis de p65 total manteve inalterado ( A Fig. 2F). Assim, estes dados demonstram que a modulação Wave3-mediada de sinalização de NFkB não requer o envolvimento de Wave3 em proteína neo-síntese (dados CHX, a Fig. 2E) ou t degradação de proteínas mediado-proteassoma (os dados MG-132, Fig . 2F).

(A) análise de Western blot dos níveis de proteína Wave3-GFP em GFP e células GFP-W3-expressam. (B) à base de luciferase repórter NFkB no ensaio de GFP e GFP-Wave3 expressando células (*, P 0,05). (C D) análise de transferência de Western com os anticorpos indicados de lisados ​​celulares a partir da GFP e células que expressam Wave3-GFP. Os números por baixo do painel de GFP indicar as mudanças de níveis de p-p65 vezes em relação às células GFP. (E F) análise de transferência de Western com os anticorpos indicados de lisados ​​celulares a partir da GFP e Wave3-GFP expressando células após o tratamento com ciclo-hexamida (CHX, E) e o inibidor de proteassoma MG132 (F). Os números por baixo do painel de GFP indicar as mudanças de níveis de p-p65 vezes em relação às células GFP. p-actina foi utilizado um controlo de carga. Todos os dados são representativos de 3 expericias independentes, ou são a média ± SD (n = 3; *, P 0,05; teste t de Student)

Wave3 modulação mediada por NFkB da sinalização não faz exigir outros membros da onda reguladora

complexo

Wave3, tal como os outros membros da família WASP /ONDA, é conhecida por funcionar como um activador do complexo Arp2 /3 para promover a polimerização de actina do citoesqueleto e remodelação. Para as proteínas de onda para executar esta função reorganização do citoesqueleto, que devem ser incorporados um complexo proteína pentamérica, também referido como o complexo regulador ONDA (CMR) que, em adição para acenar proteínas, contém também NAP1, ABI1 /2, CYFIP2 e HSPC300 [29]. Dessa forma, abordou a questão de saber se a modulação Wave3 mediada por sinalização de NFkB requer o envolvimento de outros membros do WRC. Em primeiro lugar, mostrou que knockdown enquanto siRNA-mediada de Wave3 resultou numa inibição significativa ( diminuição de 8 vezes) de expressão Wave3, não afectou os níveis dos outros quatro membros do WRC de expressão (Fig. 3A). Por outro lado, os siRNAs dirigidos quer contra ABI1 ou CYFIP2, o que resultou na perda selectiva da expressão dos respectivos objectivos, não afectou os níveis de outros membros da CMR (Fig. 3A) de expressão. Funcionalmente, e como esperado, Wave3-knockdown inibida NFkB sinalização (decréscimo de 5 vezes), tal como medido pela perda de fosforilação de p65 (Fig. 3B). No entanto, a diminuição da expressão de qualquer um dos outros membros do WRC (ABI1 e CYFIP2) não afectou os níveis de fosforilação da p65 (Fig. 3B). Além disso, enquanto que a estimulação com TNF aumento dos níveis de p65 de fosforilação em ambas as células de knockdown de controlo e, os níveis de fosforilação nas células Wave3-knockdown eram mais de duas vezes menor do que nas células de ARNsi de controlo ou ABI ou CYFIP2 siRNA células (Fig. 3B). Juntos, estes resultados sugerem claramente que a modulação mediada por Wave3 de sinalização de NFkB não requer a participação dos membros do WRC, e, por conseguinte, representa uma actividade de Wave3 independente da sua propriedade tradicional polimerização de actina dentro do WRC.

(a) análise de transferência de Western com os anticorpos indicados de MDA MB-231 transfectadas transitoriamente com um não-targeting siRNA (Ctrl-Si) ou siRNA alvejando quer Wave3 (Si-W3), ABI1 Si-ABI1), ou CYFIP2 (si-CYFIP2). (B) análise por Western blot com p-p65 e p65 total de anticorpos a partir dos lisados ​​celulares descritos em (A). Os números por baixo do painel de β-Actina indicar as mudanças de níveis de p-p65 vezes em relação às células não tratadas Ctrl-si. Em ambos (A) e (B), β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

Expressão e actividade de MMP9, um importante gene alvo NFkB, são inibidos por perda de Wave3

Demonstrámos anteriormente que knockdown estável de resultados Wave3 na perda de expressão e a actividade de várias MMPs, incluindo MMP1, 3 e 9 [8]. Entre estas MMPs, MMP9 é um alvo importante da via de NFkB, levantando a possibilidade de que Wave3 pode estar envolvido na regulação mediada por NFkB da MMP9. Em primeiro lugar, utilizou-se transferência Western para demonstrar que a expressão de MMP9 foi inibida, como resultado de knockdown estável de Wave3; a diminuição da proteína de MMP9 foi ~ 5 vezes na MDA-MB-231 (Fig. 4A) e ~ 4 vezes em células BT549 (Fig. S5 S1 no ficheiro). De nota, os níveis da WAVE1 e WAVE2 expressão não foram afetados pela perda de Wave3, e, portanto, não têm qualquer influência sobre as alterações dos níveis de MMP9 causadas por Wave3-knockdown (Fig. 4A). Em seguida, utilizou-se o ensaio de zimografia de gelatinase para mostrar actividade MMP9 foi também inibida (decréscimo de 5 vezes) nas células Wave3-knockdown (Fig. 4B). Além disso, a estimulação com TNFa, o qual é um importante activador da via de sinalização de NFkB, reforçada (aumento ~3.5 vezes) MMP9 actividade nas células de controlo (CTRL-SH). No entanto, em células Wave3-knockdown, a estimulação com TNFa foi incapaz de activar MMP9 aos níveis observados em células de controlo (Fig. 4C). Assim, estes resultados sugerem que a regulação mediada por Wave3 de MMP9 pode ser exercida por meio da modulação da sinalização de NFkB. Portanto, a expressão e a actividade de níveis de MMP9 podem ser utilizados como leitura para modulação Wave3-mediada de níveis de activação NFkB.

(A) análise de transferência de Western com os anticorpos indicados de lisados ​​celulares de MDA MB-231 transfectadas células com shRNA não-alvo (Ctrl-sh), e dois clones sh-Wave3 diferentes (sh-W3-1 e sh-W3-2). Os números abaixo da Wave3 e MMP9 painéis indicam os níveis de dobragem mudança Wave3 e MMP9 em relação às células não tratadas Ctrl-SH. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) zimografia de MMP9 ativado e MMP2 em meios condicionados dos Ctrl-sh dois clones sh-W3. C) zimografia de MMP9 activado antes e após o tratamento com TNFa nos meios condicionados dos dois clones sh-W3 Ctrl-sh e. Em ambos (B) e (C), os géis vermelho Ponceau-coradas são mostradas como controlos de carga. Os números abaixo dos painéis de zimografia indicar a alteração de dobragem dos níveis de MMP9 em relação às células não tratadas Ctrl-SH.

Wave3 é necessária para a formação e degradação de ECM invadopodia NFkB através de sinalização

o significado biológico da perda de Wave3 e o seu efeito sobre a sinalização de NFkB foram investigadas através da capacidade das células cancerosas de modo a formar invadopodia e degradam a ECM, ambos os quais necessitam de activação MMP9 impulsionado pela sinalização de NFkB. As células MDA-MB-231, como linhas de células de cancro mais altamente invasivos, formar invadopodia

In vitro

quando semeadas em componentes da matriz extracelular. Para monitorizar a actividade dentro de MMP9 invadopodia, células MDA-MB-231 foram revestidas sobre lamelas revestidas com gelatina fluorescentes. Após a coloração de F-actina, invadopodia foram observados como aglomerados de ponto semelhante de actina F na superfície ventral das células que está em contacto directo com o substrato de gelatina (painel a Fig. 5A). Estas estruturas invadopodia se sobrepõem com os locais de degradação da matriz de gelatina (Fig. 5A, painéis b e c) e pode ser visualizado em três dimensões (3-D) a reconstrução da imagem como invaginações no leito de gelatina (Fig. Painel 5A d) . Cortactina é um marcador bem conhecido por invadopodia (Fig. S6 no arquivo S1). Nós descobrimos que o tratamento TNFa de MDA-MB-231 resultou na co-localização de Wave3 com cortactina em estruturas invadopodia (Fig. 5B), em consonância com o envolvimento de Wave3 na formação invadopodia.

(A) confocal microscópica micrografias das células MDA-MB-231 cultivadas em gelatina marcada com FITC e coradas para (a) os filamentos de actina F (vermelho). A seta cabeças brancas apontam para estruturas invadopodia (manchas brancas). (B) Áreas de degradação ECM (seta-cabeça preta) são mostrados como pontos negros. As estruturas invadopodia coincidem com as áreas de degradação de ECM na imagem resultante da concentração (c). (D) Na imagem reconstruída 3-dimensional as setas pretas apontam para invadopodia (vermelho) se infiltrar na cama de gelatina (verde). (B) micrografia microscópicos confocal de células MDA-MB-231 crescidas em lamelas revestidas com colagénio, tratadas com TNFa (50 ng /mL) durante 15 min, e coradas para Wave3 (painel da esquerda) e cortactina (painel do meio). A seta-cabeças apontam para áreas com invadopodia onde ambos cortactina e Wave3 colocalize na imagem mesclada no painel direito (manchas amarelas).

Foi utilizado neste ensaio invadopodia à base de gelatina para avaliar o efeito do Wave3 na formação de invadopodia e, subsequentemente, a degradação da ECM por células MDA-MB-231. Encontrou-se uma redução significativa tanto no número de invadopodia (Fig. 6A, painel da esquerda e a Fig. 6B), bem como a área total da degradação mediada por invadopodia de gelatina em células Wave3-knockdown em comparação com o controlo shRNA não segmentação (Ctrl-SH), as células MDA-MB-231 (Figura 6A, painel médio e a Fig. 6C). Houve mais de 3 vezes menor (p 0,05) no número de invadopodia (Fig 6B.) E mais do que 10 vezes menor (p 0,05) na área de degradação de ECM nas células Wave3-knockdown em comparação com o as células de controlo (Fig. 6C). Enquanto os nossos dados mostram que a perda de Wave3 inibe tanto a formação invadopodia e degradação de ECM, este fenómeno parece afectar a maioria das células observadas ao microscópio, e análise cuidadosa dos nossos dados não encontrou um decréscimo no número de células que formam invadopodia e degradam a ECM, em vez disso, a perda de Wave3 parece ter um efeito global. O tratamento com TNF, o que resultou num aumento significativo no número de invadopodia nas células de controlo (p 0,01), não foi capaz de salvar a inibição da invadopodia causado pela perda de Wave3 (Figura 6D . 6E). Por outro lado, a sobre-expressão de Wave3 nas células não-invasivos MCF7 BC (Fig S7A no ficheiro S1), que tinha mostrado previamente para estimular a sua capacidade de invasão [30], resultou num claro aumento em ambos formação invadopodia e degradação de gelatina por TNFa As células estimuladas (Fig. S7B no arquivo S1).

(a) de microscopia confocal de controle shRNA- ou sh-Wave3 expressam MDA MB-231 células cultivadas em gelatina FITC e coradas para F filamentos de actina (painéis esquerda). A seta cabeças brancas apontam para estruturas invadopodia (manchas brancas).