Sumário

Nós informou recentemente que Riccardin D (RD) foi capaz de induzir a apoptose, visando Topo II. Aqui, descobrimos que RD induzida paragem do ciclo celular na fase G2 /M em células PC-3, e causou danos no DNA notável como evidenciado pela indução de γH2AX focos, micronúcleos e fragmentação do DNA no ensaio do cometa. Tempo estudos cinética e de dose-dependentes mostrou que ATM /Chk2 e ATR /Chk1 vias de sinalização foram sequencialmente ativadas em resposta a RD. O bloqueio da sinalização ATM /ATR levou à atenuação de γH2AX induzida por RD, e para a recuperação parcial da proliferação das células. Além disso, a exposição RD resultou na inactivação do gene BRCA1, supressão de AR e a actividade de reparação NHEJ, e a regulação negativa das expressões e actividades de ligação a DNA-finais de Ku70 /86. Consistente com as observações, os dados de microarray exibida que RD desencadeada as alterações nos genes responsáveis ​​pela proliferação de células, do ciclo celular, lesão e reparação do ADN, e a apoptose. A administração de RD de xenoenxerto de murganhos reduziu o crescimento do tumor, e alterações causadas coordenadamente na expressão de genes envolvidos na reparação de dano de ADN e, juntamente com a apoptose celular. Assim, esta descoberta identificou um novo mecanismo pelo qual RD afeta o reparo do DNA e atua como um agente de danos ao DNA no câncer de próstata

Citation:. Hu Z, Kong F, Si M, Tian K, Yu LX, Jovem CYF , et ai. (2013) Riccardin D exerce a sua actividade antitumoral através da indução de danos no DNA em PC-3 células cancerosas da próstata

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 8 (9): e74387. doi: 10.1371 /journal.pone.0074387

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de maio de 2013; Aceito: 31 de julho de 2013; Publicação: 17 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (30772594, 30973551, 30925038) e da Fundação de Ciência Natural da província de Shandong (2009ZRB01346). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é um dos tumores malignos mais comuns em homens e terapia hormonal retirada permanece eficaz para CaP avançado. No entanto, o desenvolvimento de cancro da próstata refractário a hormonas (HRPC) ocorre inevitavelmente após a terapia hormonal privação [1,2]. Há poucas opções para a gestão bem sucedida de HRPC. Recentemente, docetaxel, um derivado da planta alcalóide, tem vindo a emergir como um agente activo para melhorar a qualidade das condições de vida e de sobrevivência em pacientes com HRPC metastático [3,4]. O sucesso do docetaxel tem levado a muitos esforços feitos para isolar vários produtos químicos que ocorrem naturalmente e para investigar os mecanismos de acção dos compostos bioactivos para o desenvolvimento de agentes quimiopreventivos ou e /ou terapêuticos para o tratamento de cancros, incluindo HRPC [5].

um dos reagentes químicos mais eficazes utilizados na quimioterapia do cancro são indutores de ADN dano, o que pode causar uma variedade de lesões do ADN através de vários mecanismos. Por exemplo, camptotecina e etoposídeo pode provocar quebras de cadeia simples (SSB) ou quebras de ADN de cadeia dupla (LAP), aprisionando complexos covalentes DNA-topoisomerase, posteriormente, levando à morte celular [6,7]. Assim, ADN de topo I e II, especialmente de topo II, acredita-se ser alvos bem estabelecidos na terapia do cancro.

Dependendo do tipo de lesões do ADN, os pontos de verificação do ciclo celular específicos e cascatas celulares são activadas por DNA- agentes prejudiciais. Como amplamente aceito, ataxia telangiectasia mutado (ATM) e ataxia telangiectasia e Rad3 relacionados (ATR) vias de sinalização desempenham papéis importantes na resposta ao dano no DNA. ATM responde, principalmente, ao LAP, e inicia a fosforilação de alvos a jusante, tais como Chk2, BRCA1, e proteínas NBS1 no local de dano do ADN [8]. Estes factores actuam em conjunto para induzir G1, S e G2 do ciclo celular prisões, reparação de ADN, e /ou a activação de percursos de morte celular [9]. Enquanto ATR é activado em resposta à replicação de stress, que desencadeia a activação de Chk1, que por sua vez leva à fosforilação de Cdc25 e impede a activação de CDK1 /ciclina B e entrada mitótico [10]. Após a LAP, o processo de adesão LAP final envolve várias proteínas e enzimas, até o encerramento não homóloga juntar (NHEJ) e recombinação (HR) mecanismos de reparação homólogos [11,12]. Por exemplo, o heterodímero Ku70 /86 é crítico na NHEJ, uma vez que se liga às extremidades de ADN quebradas e recruta proteínas relacionadas com a reparação, incluindo a proteína quinase dependente de ADN, a XRCC4 e a ADN-ligase IV [13]. Demonstrou-se que os danos do ADN está implicado para eliciar tanto ATM e ATR sinalização [14]. Activação destas duas vias com possíveis defeitos nos pontos de verificação do ciclo celular e na resposta de reparação do ADN pode ser relevante na determinação da potência e eficácia de DNA indutores de danos.

Temos informou recentemente que Riccardin D (RD), um macrocíclico composto bisbibenzyl da planta liverwort chinesa

Dumortiera hirsute

[15], foi capaz de induzir apoptose de células de leucemia humana, visando [16] topo II. Neste estudo, descobrimos que o tratamento RD levou à indução de danos no DNA e a inibição de produtos de resposta envolvidos na reparação do ADN.

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamentos

LNCaP humano, células DU145 PC-3 e (A American Type Culture Collection (ATCC)) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Hyclone), complementado com soro bovino fetal a 10% (Hyclone). As células foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C até atingir aproximadamente 50-70% de confluência, em seguida, tratado com produtos químicos. DR foi isolado e purificado, nos nossos laboratórios, tal como descrito anteriormente [15]. RD e etoposido (VP-16) foram preparadas em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e armazenados em pequenas alíquotas a -20 ° C.

imunotransferência

Após o tratamento, tal como indicado, os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão RIPA. As proteínas (80 ^ g) foram separados por SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore). As membranas foram sondadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários apropriados: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), ciclina E, poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), Bcl-2, Bax e nucleolina (Santa Cruz) , Ku70 e Ku86 (Ativo Modif), CDC25B (BD Biosciences), ciclina A (Anbo Biotecnologia), ciclina B1 (Novus Biologicals), Cdc25C, Ser

1981-fosforilada-ATM, Tyr

15 fosforilada-Cdc2 , Ser

428 fosforilada-ATR, Ser

296-fosforilada-Chk1, Thr

68-fosforilada-Chk2, Ser

1524-fosforilada-BRCA1, Ser

139 fosforilada H2AX histonas (γH2AX), PP2AA, PP2AB, e PP2AC (Cell Signaling), PPP4C (Bethyl, Montgomery, TX, EUA), IgG-TRITC (Abcam) seguido de bloqueio com leite seco isento de gordura a 5%. Após a remoção dos anticorpos primários, as membranas foram lavadas com TBST e incubadas com peroxidase de IgG de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários, então visualizadas por melhorado sistema de detecção de quimioluminescência (Millipore).

Ensaio

O crescimento celular e a viabilidade celular

As células foram semeadas a 4000 células /poço em microplacas (Roche), e exposto a RD ou veículo. As curvas de crescimento celular foram obtidos pela célula em tempo real Analisador SP Instrumento (Roche). Os valores das células de indexação (IC) foram normalizados em relação ao valor de IC do ponto de tempo em que o produto químico adicionado. Para a análise de viabilidade celular, as células PC-3 foram pré-tratadas com 10 mmol /L de cafeína durante 1 hora, e expostos a RD ou veículo durante 24 h. A proliferação celular foi então analisada por (4, 5- 2-dimetiltiazol-il) -2, brometo de 5-difenil-2H-tetrazólio (MTT, Sigma) ensaio colorimétrico.

ensaio

ciclo celular e apoptose 3-

Após o tratamento com o RD durante 24 h, as células foram fixos e tratou-se com iodeto de propídio (PI) (Sigma) durante 30 min no escuro. ciclo celular foi analisada por um FACS (Becton Dickinson, EUA). A apoptose foi estudada usando um Anexina V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) por citometria de fluxo.

micronúcleo ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com RD, DMSO ou VP-16 (10 nmol /L) durante 24 h. Após a fixação e permeabilização, as células foram coradas com DAPI (Sigma). Micronúcleos em células foram marcados sob um microscópio fluorescência de fase (Nikon). Pelo menos 1000 células por amostra foram marcados para análise.

Neutral ensaio cometa

As células foram tratadas com produtos químicos, como indicado acima. LAP DNA foram detectados utilizando o Trevigen Comet, Ensaio Single Cell Gel Eletroforese Assay (Trevigen). Caudas de cometa foram fotografadas por um microscópio de fase-fluorescência (Nikon) e quantificados por um software Casp. Um mínimo de 100 células foram marcados por tratamento

Imuno fluorescência de coloração de γH2AX e

Células p-BRCA1 cultivadas em lamelas foram fixadas com gelado de metanol /acetona. (1: 1) e incubadas com 3% de BSA em PBS com 0,1% de Triton X-100. A seguir à incubação com anticorpos primários e enxaguamento com PBS, as células foram imunocoradas com anticorpos secundários e contra-coradas com DAPI. As imagens de fluorescência foram capturadas utilizando um microscópio confocal (CarlZeiss).

Microarray e em tempo real A análise de PCR

O ARN total foi extraído a partir de células que foram expostas a produtos químicos, utilizando um RNAiso plus kit (Takara Bio ). Microarray Analysis foi realizada a Genetimes Technology, Inc. (China) na Affymetrix HG-U133 mais duas fichas, e os dados originais foi submetida ao GEO (Série GSE37812). Para os ensaios de PCR quantitativa (qPCR), o ADNc foi sintetizado utilizando o kit de RT ReverTra Ás qPCR (Toyobo). qPCR foi realizado com SYBR Verde reacção Master Mix num Sistema de PCR (Eppendorf Internacional) em tempo real. os níveis de transcrição de genes desejados foram normalizados para o nível de GAPDH. As alterações na expressão de genes foram calculadas usando o ΔΔC

método t. As sequências dos iniciadores são apresentados na tabela 1.

Iniciador directo (5 ‘- 3’)

iniciador reverso (5′- 3′)

Cdc25BGGCTGAGGAACCTAAAGCCCTCGATCTCATCGTGACACAGTCdc25CAGGAACCCCAAAATGTTGCCTGCAGAAGTGGTAAGCTGAGTGcyclin ETCCAAGAGTTTGCTTACGTCACGCCAGGAGATGATTGTTACAGGcyclin AGATGGTAGTTTTGAGTCACCACACACGAGGATAGCTCTCATACTGTcyclin B1ATAAGGCGAAGATCAACATGGCTTTGTTACCAATGTCCCCAAGAGcdc2ACACAAAACTACAGGTCAAGTGGGGAATCCTGCATAAGCACATCCRPA1CTCGGGAATGGGTTCTACTGTCACTTGGACTGGTAAGGAGTGARPA2TGGTAGCCTTTAAGATCATGCCCCTGGATTGCTGATAGGTGCTCRPA3TGATGGAACCCCTTGATGAAGACATGTTGCACAATCCCTAAAGGAXRCC5GACGTGGGCTTTACCATGAGTTCAGTGCCATCTGTACCAAACXRCC6AGTCATATTACAAAACCGAGGGCCCTTGGAGGCATCAACCAAAAAMSH6AGCTTAAAGGATCACGCCATCAAGCACACAATAGGCTTTGCCGAPDHTGGTCACCAGGGCTGCTTAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTable 1. Q-PCR iniciadores directos e inversos.

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Co-imunoprecipitação

-se alíquotas de proteínas (1,2 mg) de controlo e as células tratadas com RD foram pré-aclarados com proteína A /G Plus agarose (Santa Cruz), na presença de IgG não específica (Santa Cruz), em seguida, incubadas com anticorpos primários e esferas de agarose de 20 ul com mistura contínua durante a noite a 4 ° C. As esferas foram lavadas e aqueceu-se a 75 ° C durante 5 min em tampão de carga antes de immunobloting.

Análise da actividade de ligação de extremidades de ADN de Ku70 /Ku86

Nuclear extractos de controlo ou RD foram preparadas células tenha sido tratada com, e submetido a detecção de actividade de ligação de extremidades de ADN de Ku70 e Ku86 usando um kit de reparação de ADN Ku70 /Ku86 de acordo com as instruções do fabricante (Activo Motif).

ensaio de junção de extremidades de ADN

Para determinar os efeitos de reparação RD no LAP, foi desenvolvido um ensaio de junção de extremidades de ADN isento de células como descrito por Shao C, et ai. [17]. O plasmídeo pUC19 foi digerido com HincII, resultando em uma molécula linear com extremos cerses. O ADN linearizado foi incubada com extracto nuclear (2 ug), em 50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,6), 10 mmol /L de MgCl

2, 1 mmol /l de ditiotreitol, 1 mmol /L de ATP, e 25% (w /v) de polietileno glicol 8000 a 14 ° C durante 6 h ou 24 h. Extracto nuclear de células Raji comprados a partir do Active Motif serviu como um controlo positivo. A NHEJ foi determinada por amplificação por PCR da junção de extremidades reingressaram com iniciadores M13. Os produtos de PCR foram realizadas de ampicilina como um controlo interno. Todos os experimentos foram repetidos três vezes.

NHEJ e reparação HR ensaio

A capacidade de reparo de DNA em células tratadas com RD foi avaliada com os repórteres de RH e NHEJ que são gentilmente cedidas pelo Dr. Gorbunova ( Departamento de Biologia, Universidade de Rochester) [25,26]. A cassete repórter para detectar NHEJ ou HR foi digerido com I-SCEI para induzir LAP. A cassete repórter linearizada de NHEJ ou RH e DsRed foram co-transfectados em células PC-3, após ter sido tratada com o RD ou veículo durante 24 h. As células foram analisadas no aparelho FACScalibur (Becton Dickinson, EUA) utilizando uma curva de fluorescente verde-versus-vermelho. Os dados foram analisados ​​com o software celular Quest (BD Biosciences).

Avaliação do efeito anti-tumoral de RD

in vivo

Para avaliar a

In vivo

efeito do RD da ACP, foram utilizados ratos machos de 6 semanas de idade BALB /c-nu (Vital River Laboratories, Beijing, China). Os ratinhos foram deixados aclimatar durante uma semana após a chegada. xenoenxertos de tumores foram estabelecidos por injecção de 5 × 10

6 células PC-3 nos flancos direitos de ratos. Quando os tumores eram detectáveis, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento e de controlo. A dose inicial foi determinado no momento da par correspondente (dia 1). RD (30 mg /kg) ou placebo (quantidades equivalentes de solvente), foi dado a cada segundo dia por injecção i.p. injecção. Os ratinhos foram monitorizados diariamente seguintes tratamentos, e os tumores foram medidos a cada dois dias, determinando duas dimensões perpendiculares [comprimento (L) e a largura (W)] usando compassos de calibre de Vernier e calculada usando a fórmula V = L x W

2/2. Após o tratamento de 20 dias, todos os ratos foram sacrificados por anestesia ar-éter e seus tumores ressecados para medição de massa tumoral. Os tecidos tumorais foram fixadas em paraformaldeído a 4% e utilizado para análise TÚNEL (Calbiochem), imunotransferência, e imunofluorescência. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Shandong University School of Medicine de Ética (Permit Number: 2.010.038) e conduzido em conformidade

A análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± DP. de, pelo menos, três experiências independentes. A significância estatística da diferença média entre os grupos controle e tratados foi determinada por um teste t pareado, onde

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

RD induz a paragem do ciclo celular e apoptose em células PC-3

Desde RD foi encontrada para induzir a apoptose em células de leucemia e de pulmão células de câncer [16,18], iniciamos o nosso estudo para determinar se RD também exerceu efeito citotóxico sobre as células CaP pela proliferação de células monitorando continuamente. Como mostrado na Figura 1A, a exposição de células PC-3 para RD causada marcadamente a supressão da proliferação celular de um modo dose e dependente do tempo.

Um

, a proliferação celular em resposta a RD foi monitorada pelos valores de índice celular (CI) utilizando xCELLigence sistema.

B

, Após a exposição de células PC-3 para RD durante 24 h, ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo.

C

, análise de Immunoblot de reguladores do ciclo celular em células tratadas com RD.

D

, os níveis de ARNm de G2 /M reguladores do ciclo relacionados de fase em células tratadas com RD foram determinadas por PCR em tempo real. Alterações na expressão dos genes seguintes tratamento RD (10μmol /L) foram também incluídos.

E

, porcentagem de células em apoptose foi analisada por citometria de fluxo.

F

,

a

, análise das formações de micronúcleos em células PC-3 tratado com RD.

b

, a frequência de células PC-3 contendo micronúcleos tratado com RD ou VP-16 durante 24 horas. Barras, DP. *, P 0,05, diferença significativa do grupo não tratado.

Após o tratamento 24h com RD, ciclo celular foi significativamente preso em fase G2 /M com concentrações crescentes. Por conseguinte, o tratamento de RD resultou em diminuições dependentes da dose, na expressão de ciclina E, A e B, que são os marcadores moleculares correlacionados com a fase G2 /M. A família das fosfatases Cdc25 e o alvo a jusante de Cdc2 desempenhar um papel importante na progressão S e G2-M. Nós também observada uma diminuição na expressão de CDC25B, Cdc25C, e fósforo-Cdc2

Tyr15 (forma inactiva) de um modo dependente da dose em células tratadas (Figura 1C). Os ensaios de qPCR mostrou que a expressão do Cdc2 no nível transcrito foi marcadamente reduzida em células tratadas com RD (Figura 1D), o que sugere que RD suprimiu a expressão de Cdc2 ao nível do ARNm, o que por sua vez conduziu a uma redução de fósforo-Cdc2. Enquanto isso, as alterações na expressão de ARNm da ciclina E, A, B, CDC25B, e Cdc25C por RD (Figura 1D) foram semelhantes para as observações da Figura 1C, o que indica que o padrão de respostas celulares foi consistente com a perturbação induzida por RD de ciclo celular em células PC-3. Além disso a interferência com a progressão do ciclo celular, RD era capaz de induzir apoptose sensivelmente de um modo dependente da dose (Figura 1E).

Microarray Analysis revelou que os genes relacionados com a ligação com DNA danificado, a reparação do ADN, do ciclo celular e apoptose foram significativamente alteradas em células tratadas com RD quando comparado com o controlo, como resumido na Tabela S1. Destes genes, observou-se que a ciclina E, A, B, Cdc2, CDC25B, e Cdc25C foram regulados negativamente dramaticamente nas células tratadas com RD, consistente com resultados na Figura 1D.

RD provoca danos no DNA em células CaP

, então, determinado se a exposição a RD em concentrações que foram suficientes para induzir a paragem do ciclo celular e apoptose resultou em danos no ADN, porque DR foi capaz de inibir a topo II em células de leucemia [16]. Como esperado, a formação de micronúcleos era evidente em células tratadas com 5 mmol /L durante 24 h RD, e exibiu um aumento dependente da dose (painel A na Figura 1F), semelhante ao VP-16, um agente de ADN-danos bem documentada. O número de micronúcleos em células expostas a RD foi resumida no painel b na Figura 1F. Portanto, estes resultados sugerem que RD induzida danos no ADN que foi associada com a promoção da paragem do ciclo celular e a apoptose em células PC-3.

Para confirmar a capacidade de RD no desencadeamento de danos no ADN em células APC, examinámos as mudanças de marcadores de dano de ADN por transferência de western. Como mostrado na Figura 2A, RD, foram observados aumentos significativos na fosforilação de H2AX histona

Ser139 (γH2AX), um indicador de ADN resposta a danos no bem-conhecido, em 2h e mantida até 24 horas após o tratamento em ambos dependentes de androgénio (LNCaP) e independente de androgénios CaP (PC-3 e DU145) células. Em termos de proteínas DNA danos resposta, as expressões de fósforo-BRCA1 por RD foram pronunciadas em pontos temporais precoces e caiu nas células após prolongada tratamentos (Figura 2A), sugerindo que a RD induzida resposta a danos no DNA em células APC.

a

, análise de Immunoblot dos níveis de p-BRCA1 expressão e γH2AX em LNCaP, PC-3, e células DU145 expostos a RD, respectivamente.

B

,

a

, ensaio cometa Neutral foi realizada para determinar fragmento de DNA nas células tratadas com RD.

b

, Distribuição de comprimento cometa média (100 células por amostra) foi calculado pela caixa e enredo triz. As medianas são indicados por cruz; intervalo interquartil (25-75%; IQRs) são indicados por caixas abertas. Os bigodes são 1,5 vezes a distribuição IQR.

Além disso, teste do cometa neutra foi realizado para testar se RD pode induzir LAP em células APC. Os resultados na Figura 2B mostram que os momentos da cauda de ADN em resposta a RD foram detectáveis ​​em células tão cedo quanto tratamento 2h, e tornou-se mais pronunciado com tratamento prolongado. Assim, os dados indicaram que RD causado significativamente LAP em células APC.

RD afeta ATM /ATR-dependentes vias Chk1 /Chk2 em células PC-3

Para determinar se ATM /ATR-Chk1 /2 vias de sinalização, que são bem identificados como sendo activada em resultado de danos de ADN, estão envolvidos na resposta a danos no ADN induzida por RD, examinamos primeiro mudanças de factores conhecidos como sendo importante para mediar vias de ATM /ATR. Estudos cinéticos exibido fosforilação elevado de ATM e Chk2 (Thr

68) foi induzida por RD tão cedo quanto 30 minutos, mas este nível de fosforilação caiu acentuadamente depois. Considerando que a activação de ATR /Chk1 foi observado no tratamento 2h e persistiu até 24 horas tal como evidenciado pela acumulação de fósforo e ATR-fósforo-Chk1 (Ser

296) em resposta à RD (Figura 3A). Deve notar-se que a ATR /Chk1 foi significativamente activado por RD no tratamento 2h, em que a activação da ATM /Chk2 foi prejudicada. activação mudando de ATM para ATR sugeriu que outros tipos de lesões do ADN, incluindo interferência replicação e lesões volumosas também podem ocorrer, além de LAP. regulação negativa dos familiares Cdc25, a jusante do Chk1 /Chk2, é um importante mecanismo responsável por bloquear a entrada de mitose após danos no DNA [19]. Como esperado, regulada negativamente CDC25B /C e uma pronunciada indução de Cdc25C mitótica em 4h, que persistiu após o tratamento, foram observadas nas células tratadas com RD quando em comparação com as células não tratadas (Figura 3A). Um aumento na clivagem da PARP também foi observado (Figura 3A).

Um

, alterações de proteínas de danos no ADN em células tratadas com RD foram analisadas por western blotting.

B

, após tratamento com produtos químicos para a 4h ou 12h, os níveis de proteína de proteínas danos no DNA foram detectados por Western blotting.

C

, Imuno fluorescência de coloração de γH2AX focos e focos de p-BRCA1 nas células PC-3.

D

,

a

, ensaio cometa Neutral de células PC-3 tratadas com RD durante 4h e 12h.

b

, comprimento Comet foi analisada pela caixa e método de parcelas suiça (100 células por amostra).

E

, Associações de γH2AX, PP2AC e PPP4C foram determinadas por coimmunoprecipitation usando anti-γH2AX, anti-PP2AC, anti-PPP4C, ou IgG normal.

F

, PC-3 de células foram pré-tratadas com 10 mmol /L de cafeína durante 1 hora, e expostos a RD durante 4h e 12h,

um

, a viabilidade celular medida por teste MTT; Barras, DP. *,

#, P 0,05, diferença significativa relativamente ao controlo.

b

, mudanças de γH2AX foram detectados por Western blotting.

danos no ADN desencadeia uma cascata de sinalização que conduz à formação de um complexo de reparação, as pausas. A seguir avaliou mudanças de BRCA1 de proteína, uma molécula importante no recrutamento inicial de outras proteínas /enzimas de reparação nos intervalos [20]. A activação de BRCA1 (fosforilação de Ser

1524) por RD foi observado até 4 horas e diminuíram após o tratamento, o que se correlacionou bem com o padrão de activação de Chk2, sugerindo Chk2 pode realmente fosforilar BRCA1 em resposta ao dano (Figura 3A). Com base nas observações acima, verificou-se que ocorreram mudanças significativas nas 4h e 12h tratamentos, os quais poderiam ser os momentos críticos para a resposta a danos no DNA induzidos-RD. Outros estudos (Figura 3B) apresentado que, o padrão da resposta envolvendo γH2AX, fósforo-Chk1 /2 e de fósforo a BRCA1 em 4h e 12h foi consistente com as observações da Figura 3A. Estes resultados foram adicionalmente suportada pela observação na Figura 3C. Como um controlo, Vp-16 foi capaz de manter elevada fósforo-Chk1 /2, fósforo a BRCA1, e níveis γH2AX após uma exposição mais longa, quando comparado com aqueles em tratamentos RD (Figura 3B e 3C), o que sugere que os diferentes mecanismos contribui para as respostas da RD e VP-16 tratamentos. De acordo com as alterações de proteínas de resposta a danos no ADN, pronunciado caudas de cometa foram mostrados para apresentar em células expostas à RD (painéis a e b na Figura 3D). De nota, γH2AX elevada que podem ser fosforilados por quinases ATM /ATR [21,22] foi evidente em 4 h e mantida até 48 horas após o tratamento RD, em que o activado-ATM /ATR por RD foi revogada (Figura 3A). Foram também analisadas as alterações da proteína fosfatase 2A (PP2A) e a proteína fosfatase 4 (PP4), que estão implicadas na desfosforilação γH2AX [23,24]. Após o tratamento de 24 horas, RD causaram aumento PP2AC (subunidade catalítica de PP2A), e PPP4C (subunidade catalítica de PP4) (Figura 3E), indicando que H2AX fosforilada permaneceu na presença de elevada PP2AC e PPP4C. Resultados A co-imunoprecipitação mostraram que γH2AX foi marcadamente perceptível com diminuição progressiva PP2AC ou PPP4C em complexos imunoprecipitados por anticorpos anti-γH2AX, anti-PP2AC ou anticorpos anti-PPP4C (Figura 3E), sugerindo que as associações com deficiência de γH2AX /PP2AC /PPP4C por dispatcher regional pode , pelo menos em parte, contribuem para a acumulação substancial de γH2AX.

Além disso, a cafeína, um inibidor da ATM sinalização /ATR, revogada quase completamente a capacidade de RD para promover a fosforilação H2AX durante o tratamento, a qual foi acompanhada com a reversão significativa da morte celular induzida por RD (Figura 3F). Juntos, os dados demonstram claramente que as vias em cascata ATM /ATR-mediadas desempenhou um papel crucial na resposta à RD induzida por danos no DNA, levando à promoção de células para entrar mitose letal.

RD inibe NHEJ e HR em células PC-3

para determinar os efeitos de reparação RD no LAP, foi desenvolvido um ensaio de junção de extremidades de ADN isento de células para avaliar a contribuição relativa de NHEJ de ADN em junção de extremidades [17]. DNA do plasmídeo pUC19 linearizado pela enzima Hindi foi incubado com extractos proteicos nucleares, e a actividade de junção de extremidade reflectiu-se pelo aparecimento de dímeros lineares e multimeros, que foram amplificados por PCR com iniciadores M13 que flanqueiam a junção-se juntou final (Figura 4A, 4B). Após o tratamento com o RD durante 6 h ou 24 h, a actividade NHEJ do extracto nuclear foi marcadamente suprimida, como indicado pela aparência de uma banda de monómero forte e correspondentemente diminuída produtos multímeros, enquanto dímeros, trímero, e bandas de tetrero foram evidentes no grupo de controlo (Figura 4B ). Como um controlo positivo, NHEJ actividade também foi prejudicado por RD durante a incubação do substrato de ADN com extracto nuclear de células de Raji (Activo Motif) sob as mesmas condições (Figura 4B). Além disso, a incubação de ADN linear com anticorpos de bloqueio dirigidos contra Ku70 e Ku86 em proteínas nucleares levaram a uma diminuição bandas de multimeros, semelhante à observação de tratamento RD (Figura 4B), fornecendo indícios de que a Ku heterodímero Ku70 /Ku86 são duas das proteínas importantes na mediada por RD reparação de LAP.

a

, diagrama esquemático do princípio da DNA-juntando Fim de Ensaio.

B

, Depois de ter sido tratada com o RD, ou com anticorpos bloqueadores Ku 70/86, determinou-se a capacidade relativa de NHEJ.

C

,

a

, Diagrama esquemático do princípio da ensaios NHEJ.

b

, Diagrama esquemático sobre o princípio de ensaios de RH.

D

, os números de GFP

+ e DsRed

+ células foram determinadas por citometria de fluxo, e vestígios de FACS típicos são mostrados à esquerda. A proporção de GFP

+ para DsRed

+ células foi usado como uma medida da eficiência do reparo.

Nós fomos mais um passo para avaliar os efeitos da RD na NHEJ e HR usando

in vivo

ensaios, conforme descrito pelo Dr. Gorbunova [25,26]. Para a detecção da actividade de NHEJ, o repórter GFP, será produzida quando NHEJ é activo para reparar os LAP induzidos por digestão com enzimas (Figura 4C, a). Para a detecção de RH, eventos de conversão gene sucesso pode reconstituir gene GFP ativo por reparar LAP produzida por enzimas (Figura 4C, b). Depois de ser tratada com o RD durante 24 h, as células PC-3 foram co-transfectadas com a enzima I-Scel-digerido cassete repórter de NHEJ ou HR, e o plasmídeo DsRed para normalizar a eficiência da transfecção. Reparação de quebras induzidas por I-Scel resultará no aparecimento de GFP

+ células [26]. Após a transfecção, as células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão entre a GFP

+ e DsRed

+ células foi utilizada como uma medida da eficiência de RH ou NHEJ. Como mostrado na Figura 4D, o sinal GFP diminuíram significativamente em ambos os sistemas de reparo de RH em células tratadas com o RD ou NHEJ, indicando que LAP foi reparação prejudicada em resposta a RD. Juntos, os dados demonstraram que RD foi capaz de inibir NHEJ e RH, e suprimiu LAP reparo em células PC-3.

RD regula negativamente proteínas de reparo de DNA em células PC-3

Com base na observações acima, clarificou ainda mais o papel da Ku70 /Ku86 em resposta a danos no ADN induzida por RD. Após a incubação de células com RD para diferentes períodos de tempo, Ku86 aumentou e atingiu um máximo de 4 horas, depois diminuiu rapidamente até 48h, enquanto Ku70 permaneceu inalterada até 12h e declinou depois disso (Figura 5A). actividade de ligação de extremidades de ADN de Ku70 /Ku86 apresentado que, em comparação com as células não tratadas, as actividades de ligação de ambos Ku70 /Ku86 em células tratadas foram progressivamente aumentadas até 4 horas e depois diminuiu durante o restante do período de exposição (Figura 5B), consistente com os resultados apresentados na Figura 5A. Além disso, constatou-se o efeito inibidor dependente da dose de RD na expressão e actividade de ligação de Ku70 /Ku86 em 4h e 12h tratamentos (Figura 5C, 5D). Além disso, ensaios de qPCR mostrou que o reparo do DNA associado

RPA1-3

,

XRCC5

,

XRCC6

, e

MSH6

foram reprimidos pela RD (Figura 5E ). Juntas, estas observações indicam que RD prejudicada reparo de DNA em resposta ao dano no DNA.

A

e

C

, Análise das expressões da Ku70 e Ku86 em proteínas nucleares por ensaio western blot.

B Comprar e

D

, Análise de actividade de ligação a fim de DNA Ku70 ou Ku86 no PC-3 células expostas a RD. *, P 0,05, diferença significativa relativamente ao controlo.

E

, Heatmap para níveis de ARNm de genes de reparação de ADN em células tratadas com Rd que foram determinadas pelo tempo real de RT-PCR. Vermelho: a sobre-expressão, verde: sub-expressão, preto: expressão inalterada, cinza: sem detecção

RD desencadeia a apoptose associada com a indução de danos no DNA de PC-3 xenotransplante

Para determinar se DR podem induzir apoptose de células tumorais através de indução de dano do ADN

in vivo

, como observado em células cultivadas, PC-3 humanas xenoenxertos foram desenvolvidos em ratinhos nus machos. A administração de RD não teve nenhum efeito significativo sobre o peso corporal inicial ou fi nal em ratinhos portadores de tumor em comparação com grupo placebo (Figura 6A). Após 20d tratamentos, os tumores resultantes de animais de controlo resultou na morte de dois animais durante o período experimental, enquanto que os tumores de ratos tratados com RD tinha um tamanho significativamente menor (Figura 6B), indicando uma inibição significativa do crescimento do tumor por RD. A redução da massa do tumor em ratos tratados com RD foi também observado (Figura 6C). Mudanças de marcadores moleculares associados com danos no DNA de camundongos tratados exibida RD causada resposta DNA-danos via de sinalização ATM /ATR-mediada como evidenciado pela acumulação substancial de γH2AX, cancelamento da fósforo-BRCA1 e Ku70 /Ku86 abundância (Figura 6D e 6E ), consistente com os resultados em células de cultura. alterações Entretanto, RD-mediadas nas expressões dos membros da família PP2A foram semelhantes para as observações mostradas em células de cultura. Além disso, em comparação com o controlo de placebo, a revogação de Bcl-2, a acumulação de Bax, e a clivagem de PARP era evidente em ratos tratados com RD (Figura 6D). TUNEL também apoiou as observações de que as células em apoptose foram pronunciadas em camundongos tratados com RD (Figura 6F a e b). Os dados demonstraram que RD desencadeada danos no DNA e proteínas de reparo com deficiência, levando à morte celular por apoptose, o que contribuiu para o seu efeito antitumoral

A Restaurant -.

C

, efeito da RD no crescimento do tumor e o peso corporal de ratinhos nude.