Abstract
O inibidor canceroso da proteína fosfatase 2A (CIP2A) é um fator oncogênico que estabiliza a proteína c-Myc. CIP2A é abundante em vários tumores, e os níveis de expressão são um marcador independente para resultados a longo prazo. Para determinar se
CIP2A
expressão é elevada no câncer de cólon e se ele pode servir como um marcador de prognóstico para a sobrevivência, analisamos
CIP2A
expressão de mRNA por PCR em tempo real em 104 amostras de câncer de cólon.
CIP2A
mRNA foi sobre-expresso em amostras de câncer de cólon e
CIP2A
níveis de expressão significativamente correlacionada com o estágio do tumor. Descobrimos que
CIP2A
serve como um marcador de prognóstico independente para-livre de doença e sobrevida global. Além disso, nós investigamos efeitos CIP2A-dependente dos níveis de c-Myc, Akt e sobre a proliferação celular em linhas celulares de cancro de cólon por três silenciamento CIP2A usando pequeno interferente (Si) e em gancho de cabelo curto RNAs (sh). Depleção de CIP2A inibiu substancialmente o crescimento de linhas de células do cólon e reduziram os níveis de c-Myc, sem afectar a expressão ou função da cinase reguladora a montante, Akt. Expressão de CIP2A foi encontrado para ser dependente da actividade da MAPK, ligando expressão elevada c-Myc para a transdução de sinal desregulado no câncer de cólon
Citation:. Wiegering A, Pfann C, uThe FW, Otto C, Rycak L, Mäder L, et ai. (2013) CIP2A Influências Sobrevivência no cancro do cólon e é essencial para manter Expressão Myc. PLoS ONE 8 (10): e75292. doi: 10.1371 /journal.pone.0075292
editor: Gnanasekar Munirathinam, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América
Recebido: 23 Abril 2013; Aceito: 12 de agosto de 2013; Publicação: 01 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wiegering et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. AW tem financiamento da Universidade de Würburg para uma tela em comparação com a APC no número financiamento é: IZKF B-186. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito para este estudo. Esta publicação foi financiada pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) e da Universidade de Wuerzburg no programa de financiamento Open Access Publishing. Nenhuma corrente outras fontes de financiamento externas para este estudo
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O câncer colorretal (CRC) é o mais. malignidade gastrintestinal comum. Há aproximadamente 664 mil novos casos a cada ano em todo o mundo. Metade destes pacientes morrerão desta carcinoma de [1]. Actualmente, o tratamento padrão é a cirurgia primária e, dependendo da fase do tumor, quimioterapia adicional [2]. Devido à alta taxa de recorrência, novos alvos potenciais e marcadores prognósticos são necessários para identificar pacientes que são susceptíveis de beneficiar de terapia adicional.
Em 2007, Junttila e Westermarck identificou o inibidor canceroso da proteína fosfatase 2A (CIP2A) como uma oncoproteína humana. CIP2A é sobre-expresso em carcinomas de cabeça e pescoço células escamosas e carcinoma de cólon [3]. CIP2A inibe a proteína fosfatase 2A (PP2A). PP2A por sua vez, tem um papel crítico no volume da oncoproteína c-Myc, uma vez que desfosforila PP2A c-Myc na serina-62 (S62). A desfosforilação no S62 é necessária para a ubiquitinação de c-Myc pelo ubiquitina ligase Fbw7 e, por conseguinte, inicia a degradação da proteína c-Myc [4]. A sobre-expressão de CIP2A inibe a actividade de PP2A e, assim, estabiliza c-Myc. Por conseguinte, este induz a imortalização e transformação maligna de células humanos [3]. -se c-Myc permaneça o controlador oncogénica mais importante no cancro colo-rectal [5].
Estudos recentes têm mostrado que CIP2A é sobre-expressa em vários tumores malignos humanos. Os níveis de expressão CIP2A correlação com a sobrevida global (OS) e sobrevida livre de doença (DFS) em carcinomas gástricos, no câncer de ovário seroso, no carcinoma de células renais e no cancro da mama [6]; [7]; [8]; [9]. Na leucemia mielóide crónica (LMC),
expressão CIP2A
no ponto de tempo de diagnóstico é um marcador prognóstico para o desenvolvimento de uma crise de explosão mais tarde em [10]. Além disso, alguns factores, incluindo oncogénicos
Helicobacter pylori
e vírus do papiloma 16 E7, regular a expressão de CIP2A e isto pode ser crítico para a sua actividade oncogénica [11]; [12].
Recentemente, dois grupos relataram resultados conflitantes sobre o impacto prognóstico da CIP2A no cancro colorectal [13], [14]. Böckelman et ai. estudados 752 pacientes, mas não foi possível determinar qualquer significado prognóstico; Em contraste Teng et ai. estudou 167 pacientes e expressão CIP2A identificado como um fator prognóstico para carcinoma do cólon.
O objetivo do presente estudo foi abordar a relevância da expressão CIP2A no câncer de cólon. Em primeiro lugar, analisamos a expressão de
CIP2A
em uma coorte de pacientes com câncer de cólon 104 com documentado follow-up e confirmou a sua sobre-expressão. Em segundo lugar, foi investigada a associação entre
CIP2A
expressão de mRNA e as variáveis clínico-patológicas; por último, que teve como objetivo determinar as vias moleculares que regulam a expressão CIP2A e, são regulados por CIP2A. Os nossos dados suportam a noção de que desregulamentou expressão de CIP2A é um evento oncogénico crítico no carcinoma do cólon.
Pacientes e Métodos
Amostras de Pacientes
Cento e quatro pacientes com câncer colorretal foram incluídos no estudo. Todos os pacientes foram submetidos a cirurgia no Hospital da Universidade de Wuerzburg, na Alemanha, entre 2003 e 2012. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Tratamentos após a cirurgia foram realizadas de acordo com as diretrizes para o tratamento de câncer colorretal. O diagnóstico foi confirmado pelo exame histopatológico dos espécimes. Após a cirurgia, as amostras de tumor foram recolhidas e armazenadas em azoto líquido. Os dados clínicos de todos os pacientes foram coletados a partir de registros hospitalares e registros subseqüentes foram coletadas através do Comprehensive Cancer Centre Mainfranken.
Ética Declaração
A aprovação ética para esta pesquisa foi obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Wuerzburg. Todos os pacientes que forneceram tecido do tumor e amostras de tecido do cólon normal para esta pesquisa assinaram um termo de consentimento antes da remoção cirúrgica do câncer intestinal.
linhas celulares e Cultura de Células
Caco2, HCT116 e SW620 As células foram comprados na American Type Culture Collection. Todas as células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo und 1% de penicilina /estreptomicina.
quantitativa em tempo real Transcrição Reversa-PCR Análise
A expressão de genes de
CIP2A
foi analisada utilizando PCR em tempo real. O ARN celular total foi extraído a partir de amostras de tumores e linhas celulares com RNeasy Minikit (Qiagen; Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os conjuntos de iniciadores (Qiagen) que tiveram como alvos
CIP2A
RNA foram projetados por Biomers (Ulm, Alemanha). Combinado ADNc do cólon humano (Pharmingen, Heidelberg, Alemanha) serviu como um controlo positivo, normalizado à linha de base. Os genes de manutenção, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (
GAPDH) e microglobulina beta-2 (
b2MG
) foram utilizados como padrões internos para a quantificação relativa de ADNc e de controlo de qualidade. Todas as reacções de PCR foram realizadas com um Opticon 2 Sistema Motor de DNA (MJ Research, Biozym; Oldendorf, Alemanha). A quantificação relativa, com base na diferença vezes, foi calculado com o método do ciclo limiar (Ct), expresso em 2
-ΔΔCt (sequência Primer na Tabela S1).
Análise Immunoblot
As células cultivadas foram lavadas três vezes com PBS arrefecido em gelo, colhidas e lisadas directamente em tampão de amostra RIPA para análise de imunotransferência. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação a 12000 g durante 10 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi utilizado como lisado total de proteínas. Para cada amostra, 10 ^ g de lisado de proteína total foi submetido a electroforese em 10% de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE), seguida de análise de imunotransferência. As imunotransferências foram sondadas com anticorpos contra CIP2A (A301-454A; Bethyl Laboratories), c-Myc C33 (C33, # 42; Santa Cruz), beta-actina (AC-15 /A5441, Sigma), vinculina (V9131; Sigma), AKT, pAKT
473 (CS-9271), GSK3 (cs-9315), pGSK Serina-9 (cs-9336), S6 (cs-2212), PS6 (cs-2215); pmTOR (cs-2917), e mTOR (cs-2972). Todos os anticorpos eram de sinalização celular e foram usadas de acordo com as instruções do fabricante. As manchas foram visualizadas com anticorpos secundários (GE Healthcare) contra rato (NA9310) ou coelho (NA9340) anticorpos primários.
A imuno-histoquímica
O anticorpo CIP2A foi o mesmo que para a análise de imunotransferência, controlo de isotipo anticorpo foi comprado de eBioscience (San Diego, EUA). O anticorpo secundário era uma anti-IgG de coelho conjugado com Cy3 AffiniPure a uma diluição 1:200. coloração CIP2A foi realizada em secções de criostato de amostras de cancro do cólon snap-congelados expressando diferentes níveis de mRNA CIP2A com tecido do cólon normal, vizinhos e 10 espécimes de cólon normais. secções de criostato (5 uM) foram incubados com o anticorpo ou o anticorpo de controlo primário seguido de incubação com o anticorpo secundário conjugado com Cy3. As lâminas foram contrastadas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e coberto com polivinil-álcool meio de montagem (DABCO, Sigma-Aldrich) e analisados utilizando uma câmara Zeiss (Oberkochen, Alemanha).
Transfection siRNA
Para silenciar a expressão do gene, as células foram transfectadas com pequenos RNAs de interferência (siRNAs). On-alvo mais siARN da piscina inteligente (Dharmacon) para segmentar CIP2A (L-014135-01-005) e um siRNA de controlo (D-001810-10-05) foram usadas. As piscinas siRNA (concentração final 100 nM) foram usados para transfectar as células com o kit de RNAimax de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas 72 h mais tarde; expressão de proteínas foi determinada por análise Immunoblot.
shRNA e Lentivírus
Para silenciar a expressão do mRNA CIP2A com sequências curtas de RNA hairpin (shRNA), tendo como alvo
CIP2A
foram clonados em um vetor lentivírus (plko1 puro), de acordo com o protocolo do fabricante. O vector foi transfectado transientemente em células HEK293T em conjunto com os plasmídeos de pacotes. Após 48 e 72 h, os sobrenadantes contendo vírus foram recolhidos e filtrados. linhas celulares de cancro do cólon foram infectadas com o lentivírus CIP2A e 24 h mais tarde, as células infectadas foram seleccionadas com puromicina. Os experimentos foram realizados com as células selecionadas.
Formação de Colónias Ensaio
2,5 × 10
3 células infectadas com shRNA CIP2A ou SCR. foram semeadas em placas de seis poços. As colónias foram coradas com 0,5% de violeta cristal em 20% de etanol. As fotografias foram tiradas e densidade relativa determinada com ImageJ.
Análise Estatística
univariada análises para determinar associação com a sobrevivência foram avaliados com as curvas de Kaplan-Meier, e as comparações foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. multivariadas foram realizadas com um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. P-valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
A expressão de CIP2A e variáveis clínico-patológicos do cólon pacientes com câncer
A expressão de
CIP2A
mRNA. foi inicialmente avaliada utilizando conjuntos de dados de expressão derivados de uma análise de microarray publicado, que foi originalmente realizada para identificar marcadores prognósticos para carcinomas colorretais de acordo com o estado de metástase ganglionar [15]. conjuntos de dados completos (DFS, estágios do tumor), comparando
CIP2A
expressão de mRNA em carcinoma de que, em tecidos adjacentes correspondentes, estavam disponíveis para 226 carcinomas.
CIP2A
expressão foi testada usando duas sondas independentes presentes nesta matriz. Nós não encontramos nenhuma correlação entre a
expressão CIP2A
e idade no momento do diagnóstico, ou sexo neste conjunto de dados, mas
CIP2A
mRNA foi expresso em níveis mais elevados em tecidos de câncer colorretal do que nos tecidos adjacentes compensadas em ambos os conjuntos de sonda (dados não apresentados). Curiosamente, alta
CIP2A
expressão de mRNA correlaciona-se significativamente com a redução da sobrevida livre de doença (DFS) (Fig. S1A, B). Em análises separadas de pacientes em União para o Controle Internacional de Câncer (UICC) fase I (infiltração tumoral a muscular própria), II (infiltração tumoral além muscular própria) ou III (linfonodo metástases), apenas os pacientes em UICC fase III mostrou uma correlação significativa entre
expressão e DFS CIP2A
. Em comparação, os pacientes em fase UICC I e II mostrou apenas uma ligeira correlação entre a baixa
CIP2A
expressão e sobrevivência prolongada que não atingiu significância estatística. Isto pode ser devido ao pequeno número de amostras e menos eventos de recaída em comparação com os pacientes no UICC fase III (Fig. S2A-C). Como DFS não poderia ser alcançado em fase UICC IV (metástases distantes), não foi possível analisar a correlação de
CIP2A
expressão para a sobrevivência de pacientes em estágio UICC IV com este conjunto de dados.
Nós ainda analisada
CIP2A
níveis de mRNA em um conjunto independente de 104 amostras de tecido de cancro colo-rectal, utilizando uma abordagem RT-QPCR. A expressão de
CIP2A
ARNm foi determinada relativamente a dois genes de manutenção, microglobulina beta-2 (
b2MG
) e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (
GAPDH). Os níveis de expressão foram comparados com a média
CIP2A
expressão de ARNm no tecido de mucosa normal.
CIP2A
expressão em relação ao
b2MG
ou em relação à
GAPDH
mostrou uma alta correlação (R
2 = 0,86) (Fig. S3). Consistente com os achados de expressão CIP2A em câncer, encontramos
CIP2A
expressão de mRNA em 93 de 104 amostras (89,4%) de câncer de ser pelo menos quatro vezes maior do que em tecidos normais da mucosa do cólon. Além disso,
CIP2A
nível de expressão foi significativamente correlacionada ao palco UICC, metástase linfonodal, metástases à distância, e classificação histológico do tumor (Fig. 1). Nós não encontramos nenhuma associação entre o
CIP2A
expressão e idade do paciente, sexo ou localização do cancro (direita versus cólon esquerdo) (Tabela S2).
Os painéis mostram Box-Whisker documentação relativa
CIP2A
níveis de mRNA em tumores estratificados de acordo com UICC fase (a) (UICC I vs. II p 0,0001; II vs. III p = 0,0046; III vs. IV p = 0,0002), de acordo com a linfa metástase (B; N- vs. N + p 0,0001), de acordo com metástases à distância (C; M0 vs. M1 p 0,0001), e de acordo com a gradação histológica (D: G2 vs G3 p = 0,0084) .
mRNA CIP2A Expressão e pós-operatória a sobrevivência do cancro do cólon Os pacientes
foi utilizado sobrevida global (OS) para análise de sobrevida. A sobrevivência global foi definida como o intervalo de tempo entre a cirurgia e a morte associado a um tumor. As análises univariada 1, 3 e 5 anos OS revelou que os pacientes com estágio avançado do tumor primário, metástase linfonodal, metástases à distância, avançado UICC-estágio, e altos graus histológicos teve piores resultados (Tabela 1). Para uma análise mais aprofundada, os pacientes foram divididos em dois grupos, com
expressão CIP2A
acima (alto) ou abaixo (baixo) valor mediano. Pacientes com alta
CIP2A
expressão de mRNA teve OS significativamente menor do que aqueles com baixa
CIP2A
expressão de mRNA (Fig. 2A, B). Comparando pacientes no UICC fases I-IV separadamente com alta e baixa
CIP2A
expressão de mRNA, apenas na fase UICC III, pacientes com alto
CIP2A
níveis teve um OS reduzida (Fig. 2C, D). Além disso, uma análise multivariada indicou que um avançado UICC-estágio e alta expressão
CIP2A
(
CIP2A
acima mediana e
CIP2A
expressão usada como um marcador contínua) eram independentes fatores de pior prognóstico em pacientes com câncer de cólon (Tabela 2).
Os gráficos mostram as curvas de Kaplan-Meier da OS de acordo com a
CIP2A
expressão de mRNA. (Vermelho:
CIP2A
expressão de mRNA abaixo média de vezes o valor expressão de 10,5 acima do tecido normal), verde:
CIP2A
expressão de mRNA acima média de vezes o valor expressão de 10,5 acima do tecido normal) (a B) Todos os pacientes com relação ao
CIP2A
expressão de mRNA normalizados para gene housekeeping (n = 75) (a: b2MG; B: GAPDH) (C) pacientes em estágio UICC II em relação a
CIP2A
expressão de mRNA normalizados para GAPDH gene housekeeping (n = 29) (D) pacientes em estágio UICC III no que respeita à
CIP2A
expressão de mRNA normalizado para GAPDH gene housekeeping (n = 21).
Para testar se
CIP2A
expressão do mRNA está correlacionada com a expressão da proteína CIP2A no CRC, dez secções normais dos tecidos da mucosa, quatro amostras de tecido CRC expressando baixo
CIP2A
níveis de mRNA e cinco amostras de tecidos que expressam alta
CIP2A
níveis de mRNA foram coradas para a expressão da proteína CIP2A. Em secções de tecido de mucosa normais, nenhuma ou apenas uma coloração muito fraca para CIP2A poderia ser detectada (dados não mostrados). Cancros que expressam níveis baixos de
CIP2A
mRNA mostrou uma coloração fraca para a proteína CIP2A, que os cancros que expressam alta
CIP2A
níveis de mRNA mostrou uma forte coloração para proteína CIP2A. Estes resultados demonstram que a proteína CIP2A e níveis de mRNA está intimamente relacionada
in vivo
. (Fig. 3).
Os painéis mostram exemplos representativos de imunofluorescência, mostrando a expressão da proteína CIP2A em células cancerosas de pacientes com baixa (A + B) ou alta
CIP2A
(C + D ) expressão de mRNA (a + x100 C, B + D x200 ampliação).
Efeitos de CIP2A Esgotamento no crescimento celular e Myc expressão em CRC
Nós ainda queria esclarecer a influência de CIP2A sobre as suas proteínas alvo em linhas celulares de CRC. a expressão da proteína de CIP2A foi notavelmente reduzida em três linhas de células do cólon (Caco2, HCT116 e SW620) após o tratamento com siRNA específico contra a
CIP2A
. Além disso, CIP2A knockdown conduziu a uma redução substancial dos níveis de c-Myc em todas as três linhas de células (Fig 4A;. N = 3 para cada linha de células). Isto foi devido a regulação pós-transcrição dos níveis de proteína C-myc, uma vez que detectou nenhuma alteração em
MYC
expressão de ARNm (Figura 4B;. N = 3). Estudos anteriores indicaram que CIP2A knockdown levou a uma actividade reduzida da Akt, mostrado pela fosforilação reduzida na serina 473 (pAkt
473), e, desse modo, inibiram a via PI3K /mTOR. No entanto, nós não detectar qualquer alteração significativa no Akt fosforilada após CIP2A knockdown em células Caco2, HCT116 ou SW620. Além disso, a fosforilação das metas Akt a jusante, incluindo pmTor, PS6 e pGsk3, não foi significativamente alterado após knockdown de CIP2A (Fig 4C;. N = 3 para cada linha de células). No geral, esta mostra que a proteína c-Myc está sob o controlo de CIP2A no CRC, ao passo que a via PI3K /mTOR parece ser independente de CIP2A.
(A) Análise de imunotransferência da proteína CIP2A e c-myc em Caco2, SW620 e HCT116 células transfectadas com ARNsi de segmentação CIP2A ou ARNsi de controlo. As células foram colhidas 72 h após transfecção (n = 3 para cada linha de células). (B) em tempo real A análise de PCR de
CIP2A
e
c-Myc
expressão de ARNm em células HCT116 transfectadas com ARNsi de segmentação CIP2A ou ARNsi de controlo (n = 3). (C) A exaustão das CIP2A não muda status de ativação de AKT ou de seus alvos a jusante. Os painéis mostram imunomarcações de proteínas e proteínas fosforiladas indicados (p) em Caco2, HCT116 e células SW620 transfectadas com ARNsi de segmentação CIP2A ou ARNsi de controlo, como anteriormente (n = 3 para cada linha de células).
Uma vez que os siRNAs são tipicamente perdidas ao longo do tempo, e para excluir os efeitos fora do alvo, foram testados dois shRNAs diferentes de segmentação
CIP2A
para avaliar o efeito de inibição do crescimento de CIP2A knockdown. células HCT116 foram infectadas lentiviral com vectores que transportam shRNAs contra
CIP2A
. análises de imunotransferência mostrou knockdown substancial de proteína CIP2A com correspondente redução nos níveis de proteína de c-myc (Figura 5A;. n = 2). Deste modo, a proliferação celular foi marcadamente alterada nas células infectadas com shRNA contra
CIP2A
(Fig 5B;. N = 2).
(A) Análise de imunotransferência da proteína CIP2A e c-myc em células HCT116 infectadas lentiviral com shRNA alvo CIP2A ou CTR. shRNA. Números abaixo de linhas indicam a expressão da proteína de c-myc em relação aos níveis de c-myc em células de controlo (n = 2). (B) A formação de colónias de células HCT116 depois de 7 dias. (
Top of), a densidade de colónias coradas com violeta de cristal; (
inferior), representativo das culturas indicadas (n = 3).
CIP2A Expression é jusante da MEK quinase no CRC
Para identificar potenciais reguladores a montante de
expressão CIP2A
, nós tratados Caco2, HCT116 e células SW620 com UO126, um bem caracterizada Mek1 /2 inibidor [16]. O tratamento com UO126 durante 24 h conduziu a uma redução significativa em
CIP2A
a expressão da proteína e ARNm CIP2A em comparação com as células tratadas de DMSO (Figura 6A, B;. N = 3 para cada linha de células). Este efeito foi mais pronunciado em células que abrigavam uma mutação via MAPK, como SW620 (
KRAS
) e HCT116 (
KRAS
), do que em células Caco2 que são do tipo selvagem para
KRAS
.
Caco2, SW620 e células HCT116 foram tratadas com DMSO ou o inibidor da MEK UO126 durante 24 (n = 3 para cada linha de células). (A) A análise de imunotransferência de CIP2A e expressão da proteína p-ERK em Caco2, HCT116 e SW620. (B) em tempo real análise de PCR de
CIP2A
expressão de mRNA (* 0,05; ** 0,005)
Discussão
Recentemente “O. Cancer Genome Atlas Rede “desregulada demonstraram que a expressão de c-Myc é uma característica de praticamente todas as CRCs, independente do conjunto de mutações específicas que estão presentes em cada tumor [5]. Por exemplo, mutações no supressor de tumor
APC
eo oncogene
KRAS
levar a uma regulação positiva da
MYC
mRNA [5]. No nível pós-transcricional, a perda da família miR34 por hipermetilação, que ocorre em mais de 90% de todo o CRC, estabiliza
MYC
mRNA [17], [18]. Além disso, num modelo de ratinho de cancro do cólon impulsionado pela perda de
APC
mostra que a formação do tumor do cólon depende da expressão de c-Myc contínuo [19].
Até agora, pouco se sabe sobre o pós-tradução regulação dos níveis de c-Myc em CRC. No presente estudo, foi demonstrado que
CIP2A
expressão é elevada nas amostras de carcinoma do cólon, em comparação com a sua expressão em grande tecido normal, intestino delgado, e que
CIP2A
expressão está correlacionada negativamente a ambos OS e parâmetros patológicos clínicos. Como não há pontos de corte validados para
CIP2A
níveis de expressão de esclarecer grupos de expressão elevados vs. baixa, utilizou-se o nível de expressão de mRNA mediana como ponto de corte. Apesar de um número relativamente baixo de pacientes em nosso estudo, e, portanto, um número relativamente baixo de mortes relacionadas ao câncer em análises de subgrupo, conseguimos demonstrar uma correlação significativa de
CIP2A
níveis com a sobrevivência associada ao tumor.
Dois estudos anteriores analisaram os níveis de CIP2A expressão no CRC e demonstrou aumento dos níveis em CRC em relação a mucosa normal, consistente com os resultados relatados aqui [13], [14]. Além disso, uma estreita correlação entre os níveis CIP2A e Myc tem sido observado antes [3], [13] e mostramos aqui que os níveis elevados de CIP2A são obrigados a manter a expressão Myc em linhas celulares de CRC. Surpreendentemente, a correlação com OS foi observada em apenas um dos estudos anteriores [14]. Enquanto não sabemos a razão exata para a discrepância, notamos que tanto Teng et al. [14] e nosso estudo atribuída uma percentagem relativamente elevada de pacientes para o grupo de baixa expressão (68 e 50% respectivamente), enquanto Böckelman et al. [13] definida apenas 15% dos pacientes com tumores de expressão CIP2A tão baixas. Nós sugerimos que essas diferenças na estratificação dos pacientes de acordo com os níveis CIP2A pode explicar os diferentes resultados. A noção de que CIP2A é sobre-expresso no cancro do cólon, aumentando desse modo os níveis de proteína Myc e que influencia a sobrevivência do tumor relacionada, é consistente com resultados anteriores em outros tumores sólidos [6]; [7]; [8]; [9]. Um estudo prospectivo será necessário para avaliar se a expressão CIP2A no nível de proteína ou mRNA pode servir como um marcador preditivo para a sobrevivência de pacientes com CCR.
Foi mostrado anteriormente que a CIP2A estabiliza c-Myc, inibindo o seu PP2A a degradação mediada por células tumorais em [3]. Consistente com este modelo, o presente estudo mostra que a regulação negativa da proteína c-Myc é observado quando é silenciado CIP2A com ARNsi ou shRNAs em células de carcinoma colorectal. Devido ao fato de que usamos linhas de células com mutações diferentes para pathway oncogênico comumente mutado em CRC (Caco2: APC
mut, KRAS
em peso, Pi3K
em peso; HCT116: APC
em peso, ß- catenin
mut, KRAS
mut, Pi3K
mut; SW620: APC
mut, KRAS
mut, Pi3K
wt), postulamos que a dependência da expressão da proteína c-Myc em CIP2A é independente da presença de mutações em WNT, PI3K /mTOR ou MAPK-vias, mas este terá de ser avaliada. Nós também descobrimos que a depleção de shRNA mediada por CIP2A em células de carcinoma do cólon HCT116 reduziu acentuadamente seu potencial de crescimento. Isto é consistente com os relatos de que a inibição CIP2A resultou em paragem do crescimento e potencial clonogénico diminuídos em vários outros tumores [6]; [7]; . [8]
PP2A desfosforila pAkt e CIP2A aumenta PI3K /mTOR através da inibição mediada PP2A desfosforilação de pAKT nos carcinomas hepatocelulares (HCC) [20]; [21], [22]. Os nossos resultados mostram que a depleção de expressão CIP2A em células de cancro colorectal não afecta a sinalização de Akt, em contraste com observações em células de carcinoma hepatocelular. Nós também não encontrou ou apenas pequenas alterações nos níveis PAKT ou conhecidos alvos a jusante de Akt. O mais provável, portanto, atividade PP2A em direção a algum de seus substratos (Akt) difere entre os diferentes tecidos.
Pouco se sabe sobre o mecanismo subjacente a expressão aumentada de CIP2A em células malignas. No cancro gástrico,
Helicobacter pylori
infecções up-regular
expressão CIP2A
através de uma via dependente Src /Erk [11]. O papilomavírus humano 16E7 oncoproteína regula positivamente
CIP2A
no cancro do colo do útero [12]. Atualmente não está claro o que contribui para CIP2A superexpressão no câncer de cólon. Dois resultados suportam a hipótese de que a expressão CIP2A no cancro do cólon é a jusante da via de MAPK. Primeiro, trabalhos anteriores mostraram que a expressão CIP2A está positivamente correlacionada com a expressão de EGFR [13]. A via da MAPK é um dos principais alvos de sinalização de EGF. Por outro lado, mostrámos que CIP2A é regulada negativamente após inibição da via da MAPK em linhas celulares de carcinoma do cólon três; downregulation em linhas de células albergando um
KRAS
mutação (HCT116, SW620) é mais pronunciada do que em Caco2 não portadora de uma mutação de MAPK-via. Indução de CIP2A pode, portanto, ser um mediador crítico que liga a sinalização mitogênica desregulamentado a expressão de c-Myc reforçada no CRC.
Em conclusão, os resultados deste estudo mostram que
CIP2A
está associada com a sobrevivência câncer relacionado colorectal. Alta expressão de
CIP2A
mRNA está correlacionada com a redução da DFS e OS. Portanto,
CIP2A
representa um novo fator prognóstico no diagnóstico do cancro colo-rectal. Além disso, CIP2A pode ser um alvo terapêutico promissor no desenvolvimento de terapias para o cancro colorectal.
Informações de Apoio
Figura S1. curvas
Kaplan-Meier de sobrevida livre de doença de todos os pacientes (n = 226) em relação ao
CIP2A
status de expressão do mRNA na análise microarray publicado. (A B) DFS de todos os pacientes de acordo com o conjunto de sonda microarray
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s001
(EPS)
Figura S2..
doença livre sobrevida de pacientes com câncer de cólon em estágio UICC I-III, agrupados de acordo com
CIP2A
status de expressão do mRNA. (A) UICC I; (B) UICC II; . (C) UICC III
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s002
(EPS)
Figura S3. A análise de regressão linear
de relativa
CIP2A
expressão de mRNA normalizado para dois genes de limpeza, b2MG e GAPDH (n = 104; R
2 = 0,86). A regressão linear é altamente significativa (p 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0075292.s003
(PSD)
Tabela S1. .
As sequências dos iniciadores
doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s004
(DOCX)
Tabela S2.
Características dos pacientes com CRC e de associação entre a
CIP2A
expressão e variáveis clínico-patológicas (invasão linfática e localização foi documentada para cada 100 doentes)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0075292.s005
(DOCX)
Reconhecimentos
Agradecemos Christian Jurowich, Christoph Isbert e Andreas Thalheimer para a recolha de amostras de tumores.