Abstract

Fundo

invasão linfoma T e metástase 1 (Tiam1) é um modificador potencial de desenvolvimento e progressão do tumor. O nosso estudo anterior in vitro e em ratinhos nus sugerido um papel na promoção de Tiam1 invasão e metástases de cancro colo-rectal (CRC). No presente estudo, geramos Tiam1 /C1199-CopGFP ratinhos transgénicos para investigar o tumorigenetic, alterações invasivo e metastático no cólon e recto, de tipo selvagem e ratinhos transgénicos Tiam1 sob 1,2-dimetil-hidrazina tratamento (DMH).

Métodos

os ratos transgênicos foram produzidos pelo método de microinlectlon pronuclear. Whole-body imagiologia de fluorescência (Lighttools, Edmonton, Alberta, Canadá), por PCR e técnicas de imuno-histoquímica (IHC) foram aplicados sequencialmente para identificar os ratinhos transgénicos. O agente cancerígeno DMH (20 mg /kg) foi usada para induzir tumores colorrectais embora intraperitoneal (ip) injecções uma vez por semana durante 24 semanas a partir da idade de 4 semanas em ratinhos transgénicos ou não transgénicos. Tiam1

resultados

Nós com sucesso gerado Tiam1 /C1199-CopGFP ratinhos transgénicos e induziu tumores primários no intestino de ambos tipo selvagem e ratinhos transgénicos Tiam1 por tratamento DMH. Além disso, os ratinhos transgénicos desenvolveram Tiam1 maior e mais agressivo neoplasia do que os ratos de tipo selvagem. Além disso, coloração imuno-histoquímica revelou que a regulação positiva de Tiam1 foi correlacionada com o aumento da expressão da β-catenina e vimentina, e downregulation da caderina-E nesses camundongos.

Conclusões

Nosso estudo forneceu in vivo provas de que Tiam1 promove invasão e metástase do CRC, muito provavelmente através da activação da via de sinalização Wnt /β-catenina, em um modelo de rato transgénico Tiam1

Citation:. Yu LN, Zhang QL, Li X, Hua X , Cui YM, NJ Zhang, et ai. (2013) Ratos transgénicos Tiam1 Exibição Maior Tumor potencial invasivo e metastático do câncer colorretal após 1,2-dimetil-hidrazina tratamento. PLoS ONE 8 (9): e73077. doi: 10.1371 /journal.pone.0073077

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 21 de junho de 2013; Aceito: 14 de julho de 2013; Publicação: 12 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da China (nos: 81001111, 81071735, 30901791) e da Fundação de Ciência Natural de Guangdong (S2011040003696) .Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação de o manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) contribui a terceira maior tipo de câncer no mundo ocidental. . Recorrência e metástase são as principais causas de morte de CRC. Cerca de 50 por cento dos pacientes com CCR morrerão por causa da complicação de metástases. Apesar de pesquisas identificaram vários genes que são responsáveis ​​pelo desenvolvimento de CRC, os acontecimentos moleculares que estão envolvidos nos processos complexos de CRC metástase permanecem em grande parte desconhecida.

invasão e metástase do linfoma T 1 (Tiam1), um nucleótido guanina factor de troca que activa selectivamente a Rho-GTPases como Rac, foi originalmente identificado como uma invasão-indução e o gene de indução de metástases em células de linfoma T [1]. Tiam1 é um modificador potencial da iniciação e progressão do tumor. Foi provado ser envolvido em Rac-regulação da polimerização da actina, a adesão celular e a motilidade, sobrevivência celular e na progressão do ciclo celular [2], [3]. No entanto, as investigações têm sugerido que Tiam1 tem efeitos opostos sobre diferentes tipos de câncer. Alguns estudos demonstraram que a regulação positiva de Tiam1 está correlacionada com o comportamento agressivo de câncer humano e má evolução clínica de pacientes em vários tipos de tumores malignos, tais como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de fígado, carcinoma nasofaríngeo, bem como epidermóide de esôfago carcinoma de células (CICAc) [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Enquanto, por outro lado, Tiam1 potencia a adesão célula-célula homotípica e inibe a invasão de células de carcinoma de células renais [10]. Além disso, desempenha um papel Tiam1 invasão-supressor em células Madin-Darby de rim canino (MDCK) [11]. Um ratinho knock-out Tiam1 é relativamente resistente à indução química de tumores da pele [12]. Na pele humana da engenharia de tecidos, depleção Tiam1 em fibroblastos dérmicos levou a uma maior capacidade de invasão de queratinócitos epidérmicos com características pré-malignas [13].

O nosso estudo anterior demonstrou que Tiam1 foi regulado positivamente em tecidos de CRC e nível de expressão elevada foi Tiam1 intimamente associada com potencial agressivo e metastático em CRC. O silenciamento de Tiam1 em linhas celulares de CRC resultou na inibição da migração celular e invasão in vitro, e de metástases em ratinhos nus [9]. A fim de melhor compreender o papel e o mecanismo de Tiam1 na progressão de CRC, geramos ratinhos transgénicos pCDFl-Tiaml-copGFP e investigada a influência de Tiaml sobre o desenvolvimento de carcinomas do cólon e recto, que foram induzidos pelo carcinógeno químico (DMH ), em conjunto com a observação histológica de invasão local e metástases à distância.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Southern Medical (número de autorização: scxK2007 – 0005). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Geração de camundongos transgênicos Tiam1 /C1199-CopGFP

O cDNA de comprimento total de Tiam1 de C1199 foi clonado para o vector de lentivírus pCDF1-CopGFP. Os ratinhos transgénicos foram produzidas pelo método de microinlectlon pronuclear. Um total de 60 super-ovularam e 33 ratinhos ICR pseudo-grávidas foram empregadas no experimento. Lentivírus contendo o gene TIAM1 /EGFP foi microinjectado pronúcleo de cada embrião. Os embriões foram cultivados durante 72 h em meio e de fase de mórula FHM embriões foram transferidos para os oviductos de 0-5 dias pós-coito pseudográvida. Ratos estavam grávidas e os filhotes foram entregues em 20-21 dias.

Identificação de camundongos transgênicos Tiam1 /EGFP

ratinhos ICR normais foram utilizados como controle. Whole-body imagiologia de fluorescência (Lighttools, Edmonton, Alberta, Canadá), por PCR e técnicas de imuno-histoquímica (IHC) foram aplicados sequencialmente para identificar os ratinhos transgénicos. Os ratinhos transgénicos da mesma ninhada e os seus animais não transgénicos foram genotipados por PCR utilizando os seguintes iniciadores para Tiam1: 5 ‘AAGACGTACTCAGGCCATGTCC 3’ e 5 ‘GACCCAAATGTCGCAGTCAG 3’. O ADN genómico foi preparado a partir de biópsias da cauda de rato. O perfil de temperatura de PCR foi de 94 ° C durante 45 s, 58 ° C durante 45 s, e 72 ° C durante 45 s com a extensão do último ciclo durante 10 minutos a 72 ° C. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose com brometo de etidio sob luz ultravioleta. A PCR-análise revelou que 60 dos 124 animais foram transgênica. O IHC foi realizada como previamente descrito [9]. anticorpo policlonal de coelho contra Tiam1 (Santa Cruz, CA, EUA, diluição 1: 200), de ratinho anti-β-catenina (BD, MO, 1: 500), de ratinho anti-E-caderina (BD, MO, 1: 500) , de murganho anti-vimentina (Cell Signaling Technology, PO, 1: 200) foram usadas

extracção de ARN e a transcrição reversa-PCR (RT-PCR)

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol. (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os RNAwas pré-tratado com DNase e usado para cDNAsynthesis com hexâmeros aleatórios. O ARNm de Tiam1 foi amplificado por PCR a partir de amostras de ADNc de ratos e animais transgénicos não-transgénicos. Os seguintes iniciadores foram utilizados para a amplificação de Tiam1: iniciador de sentido directo, 5-AAGACGrACTCAGGCCATGTCC-3; iniciador anti-sentido, 5-GACCCAAATGTCGCAGTCA-3. desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato foi amplificada como um controlo interno utilizando iniciador de sentido, 5-AATCCCATCACCATCTTCCA-3, e iniciador anti-sentido, 5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3. O tamanho apropriado de produtos de PCR foi confirmada por eletroforese em gel de agarose.

O tratamento com DMH

Para investigar o impacto da Tiam1 no desenvolvimento do cancro colorectal e progressão, camundongos transgênicos e não transgênicos Tiam1 foram randomizados em dois grupos, respectivamente, tratados com DMH (grupos de teste) ou não (grupo controle). grupos de controlo 1 e 2 receberam 0,1 ml PBS i.p. uma vez por semana durante 10 semanas. Os grupos de teste receberam o agente cancerígeno DMH (20 mg /kg) através de injecção intraperitoneal (i.p.) uma vez por semana injecções durante 24 semanas a partir da idade de 4 semanas em ratinhos transgénicos ou não transgénicos Tiam1. Todos os ratos tinham livre acesso à água da torneira e uma dieta padrão. Todos os animais foram observados diariamente para sinais clínicos da doença.

Resultados

Geração e identificação de camundongos transgênicos Tiam1 /EGFP

Um total de 823 ovos foram obtidos a partir de 60 camundongos ovulado-super. O Tiam1-EGFP recombinado lentivírus foi microinjectada no espaço perivitelino de 628 ovos, os quais foram então transferidos para 33 ratos pseudo-grávida ICR. 21 dos ratos pseudográvidas 33 foram impregnados. 67 ratinhos transgénicos potenciais Tiam1 /EGFP nasceram. Cinco ratinhos transgénicos Tiam1-EGFP positivos, identificados como F0-17 (♂), F0-36 (♀), F0-48 (♂), F0-52 (♀) e F0-61 (♀), foram gerados pela pró técnica de microinjeção -nuclear. Um total de 44 F1 positivo (Figura S1) e 146 ratinhos transgénicos F2 positivos foram gerados por Tiam1 F0-36 (♀) e F0-48 (♂). Todas as sequências de PCR do gene Tiam1 positivas foram emparelhados com a sequência do gene Tiam1 que está disponível a partir de NCBI (dados não mostrados).

A imagiologia de fluorescência de corpo inteiro demonstrou forte sinal de GFP nos órgãos do Tiam1 homozigótica F1 /EGFP ratinhos transgénicos, incluindo os do cólon, estômago, pulmão, rim e Tese (Figura 1A). secção congelada destes órgãos de ratinhos transgénicos EGFP também exibem forte Signa GFP (Figura 1B). No entanto, não se observou qualquer sinal ou apenas sinais fracos nos ratinhos de tipo selvagem (Figura 1A e 1B). A análise imunohistoquímica utilizando anticorpo Tiam1 um coelho anti-humano confirmou que a proteína Tiam1 humana foi fortemente expresso no cólon de ratos transgénicos Tiam1, enquanto que foi detectado apenas fracamente nos ratinhos do tipo selvagem (Figura 1C).

( a e B) Observação de expressão EGFP e Tiam1 em differente órgãos (a) e correspondentes secções congeladas (B) do transgênica pCDFl-Tiaml-copGFP (TG) ratos e tipo selvagem camundongos (WT) por um sistema de imagem de fluorescência de corpo inteiro . (C) Detecção de proteína Tiaml no cólon dos ratinhos transgénicos pCDFl-Tiaml-copGFP e ratinhos do tipo selvagem através de coloração imuno-histoquímica. (D) de detecção de ARNm Tiaml no cólon de 10 ratinhos transgénicos pCDFl-Tiaml-copGFP 1 e ratinhos do tipo selvagem por meio de RT-PCR.

A expressão de ARNm Tiam1 humano no cólon foi analisada por RT-PCR e só podia ser detectado em ratinhos transgénicos com Tiam1 β-actina utilizada como um controlo de expressão (Figura 1D). O tratamento com DMH não induziu a expressão de Tiam1 endógena no nível de ARNm, nem em animais transgénicos nem nos seus companheiros de ninhada não transgénicos (dados não mostrados).

Efeito do pCDFl-Tiaml-copGFP em DMH induzida tumorigênese

foram identificadas oito semanas após o DMH-tratamento, a hiperplasia do tecido linfóide no mesentério e da parede intestinal em ambos pCDFl-Tiaml-copGFP (3/5) e crias da mesma ninhada não transgénicos (2/5). Hyperrugosity na mucosa rectal e espessamento do epitélio intestinal ocorreu em ambos transgénico (4/5) e os ratinhos do grupo de tipo selvagem (3/5) às 12 semanas a seguir DMH-tratamento. 16 semanas mais tarde, adenoma colorrectal foi observada em ambos transgénico (2/5) e os ratinhos do grupo de tipo selvagem (1/5). 20 semanas mais tarde, o tumor colorrectal ocorreu em ambos transgénico (1/6) e os ratinhos do grupo de tipo selvagem (06/01) que foi histologicamente diagnosticado como adenocarcinoma colo-rectal (Tabela 1). Seguindo o DMH-tratamento, 21/21 (100%) e ratinhos transgénicos Tiam1 18/21 (85,7%) da mesma ninhada não transgénicos desenvolveram tumores no prazo de 32 semanas (Tabela 1). A Figura 2A e 2C mostram a macro-representativo lesões e alterações histológicas (por H E de coloração) ocorreu em ratinhos em dois pontos correspondentes pontos de tempo. prolapso rectal foi observada em 52,4% (11/21) dos ratinhos transgénicos Tiam1 (Figura 2B).

(A) Tumores induzidos em tratamento representativos DMH no cólon e recto, de tipo selvagem (WT) (superior painel) e Tiaml transgénicos (TG), de animais (painel inferior) em diferentes pontos de tempo. (B) O prolapso retal (seta) em um Tiaml transgênica (TG) mouse. (C) coloração HE das lesões tumorais representativas do cólon e do reto de tipo selvagem (WT) (painel superior) em diferentes pontos no tempo.

A grande maioria dos tumores encontrados em do cólon estavam localizados em 1 a 8 cm do ânus (Figura 3A). Em ambos os genótipos, os tumores não foram encontrados no intestino delgado. A incidência de tumores e o número de tumores por animal não foram afectados por Tiam1, tal como foram analisados ​​em 20 semanas, 24 semanas e 32 semanas após o tratamento com DMH (dados não mostrados). No entanto, quando o volume médio do tumor foram analisadas em 29 tumores seleccionados aleatoriamente a partir de cada um dos dois grupos, observou-se um aumento significativo do tamanho do tumor em ratinhos transgénicos Tiam1 (Figura 3B e Quadro 2) com um volume de tumor médio (23.260 ± 2,119 milímetros

3) 4,7 vezes superior (P . 0.001) do que em camundongos selvagens (4,929 ± 0,580 milímetros

3)

(a) Distribuição de tumores colorretais em ratos após o tratamento DMH. (B) Comparação de volume de tumor colorretal em ratos transgénicos e de tipo selvagem camundongos.

Efeito da pCDFl-Tiaml-copGFP na capacidade invasiva e metastática do DMH induzida CRC

Para determinar a natureza das massas colorrectais, examinámos os tumores usando métodos histológicos. Por análise microscópica, nos ratinhos não transgénicos, a maioria dos tumores desenvolvidos no âmbito do tratamento de DMH exibida lesões com apenas uma profundidade limitada da invasão neoplásica. Como foi mostrado na Figura 4A-B, o epitélio do cólon neoplásica formada uma massa tipo placas, que era distinto da mucosa normal adjacente. As glândulas neoplásicas estendida para dentro e através da submucosa, mas não encostando parede muscular.

tumores (A-B) desenvolveram lesões apresentadas sob tratamento com DMH única profundidade limitada da invasão neoplásica. As glândulas neoplásicas estendida para dentro e através da submucosa, mas não encostando parede muscular. (C-F) Tiaml ratinhos transgénicos continham tumores mais agressivos e exibida uma penetração mais profunda das células neoplásicas na camada muscular, bem como nó de linfa dentro da parede do intestino (G-H).

De acordo com o maior volume de tumor desenvolvido em tratamento DMH, os ratinhos transgénicos Tiaml também continha tumores mais agressivos e exibida uma penetração mais profunda das células neoplásicas na camada muscular (Figura 4C-F), bem como nó de linfa dentro da parede do intestino (Figura 4G-H) , onde se formaram glândulas distintas, em comparação com a mesma ninhada não transgénicos. Estes tumores agressivos invadido livremente através de todas as camadas do intestino formando grandes glândulas cheio de mucina.

Além tumores locais invasão e envolvimento do tecido de linfonodos, ratinhos transgénicos Tiaml também gerado espalhou para locais distantes, incluindo peritoneu, fígado e pulmão (Figura 5). Como foi resumido na Tabela 1, 52,4% (11/21) ratinhos transgénicos Tiaml gerado metástase distante 32 semanas após o tratamento de DMH. No entanto, não há lesões de metástase ou micro-metástases distantes foram encontrados em todos os ratinhos não transgénicos 21 no mesmo ponto do tempo (Tabela 1). Ainda mais, a infiltração de células tumorais em pequenos vasos foram também observados em ratinhos transgénicos Tiaml, enquanto não em ratinhos não transgénicos (Figura 5).

A activação da via β-catenina foi associada com pCDFl -Tiaml-copGFP animais transgénicos

próxima examinaram a expressão de β-catenina, marcador epitelial e-caderina, e o marcador mesenquimais vimentina no desenvolveram tumores em ratinhos de tipo selvagem. Como foi mostrado na Figura 6, a análise imuno-histoquímica apresentado que os tumores formados em grupo Tiaml-transgénicos exibiram maior expressão de total e nuclear β-catenina, e coloração maior fraco de E-caderina, enquanto que a coloração mais forte de vimentina, em comparação com o grupo de tipo selvagem .

Discussão

Tiam1 é sugerido para desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão de cancros humanos. Na base molecular, estudos in vitro forneceu dados sobre o efeito de Tiam1 carcinogénese e invasão tumoral. Além disso, estudos in vivo mostraram que Tiam1 envolvidos no desenvolvimento do câncer e metástase em ratinhos nus.

O nosso estudo anterior mostrou que a Tiam1 foi directamente correlacionado com o potencial metastático de cancro colorectal, e seu esgotamento reduziu significativamente o crescimento do tumor e capacidade metástase de células de CRC [9]. A fim de melhor compreender o papel eo mecanismo de Tiam1 no CRC metástases in vivo, neste estudo, desenvolvemos ratos pCDFl-Tiaml-copGFP-transgênicos e induzida a formação de tumores colorectal através de um tratamento de DMH. Através da análise histológica, verificou-se que embora a incidência de tumor e o número de tumores por animal não foram afectados por Tiam1, os volumes médios dos tumores foram significativamente aumentados no grupo Tiam1 transgénica do que em ratinhos de tipo selvagem. Além disso, descobrimos que os ratos Tiam1-transgênica formado tumores mais agressivos, incluindo a invasão local e envolvimento do tecido dos linfonodos, em comparação com ratos de tipo selvagem. Mais importante ainda, os ratinhos transgénicos Tiaml também gerado tumores que se espalham para locais distantes, incluindo peritoneu, fígado e pulmão, assim como a infiltração de células tumorais em pequenos vasos. Embora sem lesões metástase ou micrometastáticas distantes foram encontrados no grupo de tipo selvagem.

Duas funções opostas de Tiam1 em celular migração, invasão, e adesão são apoiadas por estudos anteriores em diferentes contextos celulares. Por um lado, tem sido relatado que a presença de Tiam1 tende a estar associada com bom prognóstico no cancro gástrico [14]. Em células de Madin-Darby de rim de canino (MDCK) e células NIH3T3 transformadas com Ras, Tiam1 induz uma transição mesenquimais-epiteliais (TEM) e inibe a migração de células através do aumento de adesão célula-célula mediada por caderina [11], [15], [16 ]. Em linhas celulares de carcinoma renal humano célula, inibe a invasão Tiam1 através de regulação positiva induzida por Rac do inibidor tecidual de metaloproteinases-1 (TIMP-1) e TIMP-2 [10]. Tem sido documentado que a sinalização Rac pode antagonizar a actividade Rho diretamente no nível GTPase, eo equilíbrio recíproco entre Rac e Rho atividade determina a morfologia celular, migratória e capacidade invasiva [17]. Portanto, os efeitos de inibição de Tiam1 sobre migração e invasão em diferentes contextos pode ser causado pela supressão mediada por Rac da atividade Rho.

Por outro lado, também existem inúmeros relatos que apoiaram o papel de Tiam1 na promoção de transformação maligna, a proliferação do tumor, invasão e metástase [9], [18], [19], [20], [21]. Tiam1 tem sido implicada na transformação oncogénica de células NIH3T3 [22]. Além disso, Tiam1 aumenta invasão e metástase em várias linhas celulares de cancro humanas, incluindo melanoma e câncer de mama [18], [23]. Além disso, nosso estudo anterior também sugere um papel importante de Tiam1 na migração e metástase de células CRC [9]. O nosso estudo fornecem evidências de que a introdução do gene Tiam1 humana na linha germinal aumentou significativamente a invasão e metástase de câncer colorretal, enquanto apenas discretamente promove o desenvolvimento de tumores colorretais que foram induzidos em tratamento DMH. Assim, nossos dados, principalmente, apoiar a função de promoção invasivo e metastático de Tiam1 no CRC. Em outro estudo, comparando tumorais comportamentos biológicos no mutante APC Min (múltipla neoplasia intestinal) ratinhos que expressam ou falta Tiam1, os autores descobriram que a depleção Tiam1 causada invasão aumentada de tumores intestinais malignas, embora a formação e crescimento de pólipos in vivo foram significativamente reduzida [24]. A discrepância evidente entre os nossos resultados atuais eo estudo acima pode potencialmente ser atribuído ao fundo mutante APC e tratamento DMH. Assim, os efeitos de diferentes Tiam1 sobre a migração e invasão são provavelmente dependente de diferentes contextos, tais como o tipo de célula, substrato, transformação de estado, e do estado de activação das pequenas proteínas G em vários tipos de células. Para melhor ilustrar o papel da Tiam1 em progressão e metástase do câncer, um estudo mais aprofundado é imprescindível para melhorar a nossa compreensão da regulação a montante do Tiam1.

Wnt /β-catenina sinalização criticamente regula o desenvolvimento e progressão da CRC [25]. A localização nuclear de β-catenina é fundamental para a activação canónica sinalização Wnt. Os membros da família Rho de GTPases pequenas, incluindo RhoA, Rac1, e Cdc42, têm sido mostrados para participar na actividade de promoção de sinalização Wnt e controlar a polaridade celular planar em Drosophila [26]. Rac1 activação induz a translocação nuclear de β-catenina [27]. Como um factor de troca específicas do Rac1, Tiam1 promove a interacção de Rac1 e β-catenina, e é essencial para a activação mediada por Rac1 da via Wnt canónica [28]. No presente estudo, foi demonstrado que a introdução de Tiam1 na linha germinal causou um aumento significativo de acumulação nuclear de β-catenina, diminuindo de membrana de E-caderina, e o enriquecimento de vimentina no tumores colo-rectais com capacidade mais invasiva. Assim, o nosso estudo fornece evidências de que Tiam1 promove invasão e metástase do CRC, e implica que Wnt /β-catenina via pode ser envolver no efeito da Tiam1 no CRC invasão e metástase in vivo.

Em conclusão, nosso estudo forneceu evidências in vivo de apoio que Tiam1 promove invasão e metástase do CRC, muito provavelmente através da activação da via de sinalização Wntβ-catenina. No entanto, de Wnt /β-catenina via de sinalização não pode ser o único mecanismo por meio do qual Tiam1 poderia promover a progressão de CRC. Mais estudos são necessários para estabelecer a rede reguladora do Tiam1 na progressão do cancro.

Informações de Suporte

Figura S1.

Identificação de ratinhos transgénicos Tiam1 /EGFP por PCR. Os ratinhos transgénicos da mesma ninhada e os seus animais não transgénicos foram genotipados por PCR utilizando os seguintes iniciadores para Tiam1: 5 ‘AAGACGTACTCAGGCCATGTCC 3’ e 5 ‘GACCCAAATGTCGCAGTCAG 3’. O DNA genômico foi preparado a partir de biópsias de rato-cauda

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073077.s001

(TIF)