Abstract

Para mais de uma década, a citocina interleucina-12 (IL-12 ) tem sido utilizado, quer sozinho ou em combinação com outras drogas, como um tratamento para o cancro. As numerosas propriedades anti-tumorais de IL-12 ainda gerar interesse na utilização clínica desta citocina, embora tenha demonstrado toxicidade quando administrado sistemicamente. Como uma abordagem para superar esta toxicidade, numerosos laboratórios têm tentado induzir a expressão de IL-12 no local do tumor. No entanto, para os tumores que são difíceis de remover cirurgicamente ou para o tratamento de metástases disseminadas, a expressão sistémica desta citocina ainda permanece como o método mais eficaz de administração. No entanto, encontrar as abordagens alternativas para o uso da IL-12 no tratamento de cancro e revelando a base de efeitos secundários-12-IL permanecem como um desafio. No presente trabalho, nós demonstramos que a expressão sistémica de IL-12 através de injecção hidrodinâmico de ADNc de IL-12 é capaz de induzir diferentes tipos de lesões hepáticas associadas a uma patologia tóxico. No entanto, relatamos aqui que a toxicidade hepática é diminuída e a sobrevivência de ratinhos melhoradas na ausência de factor de necrose tumoral alfa (TNFa). Esta observação está em contraste com vários modelos murinos e ensaios clínicos que postulam o interferão gama (IFNy) como a citoquina principal responsável pela toxicidade de IL-12. Além disso, o nosso trabalho demonstra que, quando ADNc de IL-12 é co-injectado com IL-18 de cDNA, ou quando os ratos são pré-tratados com uma dose baixa de ADNc de IL-12 antes de receber uma dose elevada de IL-12 de cDNA, os níveis sistémicos de TNF são quase totalmente revogada, o que resulta em maior sobrevida e menor dano hepático. Importante, a revogação de sinalização de TNFa não afecta a actividade anti-tumoral forte de IL-12. Assim, o TNFa neutralizantes com antagonistas já aprovados para uso humano oferece uma abordagem promissora para ab-rogar a IL-12 efeitos secundários durante a utilização desta citocina para o tratamento de cancro

citação:. Barrios B, Baez NS, Reynolds D , Iribarren P, Cejas H, Jovem HA, et al. (2014) Revogação de TNFa Produção durante o cancro imunoterapia é crucial para suprimir efeitos colaterais devido à expressão sistémica de IL-12. PLoS ONE 9 (2): e90116. doi: 10.1371 /journal.pone.0090116

editor: Irving Coy Allen, Virginia Tech University, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de setembro de 2013; Aceito: 27 de janeiro de 2014; Publicação: 28 de fevereiro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este projecto foi financiado em parte com recursos federais do Programa de Pesquisa Intramural do Centro de Câncer Research, National Cancer Institute (NCI) , National Institutes of Health, e também pela Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (Argentina) e Secretaria de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de Córdoba (SeCyT-UNC, Argentina). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o imunomodulador e funções anti-angiogénicos da IL-12 forneceram a base racional para a exploração desta citocina como um agente anticancerígeno. Mais de uma década atrás, os ensaios clínicos a administração de IL-12 para o tratamento de tumores, incluindo o linfoma de células T [1], linfoma não-Hodgkin [2], o melanoma [3], o cancro do ovário [4], do sarcoma de Kaposi [5] , carcinoma renal e [6] foram iniciadas. Sistémica de IL-12 mostrou-se capaz de suprimir o crescimento de tumores, metástases, e angiogénese

In vivo

[7] – [11], mas o seu uso tem sido associado com a dose significativa e toxicidade dependente da programação, que representa um obstáculo importante para a sua aplicação clínica [1], [3], [4], [6], [7]. toxicidade de Grau 1-4, tem impedido o uso de IL-12 como uma terapia de cancro. No entanto, abordagens alternativas para o uso da IL-12 estão sob investigação intensiva em modelos animais de cancro e em ensaios clínicos recentes [12] – [16]

Vários ensaios clínicos que utilizam a IL-12 demonstraram que o aumento da. os níveis de IFN-y de citocinas inflamatórias foram associados a diferentes graus de hepatotoxicidade e outros efeitos secundários tóxicos [2], [4], [6], [17]. Além disso, em vários modelos murinos, a expressão de IFNy induzida por IL-12 após administração mostrou ser responsável pela maior parte dos efeitos adversos observados [18] – [21].

Utilizando diferentes modelos de tumores de murinos, dispomos previamente relatado que os níveis sistémicos de IL-12 isoladamente ou em conjunto com IL-18, induzidas após a injecção hidrodinâmico dos respectivos ADNc, anulou completamente o crescimento do tumor subcutâneo e pulmonar e metástases hepáticas [10]. Além disso, a co-expressão de IL-12 + IL-18 foi capaz de melhorar a sobrevivência por diminuição dos efeitos colaterais-12-IL [10]. Nossos trabalhos anteriores demonstraram também que IFN-y foi parcialmente responsável pelos efeitos colaterais-12-IL. Além disso, os nossos dados demonstraram que o aumento da sobrevivência de IL-12 + ratinhos IL-18 tratadas com precoce está associada a IL-10 e uma redução dos níveis séricos de IFNy e TNFa [10]. Neste contexto, o presente trabalho demonstra que, usando injecção hidrodinâmico para induzir a co-expressão sistémica de IL-12 + IL-18 ADNc ou por pré-injecção de uma dose baixa de ADNc de IL-12 antes de uma dose elevada de IL-12 cDNA, observamos aumentou significativamente a sobrevivência e hepatotoxicidade diminuída. Curiosamente, ambos os métodos demonstram que esse efeito é altamente associado com a revogação de expressão TNF, uma citocina inflamatória que também desempenha um papel patológico em choque sepse e

in vivo

tratamento LPS [22] – [25]. Em conjunto, os dados apresentados neste trabalho contribui para a nossa compreensão da base para efeitos colaterais-IL-12 sistémica. Além disso, propõe-se que, dependendo do sistema utilizado para induzir sistémica de IL-12 de expressão; diferentes mediadores tóxicos poderiam ser os protagonistas de efeitos colaterais adversos. Além disso, os dados apresentados neste manuscrito pode servir como a base para o desenvolvimento de novas abordagens para diminuir a IL-12 toxicidade ao projetar futuras terapias para tratamento de câncer envolvendo essa citocina.

Materiais e Métodos

ratos e linhas celulares

C57BL /6 (B6) ratos, 6-10 semanas de idade, foram usados ​​e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. Induzível da óxido nítrico sintase (iNOS) knock out (KO), TNFa KO e TNFa receptores um camundongos (TNFαR1) KO em um /6 background genético C57BL foram adquiridos a partir dos Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, EUA. cuidados com os animais foi fornecido de acordo com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH-Publication No. 86-23, 1985). Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use of Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Imunologia (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). O nosso biotério obteve NIH garantia de bem-estar animal (garantia nenhuma. A5802-01, Office of Laboratory Animal Welfare, NIH, Bethesda, MD, EUA). A fim de evitar o sofrimento dos animais, os ratinhos foram rapidamente sacrificados por deslocamento cervical. Durante a injeção de células interna do baço (I.S.) do tumor, menor tempo de cirurgia foi aplicada e as incisões foram feitas como mínimo possível durante o procedimento. Durante a recuperação da cirurgia, os murganhos foram colocados em cobertores quentes e os seus olhos foram hidratados com uma solução salina. Os animais foram colocados de volta em gaiolas após a recuperação plena da cirurgia.

células de melanoma B16-F10 foram obtidas da American Type Culture Collection. A linha celular foi livre de infecção por Mycoplasma e testado por PCR a cada 6 meses. células de melanoma B16-F10 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e aminoácidos não essenciais a 37 ° C, 5% de CO

2.

hidrodinâmica injecções de ADNc

O processo de transferência de genes hidrodinâmica tem sido descrito anteriormente [10], [26]. Resumidamente, os animais foram injectados na veia da cauda em menos de 8 segundos com os respectivos ADNcs dissolvidos em 1,6 ml de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% e divididos em 3 grupos, de controlo: 5-15 ug de ADNc de controlo de vector vazio ORF, IL 12: 5 ug de IL-12 cADN (pscIL-12, gene de fusão p40-p35) e de IL-12 + IL-18: 5 ug de IL-12 cADN (pscIL-12, gene de fusão p40-p35) mais 10 ug de ADNc de IL-18 (Pdef Pro-IL-18). Todos os plasmídeos de expressão utiliza o promotor de alongamento 1-α humana para conduzir a transcrição.

O

In vivo

efeitos observados sobre a indução de citoquinas são puramente devido à expressão dos cDNAs de citocinas e não por LPS contaminação. ratinhos WT e KO de RST4 desenvolver níveis e cinética da expressão de TNFa após semelhantes a IL-12 de tratamento de cDNA, indicando assim a ausência de LPS na preparação de ADNc de citocinas utilizada para injecção (dados não mostrados).

amostras

baço

Para a análise de citocinas de

in vitro

células estimuladas, os baços foram esmagados, esgotadas de células vermelhas por incubação em tampão ACK (Biowhittaker, Walkersville, MD), lavadas e ressuspensas em meio suplementado (RPMI 1640 lise, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 5 × 10

-5 M de 2-mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e aminoácidos não essenciais). As suspensões de células foram contadas e estimulada

In vitro

com meios suplementados, anti-CD3 revestidas de anticorpo (Ab) (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) a 2 ug /mL ou LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 1 ug /ml durante 72 h numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO

2.

ensaios

citocina e ALT

Os soros foram ensaiados quanto a citocina produção por ELISA de acordo com as instruções dos fabricantes. Os kits utilizados foram: mIL-10, mIFNγ, mTNFα (BD-Pharmingen, La Jolla, CA). Alanina aminotransferase (ALT) soros foram determinados utilizando um kit colorimétrico específico (Wiener Laboratories) e seguindo as instruções do fabricante.

análise histopatológica de tecido hepático

Fígados obtidos de camundongos no tratamento diferente grupos foram colhidas no dia 15 pós-tratamento de ADNc, fixadas em formaldeído a 4% e embebidos em parafina. 6 mm seções foram preparadas e hematoxilina /eosina (H /E) ou ácido periódico de Schiff (PAS) manchas foram aplicadas nas seções. Seções, sem identificação, foram analisadas para alterações teciduais ao microscópio óptico por um patologista.

A citometria de fluxo análise

Para a coloração multicolor, Abs fluorocromo conjugado (BD-Pharmingen, La Jolla, CA ) contra marcadores de linhagem foram usadas em várias combinações. Resumidamente, receptores de Fc em células foram bloqueadas com um anticorpo anti-CD16 /32 Ab durante 30 min a 4 ° C e lavadas. As células foram então coradas para marcadores de superfície durante 30 minutos a 4 ° C, lavadas duas vezes e analisadas por citometria de fluxo com um BD FACS Canto ™ II citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Para a triagem de citometria de fluxo de células, a partir de esplenócitos IL-12 + IL-18-ADNc ratinhos tratados foram corados com o fluorocromo-CD4 marcado (clone RM4-5), CD8 (clone 53-6,7), CD11b (clone M1 /​​70) e CD11c (HL3 clone) anticorpos (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) e classificado para uma pureza de 97-99% usando um classificador MoFlo (Dako Cytomation).

extração de mRNA e análise

O ARN total foi isolado utilizando um procedimento de extracção com fenol /clorofórmio em passo único (Trizol; Invitrogen Life Technologies). RT-PCR foi realizada com 100 ng de ARN total para cada amostra (Super Script III um passo de RT-PCR com Taq Platinum, Invitrogen), que consiste em uma reacção de transcrição inversa de 15 minutos a 45 ° C, 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C (15 s), emparelhamento a 55 ° C (30 s) e extensão a 68 ° C (60 s), com uma extensão final de 5 min a 68 ° C. Os iniciadores utilizados foram:. INOS, sentido 5′-GCA TTT GGG AAT GGA GAC TG-3 ‘, 5′-antisense GTT GCA TTG GAA GTG AAG CGT TTC-3’

Western immunoblotting

Os esplenócitos foram lisadas com tampão de lise gelado a 150 ul e centrifugou-se a 14.000 rpm, 4 ° C durante 5 min. Proteínas extractos foram sujeitos a electroforese num gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para uma Immun-Blot de PVDF membrana (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite, 0,1% de Tween-20 em TBS durante a noite a 4 ° C e em seguida foram incubadas com anticorpos primários durante 3 h à temperatura ambiente. Após a incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA), as bandas de proteína foram detectadas com um substrato Super sinal quimioluminescente (Pierce) e filme Biomax MR (Eastman Kodak, Rochester, NY).

Arginase Ensaio de Actividade

de Triton X-100 (0,1%, 100 ul) foi adicionado às peletes de esplenócitos que foram, então, tratadas como indicado. Após 30 min de incubação, Tris-HCl e MnCl

2 mistura (100 ul) foram adicionados às células durante 10 minutos a 56 ° C. As placas foram incubadas com L-arginina (100 uL) a 37 ° C durante 30 minutos, e, em seguida, um H

2SO

4 /H

3PO

4 /H

mistura 2O ( 800 ul) foi adicionado e aquecido com acetona α isopropilideno-nitrobenzeno (50 uL) a 95 ° C durante 30 min. O complexo em cada poço foi diluída 20 vezes com PBS para detectar a densidade óptica (OD) a 540 nm, valores com um espectrofotómetro de UV.

ensaio de metástases hepáticas e crescimento tumor subcutâneo

C57BL /6 e murganhos KO eram TNFαRI está injectados com células de melanoma B16-F10 (0,5 × 10

6 células /solução de cloreto de sódio a 0,5 ml de 0,9%) para a análise de metástases hepáticas. Três dias mais tarde, os ADNc foram entregues por injecção hidrodinâmico. Onze dias mais tarde, os fígados foram recolhidas e o número de metástases foi determinado sob um microscópio de dissecação.

Para avaliar o crescimento do tumor subcutâneo, ratinhos C57BL /6 e TNFαRI KO foram rapados e injectados s.c. no flanco esquerdo com 1 × 10

6 células de melanoma B16-F10 em 0,2 ml de uma solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%. Após 10-14 dias, quando os tumores sólidos foram visível (4-5 mm de diâmetro), os ratinhos foram injectados com hidrodinamicamente os cDNAs designados. O crescimento do tumor foi monitorizado com um compasso de calibre. Dia 0 corresponde ao dia em que cDNAs foram administrados.

A análise estatística

Para significância estatística, os dados foram analisados ​​por meio de um Student não pareado

t

teste (comparação de 2 grupos experimentais) ou teste de ANOVA (composição de mais do que 2 grupos experimentais) com p 0,05 considerada significativa. teste não paramétrico (teste de Kruskal-Wallis) foi utilizado quando

n

foi inferior a 10. curvas de sobrevida de camundongos foram plotados como Kaplan – Meier, utilizando GraphPad Prism versão 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) e a p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Alterações nos números de leucócitos após expressão sistémica de IL-12 ou IL-12 + IL18

Nós já demonstraram isso. depleção de células T e células NK /NKT aumenta a sobrevivência de ratinhos tratados com IL-12 [10]. No entanto, uma toxicidade residual persiste após a depleção //célula NKT NK T, sugerindo que outros tipos de células também poderiam ser parte dos efeitos de IL-12-adverso [10]. Como um primeiro passo para investigar esta questão foram analisadas as mudanças relativas no número de leucócitos presentes no baço (e fígado, não mostrado), em comparação com ratinhos de controlo. Como visto na Figura 1, os números de NK e NKT subconjuntos são altamente reduzida até 50 dias pós-tratamento a seguir à administração quer de IL-12 ou IL-12 + IL-18 ADNc. Estes dados parecia bastante surpreendente uma vez que a depleção de células /NKT NK correlaciona-se com a melhoria na sobrevivência de ratinhos tratados com o ADNc de IL-12. No entanto, quando foi avaliado o fenótipo das células NK obtidos a partir de ratinhos IL-tratados com 12, observou-se que eles expressam altos níveis de IFN-y e o marcador de activação precoce de CD69 (dados não mostrados). Estes dados sugerem que, embora eles são encontrados em números muito baixos, as células /NKT NK demonstrar um fenótipo activado e, portanto, pode ser parcialmente responsável pela toxicidade observada após expressão sistémica de IL-12.

C57BL /6 murganhos hidrodinamicamente foram injectados com controlo, IL-12 e /ou IL-18 ADNc. Até 50 dias pós-injecção, os animais foram sacrificados e foram obtidas suspensões de células únicas de células esplénicas. A percentagem dos diferentes subconjuntos foi obtida por coloração linhagem superfície com a combinação dos seguintes: Abs NK1.1, CD3, CD11b, CD19, CD4 e CD8 e analisadas por citometria de fluxo. os números de células relativos das diferentes populações de células foram calculados dividindo-se os números de células absolutos obtidos a partir dos ratinhos tratados com citocina pelas número absoluto de células obtidas a partir de ratinhos de controlo. Os dados são expressos como a média de um conjunto de 4 experiências diferentes (total n = 12 ratos por grupo). * 12 + 18 e 12 vs controle de p 0,05,

# 12 vs 12 + 18 p . 0,05

Também observamos uma alteração do número de linfócitos T após a administração de cDNA de citocinas. Enquanto CD4

+ T células mostram uma celularidade menor durante a maioria dos períodos analisados, CD8

+ células T passam por uma expansão em números durante a primeira semana após o tratamento, mas, em seguida, posteriormente, retornar aos níveis normais (Fig.1).

em seguida foi avaliada a população de macrófagos (MO), nos ratinhos tratados. IL-12 isoladamente induz um aumento no início números MO enquanto, em contraste, o número destas células em IL-12 + IL-ratinhos tratados com 18 não está expandido (dias 2 e 3 pós-tratamento). Além disso, mesmo apesar de o número MO atingir um pico mais elevado de IL-12 + IL-18 ratinhos tratados no dia 10, regressam a níveis normais durante o dia 50 pós-tratamento, enquanto o número de MO no grupo IL-12, tratada ainda é elevada . O facto de um papel patogénico para essas células em um outro modelo murino de IL-12 + IL-18 de expressão sistémica foi previamente relatada [19], os autores sugerem que os mediadores produzidos por MO poderia ser responsável, pelo menos em parte, para o tóxico Os efeitos colaterais observados após o tratamento de IL-12 sistémica.

O balanço entre o óxido nítrico (nO) a expressão e a actividade da arginase sugere um perfil mais inflamatória em macrófagos de IL-12-tratados em comparação com a IL-12 + IL-18 ratinhos tenha sido tratada com

em seguida, investigámos o papel do nO como uma base para efeitos colaterais-12-IL NÃO como é conhecido por ser induzida por MO na presença de IL-12 + IL-18 [27] . A geração de NO por neutrófilos e monócitos é aumentada em pacientes sépticos e sua persistência está associado com um resultado clínico pobre [28]. Além disso, a formação excessiva de NO desempenha um papel importante na patogénese de choque e falência múltipla de órgãos durante a sépsia e na lesão pulmonar aguda [29]. Neste contexto, nós primeiramente analisados ​​se NO /iNOS é expressa em nosso modelo experimental. Como pode ser visto na Figura 2A, iNOS expressão de ARN é significativamente regulada para cima em ambos IL-12 e IL-12 + 18 ratos tratados com início após a administração de ADNc e persiste durante pelo menos 15 dias após o tratamento (dados não mostrados). Curiosamente, a análise de proteínas revelou que, após 15 dias de pós-tratamento, a expressão de iNOS ainda é sobre-regulada em ratinhos tratados com IL-12, mas menor ou nenhuma expressão é observada em IL-12 + IL-tratado com 18 ratinhos (Fig. 2B) . Além disso,

In vitro

nenhum níveis avaliados no dia 15 pós-tratamento de esplenócitos estimulados com LPS mostraram uma menor expressão em células obtidas a partir de IL-12 + IL-tratado com 18 ratinhos (dados não mostrados). Estes dados levou-nos a determinar se a menor expressão de iNOS /NO em IL-12 + IL-18 ratinhos tratados com o resultado poderia explicar a sobrevivência melhorada observada neste grupo, em comparação com ratinhos tratados com IL-12 [10]. Surpreendentemente, quando monitorizada a sobrevivência em ratinhos WT e KO de iNOS após a administração de IL-12 ou IL-12 + IL-18 cADN, observou-se que a falta de expressão de iNOS não melhorar a resistência aos tratamentos (fig. 2c). Estes resultados levaram-nos a hipótese de que o NO pode não estar diretamente envolvido como mediador tóxicos destes tratamentos, mas a relação entre MO NO /expressão arginase poderia estar fornecendo informações sobre o ambiente inflamatório resultante dos diferentes tratamentos. Por conseguinte, a Figura 2D mostra que os esplenócitos de ratinhos IL-tratado com 12 têm significativamente menor actividade da arginase, quando comparado com os esplenócitos de IL-12 + ratinhos tratados com IL-18. Juntamente com os dados de iNOS, conclui-se que a razão NO /arginase é mais elevada em ratinhos tratados com IL-12 sozinho do que em ratinhos tratados com IL-12 + IL-18. Este resultado sugere que o tratamento com IL-12 + IL-18 induzida por um fenótipo de macrófagos inflamatória menos, quando comparado com os ratinhos tratados com IL-12.

(a) a análise de RT-PCR da expressão do gene iNOS em esplenócitos obtidos a partir de ratinhos injectados com o ADNc, designadas 12 + 18 e 12 vs controlo p 0,05. (B) análise por Western blot de extractos proteicos de esplenócitos obtidos a partir de murganhos injectados com os cDNAs designados, 12 vs. 12 + 18, p 0,05. (C) Sobrevivência monitorizada em B6 (WT) ou ratinhos KO iNOS nos dias pós-IL-12 ou IL-12 + IL-18 de injecção-ADNc. atividade Arginase (D), medido determinação dos níveis de ureia no 1 × 10

6 esplenócitos. Os dados em A, B e D são expressos como a média de 2 experiências diferentes, com 4-5 ratinhos por grupo. A curva de sobrevivência foi construído como um conjunto de 2 experiências diferentes com 5 ratinhos por grupo. * 12 + 18 vs 12 p . 0,05

A expressão de IFN-y, TNFa e IL-10 após a IL-12 + IL-18 tratamento

Nós relataram que, em IL 12 + IL-18 ratinhos tratados com, primeira expressão de IL-10 controla os níveis de citocinas inflamatórias IFNy e TNFa [10]. No entanto, mesmo que realizadas estas experiências, esgotando diferentes populações de leucócitos e avaliar a sobrevivência em cada caso, não foi possível identificar as fontes de citocinas [10]. Para investigar esta questão, foi avaliada a produção de IL-10, IFN-y e TNF a partir de esplenócitos ordenados obtidos a partir de IL-12 + IL-tratados com 18 ratos no dia 3 pós-tratamento, um ponto no tempo em que tínhamos observado anteriormente produção dessas citocinas (Figura 3). Observou-se que TNF é altamente produzido por CD8

+ células T e CD11b

+ mais CD11c

+ células (MO, as células dendríticas (DCs) e células natural killer (NK) ordenados em conjunto). Uma vez que as células NK e células dendríticas representam uma pequena população de esplenócitos nesses camundongos (Fig. 1 e dados não mostrados), que classificados todas estas células em conjunto para aumentar o número de células recuperadas. Para determinar a contribuição de MO sozinho, avaliou-se a expressão de citoquinas em culturas de esplenócitos aderentes enriquecidas ( 85% MO) e observou-se que estas células também expressaram niveis elevados de TNFa. Esta observação sugeriu que a expressão de TNFa pode vêm principalmente de MO, em vez de os dois outros tipos de células presentes na CD11b /c

+ ordenada grupo (Fig. 3A). Em contraste, a IFN-y é expresso por células T CD4

+ e CD8

+ células T mas não a partir de MO, demonstrando que CD11b /c expressão é provavelmente devido à presença de células NK neste grupo (Fig. 3B). Curiosamente, a IL-10 é produzida por células T CD4

+ células T e também pelas DCs ou células NK, mas não por MO (Fig. 3C). Estes dados sugerem que a depleção de células T, NK e NKT, poderia eliminar as fontes de IFN-y (como relatado anteriormente [10]), mas MO ainda permanecem como uma fonte muito importante de TNFa. Esta conclusão é provavelmente porque o esgotamento dos linfócitos apenas parcialmente melhoradas de sobrevivência em ratinhos tratados com IL-12 [10]. Além disso, o facto de o perfil MO parece ser mais inflamatório com base nos dados de arginase /NO, poderia explicar por que os ratinhos tratados com IL-12 exibem sobrevivência muito menor do que IL-12 + ratinhos tratados com IL-18.

esplenócitos de IL-12 + IL-18 ratinhos foram obtidos e coradas com anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD11b /c fluorocromo marcado ABS e, em seguida, classificados para um grau de pureza de 97-99%, utilizando um separador MoFlo (Dako Cytomation). As células seleccionadas foram então cultivadas na presença de Ab anti-CD3 revestido (2 ug /ml) e LPS (1 ug /ml) durante 72 h. Os sobrenadantes foram então colhidos e (A) TNFa, (B) IFNy e (C) de IL-10 de expressão foram avaliados por ELISA. Os dados são expressos como a média de 2 experiências diferentes, com 4-5 ratinhos por grupo. * Estimulados vs não estimulada, p . 0.001

TNF é uma citocina importante que medeia IL-12 toxicidade sistémica

Para investigar o papel do TNFa como um mediador tóxico após IL expressão sistémica -12, analisámos a sobrevivência de TNFa KO ou ratinhos KO TNFαR1 após o tratamento de IL-12. Como observado na Figura 4A, a revogação de TNFa ou seus genes de receptores de tipo 1 aumentou significativamente a sobrevivência de IL-tratado com 12 ratinhos, em comparação com ratinhos WT. Interessantemente, quando se analisou a cinética dos níveis séricos de TNFa, observou-se que os picos de expressão de proteína de cerca de 4 dias, tanto em IL-12 + IL-18 e de IL-tratado com 12 ratinhos; No entanto, os níveis são muito mais baixos de IL-12, ratinhos tratados com IL-18 + (Fig. 6C). Além disso, o dia 8 e até ao dia 12 pós-tratamento, os níveis de soro TNFa começam a diminuir em ambos os grupos; No entanto, mantém-se persistente e sempre superior no grupo de tratamento com IL-12 (Fig. 4B).

(A) A sobrevivência foi monitorizada em WT, TNFa e KO ratinhos KO TNFRI nos dias pós-IL-12 tratamento de ADNc. * Vs WT KO TNFa e TNFRI KO, p 0,01. (B) Os ratinhos de controlo, IL-12 ou IL-12 + IL-18-grupos tratados com ADNc foram sangrados e os níveis de soro de TNFa foram determinados nos dias pós-tratamento. (C) a partir de esplenócitos de controlo, IL-12 ou IL-12 + IL-18 ratinhos tratados de cDNA foram obtidas e cultivadas na presença de meio (NS), anti-CD3 Ab ou revestidos com LPS durante 72 horas. Os sobrenadantes foram então colhidos e expressão de TNFa foi avaliada por ELISA. * IL-12, IL-12 vs + IL-18, p 0,05. (D) Os soros de ratinhos tratados com controlo B6 ou ADNc de IL-12 e a partir de ratinhos KO tratados com TNFRI ADNc de IL-12 foram obtidas nos dias pós-tratamento. Os níveis de ALT foram determinados utilizando um kit colorimétrico específica. Os dados em A, B e C são expressos como a média de 2 experiências diferentes com 4 ratinhos por grupo. Os dados em D são expressos como a média do conjunto de 3 experiências diferentes (WT n = 12, TNFR1 KO n = 9). * WT IL-12 cDNA vs TNFRI KO IL-12 cDNA, p . 0,05

Em seguida, comparamos TNF

in vitro

expressão por esplenócitos obtidos dos camundongos tratados

in vivo

com IL-12 sozinho ou com IL-12 + IL-18. Embora o TNFa produzidos após

In vitro

estimulação com um Ab anti-CD3 (estímulo de células T) é bastante semelhante entre as células obtidas a partir de ambos os grupos, é significativamente mais baixa em IL-12 + IL-18 ratinhos tratados com quando estimulado

in vitro

com LPS (ou seja, MO e estimulação DCs) (Fig. 4C). Estes dados sugerem que os níveis mais baixos de TNFa sistémica observada em IL-12 + ratinhos tratados com IL-18 é provavelmente devido a um reduzido peso de MO e DCs na expressão desta citocina neste grupo de tratamento.

sistémica de IL-12 ou IL-12 + IL-18 tratamento provoca efeitos patológicos em tecidos imunes e o fígado

expressão sistémica de IL-12 tem sido relatado para induzir vários tipos de alterações patológicas em modelos de ratinho e no cancro pacientes [2], [4], [6], [17]. Para avaliar a toxicidade geral da IL-12 de tratamento, sacrificou controlo e doentes de IL-12 e IL-12 + IL-18 e ratinhos tratados realizada uma análise completa da patologia de órgãos. Como pode ser visto na Tabela S1, as principais alterações observadas são atrofia do timo e depleção linfóide, e estas alterações pareceu similar em IL-12 e IL-12 + IL-18, ratinhos tratados.

No entanto, o a análise revelou também uma histiocitose mais intensa nos nódulos linfáticos (LNs) obtidos a partir de ratinhos IL-tratado com 12 em comparação com a IL-12 + IL-18 ratinhos tratados com. Histiocitose está associada com a presença de macrófagos no tecido, de modo que a patologia exacerbada em ratinhos tratados com IL-12 está associada com uma importante expansão /presença de macrófagos em linfonodos.

alterações do tecido hepático após expressão sistémica de IL -12 ou IL-12 + IL-18

Mesmo que não observamos diferenças na histiocitose quando se comparam os fígados de IL-12 e IL-12 + IL-18 ratos, os resultados anteriores confirmaram que os níveis de soro de ALT enzimas hepáticas e aspartato aminotransferase (AST) foram significativamente maiores nos ratos tratados com IL-12 [10]. Em seguida nós decidimos avaliar a patologia deste órgão no lugar da descoberta de que um dos efeitos mais indesejáveis ​​de sistémica de IL-12, terapia é a hepatotoxicidade observada após a administração desta citoquina [2], [4], [6], [17]. Curiosamente, tal como mostrado na Figura 4D, a IL-12, o tratamento de TNFa tipo 1 do receptor de ratinhos KO anula o pico ALT observado por dia 15 em ratinhos WT.

As características histopatológicas presentes nos fígados de ratos tratados com IL- 12 ou IL-12 + IL-18 de ADNc revelou grandes alterações no tecido, incluindo o aparecimento de: as células com uma forma redonda (balão de células) (Fig 5B.) em comparação com a forma hexagonal clássica de hepatócitos a partir de ratinhos de controlo (Fig. 5A). Além disso, os fígados de ratos tratados mostram a perda dos sinusóides hepáticas que pode ser claramente observado em ratos de controlo (Figs. 5A 5B) vs. Além disso, observou-se focos de hematopoiese ectópica (Fig. 5C), com a presença de megacariócitos (Fig. 5D) por todo o fígado de IL-12 ou IL-12 + ratinhos tratados com IL-18, mas não nos ratinhos de controlo. Tanto o corpo de Mallory (Fig. 5E) e corpos Councilman (Fig. 5F) e focos de tecido necrótico (Fig. 5G) só pode ser visto nos murganhos tratados com os cDNAs de citocinas. Finalmente, observou-se que os depósitos de glicogênio são altamente reduzidos em ratinhos tratados com IL-12 ou IL-12 + IL-18 (Fig. 5I) em comparação com ratinhos de controlo (Fig. 5H). Apesar de todas estas lesões estão presentes por todo o tecido do fígado em ratos tratados com IL-12 sozinho ou de ADNc de IL-12 + IL-18 ADNcs (com um pico entre os dias 14-16), a co-administração de IL-12 e IL-18 é capaz de reduzir a incidência destas alterações hepáticas associadas a IL-12 (Tabela S2). Estas observações correlacionam com os nossos dados anteriores que demonstraram níveis de ALT e AST soros inferiores em 12 + IL-18 ratinhos tratados com [10]. Além disso, os ratinhos TNFαR1 KO (Fig. 5K) exibiram uma menor incidência destas características patológicas depois de IL-12 de tratamento de ADNc do que o que foi observado em ratinhos WT tratados (Fig. 5J), especialmente no número e tamanho de focos infiltrado (Tabela S2 ).

Fígados obtidos a partir de ratinhos nos diferentes grupos foram obtidos no dia 14-16 de pós-tratamento de ADNc. As secções de 6 um e foram obtidos (A-G) hematoxilina /eosina (H /E) ou (H-I), ácido periódico de Schiff (PAS), as manchas foram aplicadas às secções. (A) hepatócitos e sinusóides de um rato controle, 100 ×. (B) hepatócitos balonismo e ausência de sinusóides hepáticos em um 12-cDNA IL tratada rato, 100 ×. (C) Foco da hematopoiese ectópica em um 12-cDNA IL tratada rato, 100 ×. (D) Megacariócito em um-12-ADNc de IL tratada do rato, 100 ×. (E) Mallory e (F) Os organismos vereador em an-12-cDNA IL tratada rato, 100 ×. (G) Foco de necrose; 10 ×. Os depósitos de glicogênio obtido em um rato a partir de (H) do grupo de controlo, ou (i) o grupo de IL-12-de ADNc, 20 ×. secções de fígado de (J) ou ratinhos WT (K) TNFR1 KO 15 dias após o tratamento de IL-12 de cDNA. As imagens são representativas de 2 experimentos diferentes com 4-5 ratinhos por grupo.

Os ratinhos B6 foram tratados com IL-12 cDNA sozinho (círculo preto), IL-12 + IL-18 cDNA (círculo aberto