Abstract

Apesar de um aumento do nível do antígeno específico da próstata pode ser uma indicação para o cancro da próstata, por outras razões, muitas vezes conduzir a uma elevada taxa de resultados falsos positivos. Portanto, uma triagem sorológica adicional de auto-anticorpos no soro dos pacientes poderia melhorar a detecção do câncer de próstata. Foi realizada triagem macroarray proteína com soros de pacientes com câncer de próstata 49, 70 pacientes com hiperplasia benigna da próstata e 28 controles saudáveis ​​e comparou a resposta auto-imune nesses grupos. Fomos capazes de distinguir pacientes com câncer de próstata de controles normais com uma precisão de 83,2%, os pacientes com hiperplasia prostática benigna dos controles normais com uma precisão de pacientes com câncer de próstata 86,0% e de pacientes com hiperplasia benigna da próstata com uma precisão de 70,3%. Combinando padrão de reactividade sérica com um nível de PSA superior a 4,0 ng /ml esta classificação pode ser melhorada com uma precisão de 84,1%. Para proteínas selecionadas fomos capazes de confirmar a expressão diferencial usando Luminex em 84 amostras. Nós fornecemos um método sorológico minimamente invasiva para reduzir a resultados falsos positivos na detecção do câncer de próstata e de acordo com o teste de PSA para distinguir homens com câncer de próstata de homens com hiperplasia prostática benigna

Citation:. Leidinger P, Keller A, Milchram G, C Harz, Hart H, Werth A, et al. (2015) Combinação de auto-anticorpos Assinatura com PSA Nível Ativa uma diferenciação baseada-Blood altamente precisas de próstata pacientes com câncer de pacientes com hiperplasia prostática benigna. PLoS ONE 10 (6): e0128235. doi: 10.1371 /journal.pone.0128235

Editor do Academic: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos

Recebido: 17 de junho de 2014; Aceito: 24 de abril de 2015; Publicação: 03 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Leidinger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos cânceres mais letais nos homens em todo o mundo ea segunda causa relacionada com o cancro mais frequente de morte nos Estados Unidos. Em 2012, o câncer de próstata foi estimada em mais de 417.000 novos casos e 92.000 mortes relacionadas ao câncer na Europa [1]. Na maior parte, mais de dois terços de todos os cancros da próstata são diagnosticados em homens com 65 anos ou mais. [2] O câncer de próstata é muitas vezes caracterizado por um desenvolvimento gradual e progresso. [3] De acordo com padrões histológicos de células de carcinoma do progresso do câncer de próstata é classificada pela pontuação Gleason:. células de carcinoma bem diferenciados (Gleason 2-4), células de carcinoma moderadamente diferenciados (Gleason 5-7), e células de carcinoma pouco diferenciados (Gleason score 8-10) [4] o câncer de próstata pacientes com escore de Gleason de 8 a 10 executar um mais de três vezes maior risco de morrer de câncer de próstata em 10 anos que os pacientes com escore de Gleason 2 a 4 (8,3%). [5] de fato, a doença é curável quando é detectada precocemente .

Aproximadamente, dois terços dos homens norte-americanos com idades entre 50 e mais velhos são regularmente, ou pelo menos uma vez-selecionados para o cancro da próstata. [6] antígeno digital exame retal (DRE), e prostático específico [2] (PSA) de rastreio tornaram-se métodos bem estabelecidos no câncer de próstata diagnóstico. No entanto, DRE exige experiência de longa data na detecção do câncer. Além disso, DRE não é uma ferramenta sensível para a doença precocemente. É muitas vezes detecta o câncer em estágios tardios. [7]

PSA, uma serina-protease, é uma molécula específica do órgão produzido pelo epitélio prostático. testes de PSA introduzidas na década de 1980 proporcionará a oportunidade de detectar o câncer sem um resultado DRE positivo. De acordo com os EUA Food and Drug Administration, o que permitiu o teste de PSA como ferramenta de diagnóstico, em 1994, um PSA, nível maior do que 4 ng /ml é considerado como um valor crítico. Um nível de PSA inferiores a 4 ng /ml corresponde a gama normal. PSA pode ser detectada quer como (PSA livre) “livre” ou “ligado” (PSA-ACT) forma em soros patients’. [8] Stenman e colegas de trabalho revelou que os homens com um nível elevado de PSA ligado correm um maior risco de sofrimento de câncer de próstata enquanto foi mostrado o nível de PSA livre a ser menor em pacientes com câncer de próstata do que em homens com hiperplasia benigna da próstata. [9] Partin et al. foram capazes de detectar o câncer de próstata com uma sensibilidade de 95% e uma especificidade de 20% por um exame de PSA livre. [10] Embora exames de PSA diminuir a taxa de mortalidade de pacientes com câncer de próstata, o método de rastreio é ineficiente e leva a limitações, que muitas vezes resultam em uma alta taxa de resultados falsos positivos seguidos de biópsias da próstata desnecessárias [11-13]. Além disso, os homens mais velhos geralmente têm um nível de PSA superior não corresponde a qualquer doença da próstata. [14] Os níveis elevados de PSA também são detectáveis ​​em pacientes que sofrem de hiperplasia benigna da próstata. [15] Assim, triagem ainda mais métodos com maior eficiência para o câncer são necessárias.

Os biomarcadores têm desenvolvido em uma ferramenta clínica necessário. Especialmente, marcadores de câncer tem que cumprir vários critérios. Eles têm que ter uma elevada sensibilidade e especificidade, ser fácil de detectar, económica, e expresso de forma significativa. Os estudos actuais indicam o potencial de autoanticorpos em diferentes tipos de cancro, por exemplo, cancro do pulmão, carcinoma da mama, tumor do ovário, e meningiomas. [16-19] Os auto-anticorpos revelam a possibilidade de detecção precoce e terapia sucessiva. O aparecimento de auto-anticorpos também permite uma visão mais detalhada nos processos moleculares no desenvolvimento precoce da doença. Recentemente, descreveu um método de ensaio de sangue, utilizando auto-anticorpos para identificar o cancro do pulmão com uma sensibilidade de 97,9% e uma especificidade de 97,0% [20]. Além disso, Wang e colaboradores estabeleceram uma micromatriz de fagos de proteínas para identificar os auto-anticorpos em cancro da próstata. [ ,,,0],21] Em seu estudo, eles detectar câncer de próstata com uma especificidade de 88,2% e uma sensibilidade de 81,6%. De fato, o estudo também detectou várias proteínas com menos homologia com proteínas conhecidas.

No presente estudo, descrevemos uma triagem macroarray proteína para detectar auto-anticorpos em patients`sera câncer de próstata. No total, foram analisados ​​136 amostras de sangue: 48 amostras de pacientes com cancro da próstata, 60 amostras de hiperplasia benigna da próstata, e 28 amostras de sangue de indivíduos saudáveis. Nós mostramos que o rastreio permite a discriminação de soros de pacientes com cancro da próstata, e controlos. Mostramos também que os antigénios imunogénicos pode ser útil para diferenciar pacientes com câncer de próstata de pacientes hiperplasia prostática benigna. Além disso, os pacientes que sofram de hiperplasia prostática benigna podem ser separados a partir de controlos. Além disso, nós nos concentramos sobre a seguinte questão:? Pode a combinação de testes de PSA e de auto-anticorpos melhorar a sensibilidade ea especificidade para o diagnóstico de câncer de próstata

teste de PSA como método diagnóstico único muitas vezes leva a resultados falsos positivos. New biomarcador pode constituir uma oportunidade para aumentar a sensibilidade ea especificidade para câncer de próstata. pesquisa de autoanticorpos específicos, juntamente com o teste de PSA pode ser uma ferramenta de diagnóstico útil para detectar câncer de próstata em fase inicial e para reduzir a mortalidade relacionada ao câncer de próstata. Além disso, a identificação de novos antígenos imunogênicos pode ser um primeiro passo para o desenvolvimento de novas terapias.

Materiais e Métodos

População do estudo

As amostras de sangue de pacientes com câncer de próstata e pacientes com hiperplasia benigna da próstata foram obtidas do Departamento de Urologia do Hospital Universitário Saarland. Amostras de sangue de doadores saudáveis ​​foram obtidos do Departamento de Hemostaseology e Medicina Transfusional do Hospital Universitário Saarland. O soro foi preparado a partir de soro monovettes e armazenado em alíquotas de 2 ml a -70 ° C. Todas as amostras foram obtidas com patients’ consentimento informado por escrito antes da participação. O estudo, incluindo o processo de aprovação foi aprovado pelo comitê de ética local (Re.-No. 3755). No total, foram analisados ​​os soros 147, proveniente de 49 cancro da próstata (CaP) pacientes, 70 pacientes com hiperplasia prostática benigna (BPH) e 28 voluntários saudáveis ​​do sexo masculino. Informações detalhadas sobre todos os pacientes e indivíduos saudáveis ​​é fornecido na Tabela 1.

Protein triagem macroarray

Foram triados macroarrays proteínas de alta densidade contendo 38.016

E

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coli

proteínas expressas do Hex1 (cérebro fetal expressão cDNA humano) biblioteca com poças de 150 soros de pacientes com diferentes doenças tumorais e não tumorais, incluindo duas piscinas de soros PCA (5 soros por pool) e uma piscina de cinco soros HBP. [22] Um total de 1.827 clones, que foram positivos para auto-anticorpos em, pelo menos, um conjunto de soro, foram seleccionados e manchados em filtros duplicados em sub-disposição. Estas sub-macroarranjos foram rastreados com CaP 49, 70 e 28 HBP soros normais (ver Fig S1).

Em resumo, macroarranjos foram lavadas duas vezes em TBSTT (TBS, 0,05% de Tween 20, 0,5% de Triton X -100) e quatro vezes em TBS. Após bloqueio com 3% de leite seco não gordo em TBST (TBS, 0,05% de Tween 20), macroarranjos foram incubadas durante a noite com soro diluído (1: 1000). Após a incubação, os soros foram armazenados durante uma segunda fase de incubação. Os macroarranjos foram sujeitas a três passos de lavagem com TBST, seguido por incubação com 70 ° C solução de extracção. Depois macroarranjos foram lavadas duas vezes em TBST e quatro vezes em TBS. Após a incubação com bloqueio macroarrays solução foram submetidos à segunda rodada de incubação de soro. Macroarranjos foram lavadas três vezes em TBST, e incubado com anticorpo secundário (anticorpo de coelho anti-humano IgG, IgA, IgM-Cy5 (H + L), Dianova, 1: 1000). Finalmente, macroarranjos foram lavados quatro vezes em TBST, duas vezes em TBS e secou-se durante a noite. Os sinais foram detectados por digitalização com Typhoon 9410 digitalizador (GE Healthcare).

A análise de imagens e estatísticas

valores de intensidade spot foram computados pela Arcádia, um software de análise de imagem que desenvolvemos especificamente para avaliação array de proteínas [20]. Em resumo, a imagem do macroarranjo foi dividida em sub-grades. Essas sub-grades foram ainda divididos em áreas local contendo uma mancha de proteína. Finalmente, a intensidade de cada mancha foi calculada como o valor médio de todos os elementos de imagem da mancha de proteína respectiva.

realizada a normalização quantil padrão para minimizar as variações de matriz-a-matriz. Especialmente para recursos na borda da matriz observamos diminuindo ligeiramente qualidade. Os respectivos recursos iria, contudo, potencialmente viés da análise. Assim, respectivos pontos foram marcados como não disponíveis. Em seguida, foram excluídos 169 spots de proteínas que estavam ausentes em mais de 10 macroarrays analisados. Os restantes 1.658 clones foram utilizados para a classificação por um técnico de suporte linear Vector Machine (SVM).

No total, 20 repetições de uma validação cruzada 10 vezes padrão foram realizados e média sensibilidade, especificidade e precisão para os quatro classificação tarefas foi calculada. Como uma medida do conteúdo da informação de antígenos individuais para a sua capacidade para diferenciar soros da área dois grupos diferentes sob o receptor-operador características de curva de valores (ROC) (AUC) foram computados. A curva ROC mostra a especificidade como a função de 1-sensibilidade. Para cada antigénio, todos os valores de intensidade normalizada para todos os soros foram utilizados como limiares para discriminar o soro do paciente a partir dos controlos. Para todos estes limites, o soro do paciente com valor de intensidade acima do limiar foram considerados como verdadeiro positivo (TP), o soro do paciente com valor de intensidade abaixo do limiar como falso negativo (FN). Assim, soro controle com valor de intensidade abaixo do limiar foram considerados como verdadeiro negativo (TN), soro controle com valor de intensidade acima do limiar como falso positivo (FP). Subsequentemente, a sensibilidade (TP /(TP + FN)) e especificidade (TN /(TN + FP)) de todos os limites foram utilizados para calcular a curva ROC e valor de AUC do antigénio considerado. Se os valores de intensidade do antigénio considerado no soro dos pacientes são mais elevados do que em soros de controlo, os valores de AUC variam de 0 a 0,5. os valores da AUC variam 0,5-1 conferem a uma média maior intensidade do antigénio em soros de controlo em comparação com o soro do paciente. Consideramos antígenos com os valores da AUC abaixo de 0,3 ou acima de 0,7 como informativo para a classificação dada. Finalmente, calculamos a frequência de sororreatividade contra os antígenos dos grupos considerados usando um limiar de intensidade mancha de 50 para sororreatividade positivo. Os dados macroarray proteína foram depositados na Expression publicamente disponível Gene banco de dados Omnibus (GEO; website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/, GSE67068).

Validação

a fim de validar auto-anticorpos contra clones imunogênicas, compramos respectivos clones da Fonte Bioscience, ou seja, D02594, E19574, L16556, A22594, e C11549. Inserções foram sequenciados a partir de 5 ‘e 3’ para confirmar a identidade e o comprimento dos antigénios representados. dados de sequências revelou que o clone D02594 foi um híbrido das duas proteínas YBX1 e PDP1, representando na sua extremidade 5 ‘da primeira 275aa de YBX1 e na sua extremidade 3’ o último 91aa (a partir de aa446) de PDP1 com uma sequência de ligante desconhecido entre. Esta proteína foi excluído de análises posteriores. Os outros 4 clones foram confirmados para incluir sequências de RPS27A, RPL15, DDX54 e RPL7. Para determinar a presença de auto-anticorpos contra estes antigénios, utilizamos a tecnologia Xmap (Luminex, Austin, TX, EUA). Em suma, marcada com His antígenos foram expressos em

E

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coli

acordo com as recomendações do fornecedor, purificadas usando esferas de agarose Ni-NTA e acoplados a microesferas magnéticas de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Cinquenta ul de uma beadmix contendo 1000 acoplado microsferas por proteínas ensaiadas foi incubado com soros de pacientes e controlos (1: 400 diluído em Tris-HCl 100 mM pH 7,0, BSA a 1% a 300 mM, de NaCl 0,1% de Tween-20) durante 2 h a RT num agitador. auto-anticorpos ligados foram detectados utilizando uma mistura 1: 1 de 2,5 ug /ml de r-phyco AffiniPure F (ab ‘) 2 anti-Gt Frag HMN IgG [Fcy] (Jackson ImmunoResearch N ° de Cat 109-116-098) e 2,5 ug /ml de R-phyco AffiniPure F (ab ‘) 2 anti-Gt Frag HMN IgG [F (ab’) 2] (Jackson ImmunoResearch N ° de Cat 109-116-097). Após 1 hora de incubação com os anticorpos secundários, as esferas foram lavadas três vezes com PBS-Tween a 0,05% e medido com Luminex Flexmap 3D. Além de testes de hipóteses convencionais, tais como t-teste ou análise de variância, a AUC foi calculada. Finalmente, as medidas foram correlacionadas com os níveis de pontuação e PSA Gleason.

Resultados

Um total de 1.827 clones de cDNA foram rastreados com 147 amostras de soro, incluindo 49 CaP soros, 70 soros BPH, e 28 soros de homens saudáveis ​​(Tabela 1). Fora destes soros foi selecionado um subconjunto pareados por idade, que incluiu 44 APC e BPH soros, cada um com uma idade mediana de 67 anos. Além disso, em comparação subconjuntos de 36 soros de pacientes com CaP nível de PSA 4 ng /ml e de 33 soros de doentes com HBP também com o nível de PSA 4 ng /ml.

Frequência de clones imunogênicas

Para minimizar as variações matriz-a-matriz a 147 analisados ​​macroarrays foram normalizados utilizando a normalização quantil padrão. Nós escolhemos um limiar de intensidade da mancha de 50 para a determinação da reactividade sérica positivo. Foram excluídos todos os clones de cDNA que mostraram falta de sororreatividade em mais de 10 das 147 matrizes. Fora dos 1658 clones de ADNc remanescente, 1612 clones reagiram com pelo menos um soro de CaP. A frequência de reactividade sérica variou de 2,3% para o clone de ADNc a reagir menos com os soros de CaP, para 97,7% para o clone de ADNc mais reactivo. Encontrámos 1613 clones que reagiram com pelo menos um soro HBP. A frequência de sororreatividade variaram de 2,3% a 95,5%. Curiosamente, 1.533 clones reagiram com soros normais (frequências de 3,6% para 96,4%. A comparação dos clones acima mencionados revelou uma sobreposição de 1.485 clones de entre APC, BPH e soros normais. Os clones pode ser chamado auto-anticorpos naturais que estão presentes nas cada soro de pessoas saudáveis ​​a níveis constantes notáveis ​​e caracterizado por mínimas variações quantitativas individuais. [23] o diagrama de Venn na Figura 1 mostra a distribuição dos clones que reagem.

o diagrama de Venn mostra a distribuição da reacção de 1658 clones para os três grupos de soro (PCA, BPH, normal). a maioria dos clones são reativas em todos os três grupos enquanto que um pequeno número de clones é apenas reativa em cada grupo único.

Como a maioria de os antigénios analisados ​​eram reactivos em soros de pacientes com CaP, doentes com HBP, bem como controlos saudáveis ​​os clones pareciam não ser muito significativa para outras abordagens. Portanto, voltada para os clones que apenas reagiram com os soros de um dos três grupos de soro , ou seja, quer CaP soros, ou de soros BPH ou de soros normal. Aqui encontramos dez clones única reactivo com, pelo menos, um soro de CaP, 12 clones única reactivo com, pelo menos, um soro de BPH, e de 5 clones única reactivo com, pelo menos, um soro normal. No que respeita às frequências reactividade sérica de cada grupo de soro, os resultados foram um tanto desapontante como no máximo, apenas sete das 49 CaP soros reagiu com os antigénios específicos APC, no máximo, apenas sete dos soros 70 HBP feito reagir com os antigénios específicos de BPH, e apenas um soro normal feito reagir com o 5 antigénios específicos encontrados apenas em soros normais. Portanto, parece que esses antígenos pode refletir variações individuais.

conteúdo de informação de clones imunogênicas

Como considerando apenas as frequências sororreatividade por grupo de soro não parece ser uma boa medida, foi calculado para cada clone de ADNc a área sob a curva de características de operação do receptor (AUC), tal como descrito na secção Materiais e Métodos. A AUC é uma medida para o conteúdo de informação de cada antigénio para a separação de dois grupos diferentes de soro a partir de cada outro. Aqui, tornou-se evidente, que os clones que reagem com mais do que um grupo de soro pode, no entanto, tem um elevado teor de informação para certas separações.

Os valores de AUC dos 1.658 clones analisados, incluindo 461 clones em-quadro, encontram-se resumidos na Tabela 2. Nós classificados os clones de ADNc de acordo com o conteúdo de informação que contribuiu para as diferentes tarefas de classificação. Os clones com um valor de AUC 0.7 ou 0,3 foram consideradas muito informativo para uma determinada tarefa de classificação.

Para a discriminação da APC e soros normais, 199 clones (12%) foram consideradas como sendo informativo, incluindo 52 clones em-frame. Entre os clones informativos, 78 clones apresentaram valores AUC 0,7, incluindo 32 clones em-frame e 121 clones apresentaram valores AUC 0,3, incluindo 20 clones em-quadro. O D20552 clone out-of-frame com uma homologia de sequência com a creatina quinase cerebral (CKB) apresentou o menor valor AUC (AUC = 0,142) para a discriminação da APC e soros normal. Este clone foi também informativo para a discriminação de BPH e soros normais (AUC = 0,190), mas não para a discriminação de APC e soros BPH (AUC = 0,466). O clone out-of-frame E03526 com homologia de sequência com dimetilarginina dimethylaminohydrolase 1 (DDAH1) apresentou o maior valor de AUC (AUC = 0,811). Mais uma vez, este clone foi também informativo para a discriminação de BPH e soros normais (AUC = 0,760), mas não para a discriminação de APC e soros BPH (AUC = 0,558).

O D02594 clone com a sequência de homologia com nuclease proteína de ligação ao elemento sensível 1 (YBX1) era o clone em grelha com o menor valor de AUC (AUC = 0,209) e o clone de A06579 com homologia de sequência de proteína (cis peptidil-prolil /isomerase trans) (pin4) foi o em grelha clone com o maior valor AUC (AUC = 0,806).

para a discriminação de BPH e soros normais, 110 clones (6,63%), incluindo 24 clones em-frame foram considerados informativo. Entre eles, 39 clones apresentaram valores AUC 0,7, incluindo 5 clones em-frame e 71 clones apresentaram valores AUC 0,3, incluindo 6 clones em-frame. A out-of-frame clone C18596 apresentou o menor valor AUC (AUC = 0,144) para a discriminação de BPH e soros normais, ou seja, este clone mostraram uma resposta imune mais forte com soros de doentes com HBP em comparação com soro normal. Este clone foi também informativo para a discriminação de CaP e soro normal (AUC = 0,236) e mostraram resposta imune mais forte no soro de pacientes com CaP em comparação com soros normais. No entanto, para a discriminação de soros BPH e soros CaP o clone C18596 alcançado somente um valor de AUC de 0,528 e tinha, portanto, menos conteúdo de informação para esta separação. O clone E13519 out-of-frame com uma homologia de sequência com oxidase (citocromo c) montagem 1-like (OXA1L) apresentou o maior valor de AUC (AUC = 0,782) específico para a discriminação de BPH e soros normais, ou seja, maior imunogenicidade em soros normais do que em soros de BPH. No entanto, este clone não tinha conteúdo de informação para a separação de CaP de soros normais (AUC = 0,646) e para a separação de BPH de CaP (AUC = 0,446). Para a discriminação da HBP e soros normais E19574 o clone com a sequência de homologia com o pseudogene semelhante a ubiquitina e proteína ribossomal precursor S27a foi identificado como o clone mais informativo em-quadro com a AUC 0,3, isto é, a resposta imunitária mais elevada no soro de doentes de BPH do que em soros normais (AUC = 0,175). O clone em enquadramento com a sequência L16556 homologia com a proteína ribossómica L15 (RPL15) foi identificado como o clone mais informativo em-quadro com a AUC 0,7, ou seja, maior imunogenicidade em soros normais em comparação com soros de doentes com HBP (AUC = 0,773).

Ao comparar APC e BPH soros, 99,3% (1646 clones) dos clones imunogênicas mostraram valores de AUC entre 0,3 e 0,7, o que significa que eles são não-informativo. Apenas 18 clones informativas (1,09%), incluindo quatro clones em-frame, permaneceu. Entre eles, 5 clones apresentaram valores de AUC 0,3 e 13 clones apresentaram valores AUC 0.7. O clone out-of-frame N22510 com uma homologia de sequência com MARCKS-like 1 (MARCKSL1) apresentou o maior valor de AUC (AUC = 0,773) para a discriminação da APC e BPH. O clone A22594 apresentou o menor valor AUC (AUC = 0,266). Ambos os clones também foram informativo para a discriminação de BPH e soros normais, mas não para CaP soros soros normais vs.. Este último clone era A22594 em grelha e, assim, o clone com o menor AUC. O C11549 clone com a sequência de homologia com 60S ribossomal L7 proteína era o clone em grelha com o maior valor de AUC (AUC = 0,710).

para a discriminação de soros de pacientes com diferentes doenças do mesmo órgão, isto é, , o PCA ou BPH, também levou o valor de PSA pré-operatório em conta. Portanto, foram selecionados 36 CaP soros e 33 soros BPH com PSA ≥ 4,0 ng /ml a partir da população do estudo inicial. A sobreposição com o grupo do soro pareados por idade antes mencionado foi de 32 CaP e 17 soros BPH. A seguinte classificação revelou 166 clones informativos, incluindo 42 clones em-frame. Entre os clones informativos, 81 clones apresentaram valores AUC 0,3, incluindo 28 clones em-frame e 91 clones apresentaram valores AUC 0,7, incluindo 14 clones em-frame. No discriminação CaP contra BPH, cada um com PSA ≥ 4,0 ng /ml, o out-of-frame clones N12603 e N22510 apresentou os melhores valores da AUC de 0,174 e 0,838, respectivamente. Clone N12603 tem homologia de sequência para o receptor colinérgico nicotínico alfa (CHRNA2) e N22510 clone para a MARCKS-like 1 (MARCKSL1). Curiosamente, o último clone N22510 também era o clone com o maior valor de AUC para a separação CaP contra a HBP, independente do nível de PSA.

O clones de A18602 (homologia de sequência com a proteína ribossómica S2 (RPS2)) e J04520 (homologia da sequência Y caixa de ligação às proteínas 1 (YBX1) para) foram os clones em-frame com os melhores valores da AUC de 0,188 e 0,818, respectivamente.

resultados da classificação

Conforme detalhado na Materiais e secção de Métodos, a classificação foi levada a cabo por um suporte linear da máquina Vector (SVM). Aqui, 20 repetições de um padrão de validação cruzada de 10 vezes foram realizados e média sensibilidade, especificidade e precisão para quatro tarefas de classificação foi calculado. Todos os resultados da classificação são detalhados na Tabela 3. Os melhores resultados foram obtidos para a classificação BPH em relação normal com uma precisão de 86%. A classificação CaP contra normais produziu uma precisão de 83,2%. A precisão da classificação pior de 70,3% foi obtida para a idade correspondida amostras de CaP contra BPH. Mas, considerando o nível de PSA 4.0 melhorou claramente os resultados da classificação. Aqui nós obtivemos uma precisão de 84,1%.

Validação

Desde tecnologias de alta capacidade freqüentemente levam a resultados falsos positivos biomarcadores, validação pela tecnologia independente é essencial. De analisa o anterior, escolhemos cinco clones: D02594, E19574, L16556, A22594, e C11549. Estas correspondem às proteínas RPS27A, RPL15, DDX54 e RPL7. Desde re-sequenciação demonstrou que o clone D02594 foi um híbrido dos dois YBX1 proteínas e PDP1, ele foi deixado de fora a partir da análise estatística. Os clones foram rastreados com uma coorte de 84 indivíduos, incluindo 27 pacientes APC, 30 doentes com HBP e 27 controles. Uma análise de variância mostrou resultados significativos para DDX54 (p = 0,03) e RPL7 (p = 0,04). Um terceiro clone, RPL15, excedeu ligeiramente o limite de significância (p = 0,074).

Nos experimentos de triagem, DDX54 mostrou um aumento sororreatividade mediana em soros de controlo (44,9) e os pacientes PCA (44,6) em comparação com BPH ( 41.2) pacientes. Esta maior reactividade em comparação com controles de doentes com HBP tem sido confirmada pela análise de validação (Fig 2A). Para a segunda proteína, RPL7, os resultados iniciais aumentou auto-anticorpos em doentes com HBP (44,8) em comparação com pacientes CaP (39,0). Esta tendência também foi observada nas experiências de validação (Fig 2B). Embora um pouco não é estatisticamente significativa, a tendência global de maior sororreatividade contra RPL15 em amostras normais em comparação com os dois doentes com HBP APC e foi reproduzido com sucesso na validação (Fig 2C). Ao correlacionar a expressão de proteínas para os níveis de PSA não observados resultados significativos.

Box-Whisker para reactividade contra DDX54 (A), RPL7 (B) e RPL15 (C) com soro de pacientes com benigna da próstata hiperplasia (BPH), carcinoma da próstata (PCA) e controles saudáveis ​​(N) em macroarray proteína (painéis esquerdos) e validação Luminex (painéis da direita). Para cada grupo, as caixas indicam a 2. e 3. quartil de sororreatividade, os bigodes mostrar valor mínimo e máximo. As linhas pretas horizontais indicam a reactividade sérica mediana no grupo. tendências sororreatividade semelhantes são indicados por colchetes.

Discussão

Existe um consenso comum de que o teste de PSA diminuiu a taxa de mortalidade dos pacientes PCA para anos. No entanto, o teste de PSA ainda é uma questão controversa por isso muitas vezes leva a resultados falsos, sobrediagnóstico e terapia falsa indo junto com custos elevados. [24] A identificação de novos biomarcadores, por exemplo, PCA3, GSTP1, AMACR, ou miRNAs, revela o oportunidade para melhorar a detecção de câncer de próstata. [25] Além disso, novos biomarcadores podem aumentar o acompanhamento e dar uma visão mais detalhada sobre o progresso e desenvolvimento do câncer.

Em nosso estudo, nós apresentamos uma combinação de assinatura de auto-anticorpos com nível de PSA. Nós selecionados de um conjunto de 1.827 clones de cDNA com 49 CaP soros, 70 soros BPH, e 28 soros de indivíduos saudáveis ​​por meio de análise macroarray proteína. Além disso, comparamos seroactivity de pacientes APC, doentes com HBP e controles, calculando os valores da AUC. valores 0,3 e 0,7 foram considerados como informativo. No total, foram identificados 199 clones informativos (incluindo 52 em-frame-clones) para a classificação de CaP contra, 110 clones informativos normais (incluindo 24 em-frame-clones) para a classificação de BPH em relação normal, e apenas 18 clones informativos (incluindo 4 em-frame-clones) para a classificação do CaP contra BPH. Considerando apenas os soros APC e BPH com níveis de PSA 4,0 ng /ml foram detectados 166 clones (incluindo 42 em-frame-clones) para a classificação de CaP contra BPH.

Nós fomos capazes de separar o soro de pacientes e controles APC com uma precisão de 83,2%, um sensibilidade de 70,2% e uma especificidade de 91,5%. soros BPH e soros normais foram separados com uma precisão de 86,0%, uma sensibilidade de 73,9% e uma especificidade de 93,6%. A precisão da classificação pior com 70,3% foi obtida para CaP contra BPH. Curiosamente, o resultado da classificação melhora após tomar o nível de PSA 4,0 ng /ml em consideração. Aqui, separamos CaP soros e soros BPH com uma precisão de 84,1%, uma sensibilidade de 84,5% e uma especificidade de 83,8%. Isto é de importância porque este método permite a separação de doença maligna da doença benigna.

Os resultados baseiam-se em reacções específicas do sistema imunitário. Ao lado de PSA e outros biomarcadores antigénios associados ao cancro pode ser marcador muito específico e adequado como ferramenta de diagnóstico. O sistema imunitário reconhece células cancerosas através da produção de auto-anticorpos específicos contra estes antigénios associados a cancro. Os auto-anticorpos podem ser facilmente detectado em patients`sera. Além disso, eles têm uma meia-vida longa e são detectáveis ​​a baixo custo. [26] Os antigénios identificados detectados no soro de pacientes com CaP e pacientes de BPH podem servir como biomarcadores ou como alvos para a terapia futura para pacientes com diferentes doenças da próstata. Os antigénios encontrámos podem desempenhar um papel funcional no desenvolvimento de cancro da próstata. No total, foram encontrados 12 clones de fago-péptido com homologia para proteínas conhecidas. Os clones com homologia com CKB, DDAH1, YBX1, pin4, OXA1L, pseudogene semelhante a ubiquitina ea proteína ribossômica precursor S27a e RPL15 foram informativos para a discriminação de soros normais e PCA e BPH, respectivamente. Os clones com homologia para 60S proteína ribossômica L7, e MARCKS1 foram informativos para a discriminação de CaP soros e soros BPH. Os clones com homologia com CHRNA2, RPS2, YBX1 e MARCKS1 foram informativos para a discriminação de CaP soros e BPH sera levado o nível de PSA em consideração. Curiosamente, o clone de fago de péptido com uma sequência homóloga ao MARCKSL1 foi muito informativa para a classificação de CaP contra a HBP, com e sem ter em conta o nível de PSA. MARCKSL1 é um membro da família da MARCKS, um grupo de proteínas envolvidas na calmodulina (CaM) via de sinalização, a proteína quinase C (PKC) via de sinalização, e na regulação do citoesqueleto de actina. [27] MARCKS pode ser associada com