Abstract

contactina-1 foi mostrado para promover a metástase do câncer. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Relatamos aqui que knockdown de contactina-1 em células do cancro do pulmão A549 reduzidas a invasão de células A549 e a capacidade da célula para crescer em agar mole, sem afectar a proliferação celular. Redução de contactina-1 resultou na supra-regulação de caderina-E, compatível com a E-caderina de ser inibidor da invasão de células de cancro. Num esforço para investigar os mecanismos pelos quais contactina-1 reduz a expressão de E-caderina, observou-se que contactina-1 desempenha um papel na activação AKT, como knockdown de contactina-1 atenuado de activação AKT. Além disso, a inibição de activação AKT melhorado significativamente a expressão de E-caderina, uma observação que mimetiza a situação observada em contactina-1 knockdown, sugerindo que a activação de AKT desempenha um papel na regulação negativa contactina-1 mediada por E-caderina. Além disso, fomos capazes de mostrar que knockdown de contactina-1 não reduziu ainda mais a capacidade de invasão das células A549, quando a activação AKT foi inibida por um inibidor AKT. Para apoiar ainda mais nossos resultados, overexpressed Cntn-1 em duas linhas celulares de cancro Cntn-1 nulo de mama que expressam caderina-E. Após a superexpressão, Cntn-1 reduziu os níveis de E-caderina em uma linha celular e aumento da activação AKT no outro. Além disso, em nosso estudo de 63 cancros do pulmão primário, observou-se 65% dos cancros do pulmão primárias, sendo contactina-1 positivo e nesses carcinomas, 61% eram E-caderina negativo. Colectivamente, que fornecem evidências de que contactina-1 desempenha um papel na regulação negativa da E-caderina no cancro do pulmão e de que a activação AKT contribui para este processo. Num estudo de mecanismos responsáveis ​​pela contactina-1 para activar AKT, demonstramos que knockdown de Cntn-1 em células A549 não aumentou a expressão de PTEN, mas regulado positivamente PHLPP2, uma fosfatase que desfosforila AKT. Estas observações sugerem assim que contactina-1 aumenta a ativação de AKT em parte, impedindo mediada por PHLPP2 dephosphrorylation AKT

Citation:. Yan J, Wong N, Hung C, Chen WX-Y, Tang D (2013) Contactin- 1 Reduz E-caderina Expressão Via Ativando AKT no câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (5): e65463. doi: 10.1371 /journal.pone.0065463

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 29 de outubro de 2012; Aceito: 26 de abril de 2013; Publicado em: 28 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por Prostate Cancer Canadá, para D. Tang. Os autores também gostaria de agradecer o apoio financeiro de Saúde de São José, em Hamilton, Ontário, Canadá ao Centro de Hamilton para Kidney Research (Hckr). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O neural proteína de adesão celular contactina-1 (Cntn-1) é constituída por seis domínios de Ig, quatro motivos de fibronectina do tipo, e um de glicosilfosfatidilinositol (GPI) -moiety [1]. A porção GPI ancora Cntn-1 à superfície externa da membrana dos neurónios centrais e periféricos [2], [3]. Cntn-1 desempenha um papel na extensão axonal e formação de junções septadas semelhante entre axónios e células gliais myelinating [4] – [6], Além disso, Cntn-1 actua como um ligando para o receptor de Notch no cérebro, resultando em oligodendrócitos maturação [7]. Em linha com estas observações in vitro, in vivo estudos revelam um papel crítico de Cntn-1 na formação de direccionamento axonal e sinapse [8] – [10]. Knockdown de Cntn-1 em

Xenopus

embroys resultou em desorientação ea defasciculation dos axônios do nervo trigêmeo [11]. Considerando que, camundongos deficientes em Cntn-1 morrer em poucas semanas devido a ataxia grave [4], [8].

Embora a perda de Cntn-1 função, como resultado de nocaute de genes ou mutações espontâneas em

Cntn-1

, afeta os sistemas nervoso central e periférico, mas não as junções neuromusculares (NMJs) em ratinhos [8], [12], mutações no

Cntn-1

gene foi implicado a prejudicar a função NMJs em seres humanos [13]. Uma mutação que resulta na introdução de um codão de paragem prematuro no terceiro domínio Ig foi associada a uma forma familiar da miopatia congénita letal em seres humanos [13]. Apesar da pesquisa acumulando em Cntn-1 função, pouco se sabe sobre sua função fora do sistema nervoso. Embora, as análises de Northern blot de pâncreas, pulmão, rim e no músculo esquelético revelou apenas baixos níveis de transcritos Cntn-1 [14], a sua função nestes tecidos e expressão em outros tecidos ainda tem de ser determinado. Só recentemente é que há relatos de Cntn-1 expressão em doenças fora do sistema nervoso, mais notavelmente com o seu envolvimento no câncer. Cntn-1 foi detectada em cancro primário do pulmão e de knockdown Cntn-1 em células do cancro do pulmão especificamente inibida sua metástase, mas não a formação de tumores de xenoenxerto de locais em ratinhos imunocomprometidos [15]. Isto é em parte devido ao papel essencial de Cntn-1 no rearranjo do citoesqueleto de actina e estruturas de adesão focal [15]. Além disso, a metástase Cntn-1-mediada é regulada por VEGF-C e Cntn-1 aumenta a RhoA ligada a GTP, que é atribuível a invasão do cancro do pulmão Cntn-1-promovidos e metástase [15], [16]. pacientes com câncer pulmonar com altos níveis de Cntn-1 têm mau prognóstico [15]. Consistente com estes relatórios, fatores que aumenta a metástase do câncer de pulmão também regula positivamente Cntn-1 [17]. Além disso, Cntn-1 tem sido relatada em pacientes com melanoma [18] e está associada com metástase no câncer gástrico, carcinoma de células escamosas oral e câncer de esôfago [19] – [22].

Apesar de acumular evidências que suportam um papel de Cntn-1 em metástase do câncer, os mecanismos subjacentes responsáveis ​​por este processo ainda não está claro. Para investigar mais a oncogénese Cntn-1-mediada, temos knocked-down Cntn-1 em células do cancro do pulmão A549. Isso levou a uma regulação positiva da caderina-E. No carcinoma pulmonar primário, altos níveis de Cntn-1 co-existia com baixos níveis de E-caderina. Mecanicamente, Cntn-1 desempenha um papel na ativação de AKT, que por sua vez inibe a expressão da caderina-E.

Materiais e Métodos

linhas de células, plasmídeos e inibidores

O cancro do pulmão linhas de células (A549 e H1299), linhas celulares de cancro da mama (MCF7, BT549, BT474, MDA-MB-453, T47-D e ZR751), linhas celulares de cancro do rim (A498 e 786-0), uma linha celular de cancro do colo do útero (HeLa) , uma linha celular de glioblastoma (U87) e células 293T de rim 293 (células epiteliais embriónicas humanas) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A549, BT549, H1299, T47D, BT474, ZR751, MDA-MB-453 e 786-0 células foram cultivadas em meio RPMI 1640. MCF7, células HeLa e 293T foram cultivadas em DMEM e as células A498 e U87 foram cultivadas em meio MEM. Todos os meios foram suplementados com FBS a 10% (Sigma Aldrich, Oakville, ON) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Life Technologies, Burlington, ON). A identidade de A549 foi confirmado por análise de STR realizada por DDC médica (Fairfield, OH). Cntn-1 shRNA foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) e uma isoforma Cntn-3 de ADNc foi adquirido a Abrir Biosystems (Huntsville, AL). O inibidor de AKT VIII foi adquirido de Calbiochem (EMD, Mississauga, ON). promotor de E-caderina construção luciferase conduzido foi gentilmente cedido pelo Dr. Antonio García de Herreros, Universitat Pompeu Fabra, Espanha [23].

Knockdown de Cntn-1 |

Hairpin shRNAs (controle /Ctrl e Cntn-1) foram expressas por um shRNA vector retroviral à base de (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Knockdown de Cntn-1 foi realizada de acordo com as nossas condições publicados [24] – [26]. Resumidamente, um vector de expressão gag-pol, um vector que expressa Rev e um vector de expressão do envelope (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON) foram transientemente co-transfectadas com um plasmídeo retroviral concebido em células 293T. O meio contendo o vírus foi colhido 48 horas mais tarde, filtrados através de um filtro de 0,45 um, e centrifugado a 20.000 g durante 120 minutos para concentrar a retrovírus. Polibreno (10 ug /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ON) foi adicionado antes da infecção e as células foram seleccionadas para a integração estável com puromicina (1 jag /mL, Sigma Aldrich, Oakville, ON).

retroviral superexpressão de Cntn-1 |

Human Cntn-1 isoforma 3 cDNA foi comprado (abertas Biosystems, Huntsville, AL) e mais modificado para gerar o comprimento isoforma completa 1 de Cntn-1. Os iniciadores de PCR foram sintetizados que flanqueia o fragmento de terminal C presente na isoforma 1, mas ausente na isoforma 3. O ARN foi isolado a partir de células A549 com TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ON) e utilizado como molde para a RT-PCR. O terminal C fragmento de PCR resultante foi ligado em pBluescript KS + e subsequentemente cortar no local de restrição para MfeI; um local único presente na isoforma 1 e 3 isoforma, alguns pares de bases a montante antes de as duas sequências diferem. O fragmento C terminal foi então ligado com a isoforma adquiridos comercialmente 3. O comprimento total isoforma um ADNc para Cntn-1 foi subsequentemente clonado num vector retroviral, pBabe. A confirmação de clones positivos foi determinada por sequenciação de ADN. A sobre-expressão de Cntn-1 foi levada a cabo usando uma gag-pol de expressar um vector de vector e expressando envelope (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON). Todos os passos foram efectuados da mesma maneira descrita acima para o knockdown de Cntn-1. O vector pBabe sem Cntn-1 foi utilizado como um controlo de vector vazio.

proliferação celular Ensaio

Um total de 1000 células A549 e as células shCTRL shCNTN-1 foi semeada numa placa de 96 poços e incubou-se a 37 ° C durante 5 dias. A proliferação foi medida utilizando o kit de ensaio de proliferação celular WST-1 (Millipore, Mississauga, ON) de acordo com as instruções do fabricante. As leituras de absorvância foram medidas com um leitor de placas a 420mn.

Invasão ensaio

Boyden modificado câmaras foram adquiridos comercialmente consistindo de inserções com uma membrana de poro de 8 um revestido com Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON ) colocado numa placa de 24 poços. ensaios de invasão foram realizados de acordo com o procedimento do fabricante. Resumidamente, as inserções de Matrigel foram dadas duas horas para hidratar a 37 ° C antes da sua utilização, na presença de 0,5 ml de meio. O meio completo (0,5 ml) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) foi colocada na câmara inferior. Um total de 5 × 10

4 células foram semeadas para dentro da câmara por cima da inserção em 0,5 ml de meio isento de soro durante 22 horas. As células que passaram através das membranas foram fixadas e coradas com violeta de cristal (0,5%, Sigma Aldrich, Oakville, ON). Percentagem de células invasoras foi calculada dividindo o número de células que passam através da membrana de matrigel tamanho de poro de 8 um ao número de células que migram através da membrana de controlo e multiplicando por 100.

Anchorage-ensaio de crescimento independente

shCTRL A549 e A549 shCNTN células foram semeadas em poços individuais de placas de seis poços a uma densidade de 10

4 células /cavidade em 2 ml de meios 2X contendo 0,25% de agarose. Após 3 semanas, 5 campos aleatórios por poço foram examinados para colónias e contadas sob um microscópio de contraste de fase. área colónia média foi determinada usando o Image Pro software 5.0. Cada experiência foi realizada em triplicado e repetidas três vezes.

análise Western blot

Os lisados ​​celulares foram preparados em tampão contendo Tris 20 mM (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, pirofosfato de sódio 25 mM, NaF 1 mM, 1 mM de β-glicerofosfato, ortovanadato de sódio 0,1 mM, PMSF 1 mM, 2 ug /ml de leupeptina e 10 ug /ml de aprotinina (Sigma Aldrich, Oakville, ON). Um total de 50 ug de lisado celular, a menos que especificado de outro modo foi separado em gel de SDS-PAGE e transferido para Hybond ECL Amersham membranas de nitrocelulose (Amersham, Baie d’Urfe, QC). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e, em seguida, incubadas com os anticorpos indicados a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Os sinais foram detectados utilizando um kit ECL Western Blotting (Amersham, Baie d’Urfe, QC). Os anticorpos primários e secundários e as concentrações utilizadas foram: anti-Cntn-1 (1:200, R D Systems, Minneapolis, MN); anti-AKT (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-AKT Ser473 fosforilação (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), GSK3β-anti Ser9 fosforilação (1; 1000, Cell Signaling, Danvers , MA), anti-GSK3β (1:1000, Upstate Biotechnology, Billerica, MA), anti-E-caderina (1:2500, BD Biosciences, Mississauga, ON), anti-Snail (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-PHLPP2 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), anti-GAPDH (1:5000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti-actina (1:1000, Santa Cruz), anti-cabra (1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-rato (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON) e anti-coelho (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON)

imunofluorescência

as células foram tratadas tal como definidos nas legendas das figuras. imunofluorescência foi realizada por células de fixação com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos, e permeabilizadas com 0,05% de saponina (Sigma Aldrich, Oakville, ON), durante 15 minutos. Anti-Cntn-1 (01:20, R D systems, Minneapolis, MN) e anti-E-caderina (1:200, BD Biosciences, Mississauga, ON) foram, em seguida, adicionada às lâminas a 4 ° C durante a noite. Após lavagem, os anticorpos secundários, FITC ou rodamina (TRITC) burro IgG (1:200, Jackson ImmunoResearch Lab, West Grove, PA), foram aplicados durante 1 hora à temperatura ambiente. A lâmina foi subsequentemente coberta com meio de montagem Vectashield com DAPI (Vector Laboratories, Burlingam, CA). As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Axiovert 200).

luciferase ensaio

A549 Ctrl shRNA e A549 Cntn-1 células shRNA foram co-transfectadas com pGL3 E-caderina promoter- constructo de luciferase (gentilmente fornecida pelo Dr. Garcia de Herreros) e o plasmídeo pCH110-lacZ com Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Burlington, ON). Após 48 horas, a luciferase (Promega, Madison, WI) e actividade β-galactosidase foi determinada. A actividade de luciferase foi normalizada para p-galactosidase pela divisão do sinal de actividade de luciferase com o sinal de actividade de β-galactosidase.

A imuno-histoquímica (IHC)

tissue microarray (TMA) desliza (LC723, LC10013) contendo 63 adenocarcinomas do pulmão foram adquiridos a partir de US Biomax (Rockville, MD). TMA lâminas foram desparafinadas em xileno, afastada em série de etanol, e durante 30 minutos em tampão de citrato de sódio (pH = 6,0) num vaporizador alimentar tratado termicamente. Os anticorpos primários específicos para Cntn-1 (01:50, R D Systems, Minneapolis, MN) e E-caderina (1:400, BD Biosciences, Mississauga, ON) foram incubadas com as secções durante a noite a 4 ° C. Os controlos negativos foram incubadas com um rato não específico, de cabra ou IgG de coelho. Biotinilado secundário IgG e reagente Vector ABC (Vector Laboratories, Burlingam, CA) foram subsequentemente adicionados de acordo com as instruções do fabricante. As lavagens foram realizadas com PBS. reacção do cromogénio foi realizada com diaminobenzidina (Vector Laboratories, Burlingam, CA) e contrastadas com hematoxilina (Sigma Aldrich, Oakville, ON). TMA lâminas foram digitalizadas utilizando um ScanScope e analisados ​​utilizando o software ImageScope (Aperio, Vista, CA). Todos os pontos corados (núcleos) foram também examinadas manualmente. . Pontuações obtidas usando o software Imagescope foram convertidos para um algoritmo HSCORE usando a fórmula [(algoritmo HSCORE =% X positivo (intensidade + 1)] [27], [28] pontuações foram atribuídas a uma escala de 0 a 3 (0 – negativo ou coloração de fundo, 1 – coloração fraca, 2 – coloração modesta, 3 -. coloração forte)

análise de PCR em tempo real

O RNA total foi isolado usando TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ON). a transcrição reversa foi levada a cabo usando sobrescrito III (Life Technologies, Burlington, oN) de acordo com as instruções do fabricante. em resumo, 2? g de ARN foi convertido em cDNA a 65 ° C durante 6 minutos, seguido de dois minutos de incubação em gelo, 25 ° C durante 11 minutos, a 50 ° C durante 60 minutos e 70 ° C durante 15 minutos. iniciadores de PCR em tempo real utilizados para a actina, PHLPP2, SIP1, Slug, torção, E47 e e-caderina estão listados na Tabela 1. A eficiência da PCR por cada conjunto de iniciadores é a seguinte: 93% de actina, SIP1 86%, 97% Slug, E47 96%, 92% torção, PHLPP2 92% e e-caderina 85% PCR em tempo real foi realizada utilizando o ABI 7500 rápida real. Time System PCR (Applied Biosystems, Burlington, ON) na presença de SYBR-verde de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Burlington, ON). Resumidamente, cada reacção consistiu de 1 uL de ADNc, 0,25 mL iniciador directo (10 uM), 0,25 ul iniciador reverso (10 pM), 4,75 uL H

2O e 6,25 ul de mistura principal SYBR verde. A reacção de PCR foi realizada numa placa de 96 poços a 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Todas as amostras foram analisadas em triplicado e repetidas três vezes

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando teste t de Student e p .. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

resultados

Cntn-1 reduz a expressão de E-caderina

Cntn-1 desempenha um papel crítico na metástase das células cancerosas A549 pulmão [15]. Para investigar mais Cntn-1 mediada por metástases de cancro do pulmão, temos knocked-down Cntn-1 em células A549. Enquanto knockdown de Cntn-1 não afectou a proliferação das células (Figura 1A), a capacidade da célula para crescer em agar mole e de invadir matrigel foi significativamente reduzida (Figura 1B, C). Estes resultados estão em linha com o relatório que knockdown de Cntn-1 não afetou a formação de tumores xenoenxerto mas reduziu a capacidade de metástase das células [15].

células A549 (A) foram transfectadas de forma estável com o controle (CTRL) ou Cntn-1 shRNA. Knockdown de Cntn-1 foram confirmadas por Western blot (inset). 1000 células foram semeadas em placas de 96 células. A proliferação celular foi avaliada diariamente usando WST-1 Kit de ensaio de proliferação celular, durante cinco dias. As experiências foram repetidas três vezes. Os resultados típicos de uma única repetição são mostrados. (B) Para examinar a capacidade da célula para crescer em agar mole, 10

4 células foram semeadas em placas de agar contendo meio durante 3 semanas. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes. imagens típicas de uma experiência são mostrados (painel da esquerda). Os tamanhos de colónias de agar mole foram calculados usando o software 5.0 ImagePro programa e apresentados como médias ± DP. *:

p Art 0,05 em comparação com o A549 células shCNTN-1 (2 cauda t de Student). (C) A549 shCTRL shCNTN e foram examinadas quanto à sua capacidade para passar através de uma membrana de controlo e de matrigel. Os experimentos foram realizados três vezes. imagens típicas de uma experiência são mostrados (painel da esquerda). Invasão foi quantificada (painel da direita).

A capacidade de invasão de células cancerígenas de origem epitelial é atribuível à perda da proteína de adesão celular epitelial, a caderina-E [29], [30]. Para examinar se a E-caderina contribui para a invasão de células Cntn-1-medaited, fomos capazes de mostrar que o knockdown de Cntn-1 aumentou significativamente a expressão de E-caderina (Figura 2A). Esta regulação positiva foi, em parte, devido à elevação na transcrição de E-caderina, evidenciada pelo aumento do ARNm da E-caderina (Figura 2B) e a actividade do promotor de E-caderina (Figura 2C). Além disso, de acordo com Cntn-1 a ser ancorada sobre a superfície da célula [3] e o local de função para a E-caderina também estar na superfície da célula, knockdown de não só Cntn-1 reduziu substancialmente o conteúdo da superfície celular de Cntn-1 ( Figura 2D), mas também um aumento da superfície da célula de E-caderina (Figura 2E). Tomadas em conjunto, as observações anteriores demonstram que Cntn-1 reduz a expressão de E-caderina, pelo menos in vitro.

(A) Os lisados ​​celulares foram preparados a partir das linhas celulares indicadas, seguindo-se a detecção de E-caderina, Cntn -1 e actina por western blot (painel da esquerda). As experiências foram repetidas três vezes. Os níveis de E-caderina foi quantificada e representada graficamente (média ± SD). *:

p Art 0,05 por bicaudal teste t de Student. (B) análise por PCR em tempo real de expressão de E-caderina em linhas celulares indicadas. β-actina foi utilizado como um controlo interno. E-caderina do mRNA em células A549 shCNTN foi mostrado como uma alteração de dobragem com a das células A549 shCTRL. *:

p Art 0,05 por bicaudal teste t de Student. células (C) shCTRL A549 e A549 shCNTN foram transientemente transfectadas com E-caderina dirigido promotor CMV e uma luciferase conduzido lacZ durante 48 horas, seguido de avaliação para as actividades da luciferase e β-gal. As experiências foram repetidas três vezes. (D) Imunofluorescência coloração de A549 shCTRL e A549 shCNTN para Cntn-1. (E) coloração de imunofluorescência para a E-caderina em linhas celulares indicadas. Os núcleos foram contrastadas com DAPI.

Para determinar a relação entre Cntn-1 e E-caderina, examinamos 63 carcinomas pulmonares primárias (Tabela 2). Aproximadamente 65% (41/63) e 35% (22/63) dos carcinomas pulmonares primárias expressas facilmente detectável (Cntn-1

+) e indetectável Cntn-1 (Cntn-1

-), respectivamente, por IHC (Figura 3A). Isto é consistente com a incidência publicada por Cntn-1

+ contra Cntn-1

– carcinomas pulmonares primários [15]. Além disso, na nossa análise de 46 fases I /II e 17 fases III /IV carcinomas primários de pulmão (Tabela 2), aproximadamente 61% de fases I /II e 76% de fase III /IV carcinomas são Cntn-1-positivas (figura 3B), indicando um papel de Cntn-1 na progressão do cancro do pulmão.

Sessenta e três carcinomas pulmonares primários de microarrays de tecido foram coradas para IHC Cntn-1 e e-caderina. (A) imagens típicas de cancros do pulmão, com altos e baixos níveis de Cntn-1. A percentagem de carcinomas do pulmão com altos ou baixos níveis de Cntn-1 é indicado. (B) microarrays de tecido foram digitalizados e analisados ​​com ImageScope. foi analisada Cntn-1 expressão a seguir a progressão do câncer de pulmão. (C) imagens típicas de cancros do pulmão, com altos e baixos níveis de E-caderina. A percentagem de carcinomas do pulmão com níveis elevados ou baixos de E-caderina é indicado. (D) Com base na coloração IHC, calculou-se a proporção de carcinomas Cntn-1-positivos que expressa níveis elevados ou baixos de E-caderina. (E) câncer de pulmão primário foi IHC coradas para Cntn-1 e E-caderina. Regiões positivo para Cntn-1 e negativos para E-caderina (caixa azul, azul círculo), positivo para Cntn-1 e positiva da E-caderina (caixa verde), negativo para Cntn-1 e positivo para a E-caderina (caixa vermelha ) e ambos negativos Cntn-1 e e-caderina (caixa preta) pode ser observada.

Foram também analisadas expressão de e-caderina no carcinoma de pulmão primário. E-caderina

+ e E-caderina

– carcinomas foram observados (Figura 3C), com a maioria dos casos sendo E-caderina-negativa (63% ou 40/63). Isto está em linha com um certo número de publicações que demonstram 60% -70% de adenocarcinoma de pulmão que expressam reduzida expressão de E-caderina [31], [32]. No entanto, outros relataram também percentagens mais baixas, menos do que 50% dos cancros do pulmão que expressam E-caderina reduzida [33], [34]. É importante ressaltar que aproximadamente 61% dos Cntn-1 carcinomas positivos também são-E-caderina negativo (Figura 3D). No entanto, nós observamos carcinomas que foram negativas para ambas Cntn-1 e E-caderina (dados não mostrados), sugerindo que Cntn-1 não é o único factor de inibição da expressão de E-caderina. Em apoio a esta sugestão, enquanto as regiões Cntn-1 do cancro do pulmão negativo poderia ser positivo caderina-E, do mesmo paciente positivo pulmão expressão carcinomas Cntn-1 reduziu os níveis de E-caderina (Figura 3E). Tomados em conjunto, a nossa investigação apoia o conceito de que Cntn-1 facilita o cancro do pulmão progressão /metástase em parte através de regulação negativa da caderina-E.

Cntn-1 diminui a expressão da caderina-E através de reforçar a activação AKT

para examinar os mecanismos responsáveis ​​pela regulação baixa Cntn-1-mediada de expressão da caderina-E, primeiro determinar se Cntn-1 afeta a expressão de caracol. Caracol é o inibidor mais amplamente estudado de E-caderina transcrição [23]. Nas células A549, knockdown de Cntn-1 não altera a expressão do caracol (Figura 4A), sugerindo que o caracol pode não ser o principal factor envolvido na inibição Cntn-1-mediada de expressão de E-caderina em células A549. Após a análise de outros factores de transcrição E-caderina, SIP1 e expressão Slug diminuiu após Cntn-1 knockdown em células A549 (Figura 4B, C). No entanto, nenhuma alteração foi observada para E47 e torção (dados não mostrados).

(A) Os lisados ​​de células para as linhas celulares indicadas foi examinada para expressão de Snail por western blot. As experiências foram realizadas três vezes. imagens típicas (inserção) e quantificação da expressão do caracol são mostrados. análise de PCR em tempo real de (B) SIP1 e (C) Slug expressão nas linhas celulares indicadas. β-actina foi utilizado como um controlo interno. O mRNA em células A549 shCNTN foi mostrado como uma alteração de dobragem com a das células A549 shCTRL. *:

p Art 0,05 por bicaudal teste t de Student

Outros e temos mostrado recentemente que a atividade AKT reduz a expressão da caderina-E [35] – [39. ] e actividade de AKT desempenha um papel fundamental na tumorigénese e metástase [40] – [42]. Temos, portanto, examinar se AKT contribui para a regulação baixa Cntn-1 mediada por caderina-E. Para investigar esta possibilidade, determinou-se o estado de activação AKT em células de controlo A549 e em células A549 em que Cntn-1 foi knocked-down. Em comparação com células shCTRL, knockdown de activação AKT Cntn-1 significativamente reduzida (Figura 5A). Para confirmar ainda mais alterações na activação AKT, que demonstraram que, em comparação com células shCTRL fosforilação de serina de 9 GSK3β, um alvo AKT bem estabelecida [41], foi significativamente reduzida em Cntn-1 células de knockdown (Figura 5B). Tomados em conjunto, estas observações revelam que Cntn-1 desempenha um papel na activação AKT.

(A) Os lisados ​​celulares para A549 e A549 shCTRL shCNTN foi examinada para p-AKT e AKT total, em western blot (painel da esquerda) . activação AKT foi quantificada (painel da direita). Também foram determinados (B) fosforilação em Ser9 de GSK3β (pGSK3β), GSK3β, e expressão GAPDH em A549 shCTRL e shCNTN A549 células.

Em seguida, determinar se a modulação da atividade de AKT contribui para Cntn-1 diminuição induzida de expressão da caderina-E. A inibição da activação AKT com um inibidor de AKT aumento da expressão de E-caderina nas células A549 (Figura 6A), o que indica que a redução de activação AKT em cima do knockdown de Cntn-1 pode contribuir para a inibição observada de invasão de células A549 (Figura 1). Para testar esta possibilidade, fomos capazes de mostrar que, enquanto knockdown de Cntn-1 reduziu a invasão de células A549 por tratamento DMSO (controlo da vesícula), knockdown de Cntn-1 não inibiu mais a invasão de células A549 quando a activação AKT foi inibida (Figura 6B) . Tomados em conjunto, estas observações apoiam a noção de que Cntn-1 inibe a expressão de E-caderina através de reforço de activação AKT. Como redução em E-caderina desempenha um papel vital na metástase do cancro [29], [30], a perda de E-caderina, por conseguinte, contribui para a metástase do cancro de pulmão.

células A549 (A) foram tratados com um inibidor de AKT (VIII inibidor de AKT) em concentrações crescentes e depois examinadas para a e-caderina, activação AKT (pAKT), expressão de AKT, e actina. (B) A549 shCTRL e células A549 shCNTN-1 foram falsamente tratados (DMSO, dois painéis superior) ou tratados com um inibidor de AKT (dois painéis inferiores), seguido de determinação das suas inserções de invasão de Matrigel capacidade. As experiências foram repetidas três vezes. Ambas as imagens típicas e quantificação da capacidade de invasão das células são mostrados. *:.

p Art 0,05 por bicaudal teste t de Student

Cntn-1 aumenta a ativação de AKT, reduzindo a expressão PHLPP2

atividade AKT é regulamentada por ambas as fosfatases a montante ea jusante, PTEN e PHLPP (domínio PH fosfatase rica em leucina de repetição da proteína). Nós, portanto, determinar se uma ou ambas as fosfatases estão envolvidos em Cntn-1 induzida por redução knockdown de activação AKT. Em comparação com células shCTRL, knockdown de Cntn-1 não afectou significativamente a expressão de PTEN (Figura 7A). No entanto, a redução na Cntn-1 aumentou significativamente a expressão PHLPP2 em células A549 (Figura 7B). Além disso, a regulação positiva de PHLPP2 em-1 Cntn knockdown células A549 foi em parte atribuível ao aumento em ARNm PHLPP2 (Figura 7C), o que pode ser o resultado de qualquer uma das supra-regulação da transcrição de genes PHLPP2 ou estabilização do ARNm PHLPP2.

(a), A549 e A549 shCTRL lisados ​​celulares shCNTN-1 foram examinados para a expressão de PTEN por western blot (topo). As experiências foram realizadas três vezes. imagens típicas de uma única experiência foram mostrado (painel da esquerda). PTEN expressão também foi quantificada (painel da direita). (B) Expressão em PHLPP2 A549 shCTRL e linhas de células A549 shCNTN foram examinadas por Western blot (topo). As experiências foram repetidas três vezes. imagens típicas de uma única experiência foram mostrado (painel da esquerda). expressão PHLPP2 foi quantificada (painel direito). *:

p Art 0,05 por bicaudal teste t de Student. (C) em tempo real A análise de PCR de expressão PHLPP2 nas linhas celulares indicadas. β-actina foi utilizada como um controlo interno.

Cntn-1 regulação da caderina-E e activação AKT não é exclusiva do A549

Para determinar se Cntn-1 regula E- caderina e AKT em outras linhas celulares de cancro, examinamos uma série de mama, rim, pulmão e cancro do colo do útero para Cntn-1 e e-caderina expressão. Apesar da grande variedade de tipos de cancro examinados, Cntn-1 não é uma proteína universalmente expressos em cancro (Figura S1). Além disso, desde linhas celulares de cancro da mama dois examinados expressa E-caderina, procedeu-se a examinar se Cntn-1 pode regulamentado atividade de E-caderina e AKT nestas duas linhas celulares. Após a sobre-expressão ectópica de Cntn-1 em BT549, observou-se uma diminuição na expressão da caderina-E em comparação com o controlo vector vazio, sem qualquer alteração na activação AKT (Figura S2). Em contraste, a sobre-expressão de Cntn-1 em células MCF-7 levou a um aumento na activação AKT comparação com o controlo de vector vazio (Figura 8A, B), no entanto, não houve alteração observada em E-caderina (Figura 8C, D). Com base nestas evidências, Cntn 1-regulação mediada por E-caderina e AKT não se restringe ao cancro do pulmão e pode desempenhar um papel em outros cancros que expressam Cntn-1.

(A) Cntn-1 foi sobre-expresso em células MCF7 e os lisados ​​celulares foram recolhidos e rodar em western blot para Cntn-1, P-Akt, Akt e expressão de actina. (B) coloração de imunofluorescência para Cntn-1 nas linhas celulares indicadas. (C) Os lisados ​​celulares foram recolhidos a partir das linhas celulares indicadas. Apenas 10 g de lisados ​​celulares foi executado em western blot para a E-caderina e actina. (D) A coloração por imunofluorescência para E-caderina em linhas celulares indicadas. Os núcleos foram contrastadas com DAPI

Discussão

Cntn-1 é uma proteína de adesão neural com funções na formação de orientação axônio e sinapses [8] – [10]..