Abstract

Gynura procumbens

(Lour.) Merr. pertence à família Asteraceae. A planta é uma erva tradicional bem conhecida no Sudeste Asiático e é amplamente usada para tratar a inflamação, desconforto renal, colesterol elevado nível, diabética, câncer e hipertensão arterial. O nosso estudo anterior demonstrou a presença de proteínas de defesa da planta valiosos, tais como a peroxidase, a taumatina-miraculina como proteínas e na folha de

L. procumbens

. No entanto, os efeitos dessas proteínas de defesa no cancros nunca foram previamente determinada. No presente estudo, foi investigada a bioatividade da filtração em gel proteínas de

G fracionado. procumbens

extrato de folha. A fracção de proteína activa, SN-F11 /12, foi encontrado para inibir o crescimento de uma linha celular de cancro da mama, MDA-MB-231, com base num valor de EC50 de 3,8 ng /mL. As expressões de mRNA de marcadores de proliferação, de Ki67 e PCNA, foram reduzidas significativamente na MDA-MB-23 células tratadas com SN-F11 /12. A expressão do marcador de invasão, CCL2, também foi encontrada reduzida nas células MDA-MB-231 tratadas. Todos estes resultados destacam a propriedade anti-câncer do SN-F11 /12, portanto, as proteínas desta fracção pode ser um agente quimioterapêutico potencial para o tratamento do cancro da mama

Citation:. Hew CS, Khoo BY, Gam LH (2013) A propriedade anti-Cancer de proteínas extraídas de

Gynura procumbens

(Lour.) Merr. PLoS ONE 8 (7): e68524. doi: 10.1371 /journal.pone.0068524

editor: Natarajan Aravindan, Universidade de Oklahoma Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de março de 2013; Aceito: 29 de maio de 2013; Publicação: 11 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hew et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção RU da Universiti Sains Malaysia (número do projecto: 1001 /PFARMASI /815.034). Os autores também agradecem ao Instituto de Pós-Graduação de Universiti Sains Malaysia para a prestação de bolsa de estudos para Desbaste Chaw-Sen. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitas das drogas atualmente disponíveis são à base de plantas, e peptídeos vegetais e proteínas têm acabou por ser uma fonte crítica de compostos biológicos que exibiram bioatividades que podem ser exploradas como as drogas. Entre as atividades que estão sendo descobertos foram a actividade anti-tumoral de peptídeos extraídos de

Hypericum perforatum, Chelidonium majus L

.,

Inula helenium L

.,

Equiseteum arvense L

. e

Inonotus obliquus

[1]; propriedade do peptídeo macrocíclico extraído de anti-HIV

Palicourea

condensado [2]; actividade anti-microbiana das proteínas taumatina-como extraídas a partir de malte de cevada [3] e em diferentes tipos de proteínas das plantas [4]. Os produtos à base de plantas, incluindo as proteínas e os compostos moleculares pequenos têm sido sugeridos como as drogas favoráveis ​​para o tratamento do cancro, em vista dos muitos efeitos adversos exercidas pelos tratamentos de cancro actuais, ou seja a quimioterapia e terapia de radiação. Além disso, estes tratamentos são caros, o que pode ser um fardo para os pacientes. As plantas contêm vários ingredientes activos que podem ser usados ​​como medicamento para tratamento de doenças tais como o cancro da mama [5]. O cancro da mama é a principal causa de morte por câncer entre as mulheres em todo o mundo [6]. Embora a terapia de radiação e quimioterapia são modos regulares de tratamento dado aos pacientes com câncer, tratamento eficaz para o cancro da mama permanece limitado. À luz disto, um esforço significativo para lutar por agentes eficazes de plantas devem ser tomadas para identificar os agentes mais novos tanto para prevenção e tratamento de cancros humanos.

Gynura procumbens

(Lour.) Merr . é uma erva tradicional bem conhecida no Sudeste Asiático. A planta pertence à família Asteraceae. Esta planta é de cerca de 10-25 cm de altura e apresenta-se com folhas suculentas, elípticas e brilhantes arroxeadas [7]. As folhas de

G. procumbens

foram servido como alimento para décadas na Malásia, onde é geralmente consumida crua como salada. Além disso, a planta é amplamente usada para tratar a inflamação, dor renal, o nível de colesterol elevado, diabetes, cancro e pressão arterial elevada [7], [8]. Na verdade,

G. procumbens

é usado tradicionalmente no Sudeste Asiático por sua propriedade medicinal valiosa. Os compostos de baixo peso molecular extraído de

L. procumbens

foram relatados para exibir anti-câncer [9], anti-oxidante [10], anti-inflamatório [11], [12] As actividades anti-hiperglicêmicos e anti-hiperlipidemia. Além disso, detectaram a presença de proteínas de defesa da planta valiosos, tais como a peroxidase, a taumatina-miraculina como proteínas e a partir da folha de

L. procumbens

[13], [14]. No entanto, nunca foram determinados os efeitos do extrato de proteína em cânceres. Por isso, procurou-se analisar a actividade citotóxica das proteínas extraídas a partir de folhas de

L. procumbens

utilizando o ensaio de citotoxicidade de lactato desidrogenase (LDH) e posteriormente para determinar o percurso do mecanismo de citotoxicidade, através da expressão dos marcadores de proliferação e invasão em células MDA-MB-231 tratadas utilizando reacção em cadeia da polimerase semi-quantitativa (PCR). Além disso, as proteínas activas foram identificados utilizando análise por espectrometria de massa. Esperamos que os dados obtidos serão úteis para o futuro intervenção do fármaco à base de proteína para terapia de câncer.

Materiais e Métodos

materiais vegetais

Folhas de

G. procumbens

foram coletados a partir de Penang, na Malásia. Não há permissões específicas foram necessários para a coleta das folhas ea planta não é uma espécie vegetal protegida. Um número do voucher da amostra (11209) foi depositada no Herbário da Faculdade de Ciências Biológicas, Universiti Sains Malaysia. As folhas frescas foram lavadas duas vezes com água da torneira e lavado com água destilada.

extracto de proteína e purificação

A proteína foi extraído pelo método de Kiba

et ai.

(2003) [15] com ligeira modificação. folhas frescas de

G

.

procumbens (1 kg) foram moídos para um pó fino em azoto líquido usando misturador e misturou-se com 3 L de tampão de extracção [10 mM de NaH

2 PO?

4, 15 mM de Na

2HPO

4, cloreto de potássio 100 mM, ácido etilenodiaminotetracético 2 mM, 2 mM de tioureia, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM e 1,5% (w /v) de polivinilpolipirrolidona]. A mistura foi homogeneizada a cada 20 min durante 2 horas e incubou-se a 4 ° C durante a noite. O homogenato foi centrifugado a 15 000 rpm, 4 ° C durante 30 min. O extracto em bruto foi mantida a -20 ° C. Foram utilizados dois passos de precipitação com sulfato de amónio, sulfato de amónio sólido em que foi adicionado ao extracto em bruto de

L. procumbens

a 4 ° C até 30% de saturação foi atingido. O precipitado foi removido por centrifugação durante 30 min a 13 000 rpm. Subsequentemente, sulfato de amónio sólido foi adicionado outra vez ao sobrenadante restante para alcançar 70% de saturação e a solução foi centrifugada durante 30 min a 13 000 rpm e o sedimento foi recuperado. O sedimento foi então ressuspenso em água desionizada até estar completamente dissolvido. O sulfato de amónio bruto proteínas precipitadas foi carregado para uma coluna de filtração em gel, HiPrep 16/60 Sephacryl ™ S-100 ™ de alta resolução (GE Healthcare) utilizando ÄKTAprime mais sistema de purificação de proteínas. As proteínas foram eluídas com fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2 a um caudal de 0,5 mL /min para um volume total de 180 mL de tampão de eluição, o eluato foi recolhido em fracções de 5 ml cada. A concentração de proteína foi determinada utilizando RC /CC ™ Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories).

SDS-PAGE

dodecilo de sódio electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi usada para separar as proteínas recolhidos. Cada fracção foi misturada com não-redução tampão de amostra [Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8), 10% (v /v) de glicerol, 0,02% (w /v) de SDS e de 0,1% (w /v) de azul de bromofenol]. processo de eletroforese foi executado em uma tensão constante de 200V. O gel foi corado com Coomassie Blue.

LDH Ensaio de citotoxicidade

O MDA-MB-231 line (-26 HTB ™) cela era um presente amável de John Centro de Investigação Hopkins, que foi comprado a partir de American Type Culture Collection (ATCC). As células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Gibco BRL) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco BRL), 100 unidades /mL de penicilina e 100 mg /mL de estreptomicina (Gibco BRL ). As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada que consistia em 5% (v /v) CO

2. A actividade citotóxica foi realizada utilizando kit de lactato desidrogenase (LDH) ensaio de citotoxicidade (BioVision, EUA), LDH ser uma enzima citoplasmática presente em todas as células, de modo que vai ser libertada para o meio de cultura quando os danos da membrana plasmática da célula ter lugar. A actividade de LDH foi determinada por uma reacção enzimática acoplado onde LDH oxidado lactato para piruvato, o piruvato formado em seguida feito reagir com sal de tetrazólio para formar INT farmazan. O aumento na quantidade de formazano é directamente correlacionada com o aumento do número de células lisadas. A intensidade do corante de formazano foi medida por um leitor de ELISA. Um total de 1,0 × 10

5 células /mL de células MDA-MB-231 foi semeada em placa de cultura de 24 poços, que foi incubada a 37 ° C numa atmosfera humidificada constituída por 5% (v /v) CO

2 até que o crescimento celular alcançada aproximadamente 70% de confluência. O meio de cada poço foi rejeitado, as células foram lavadas suavemente com PBS e 2% de meio de crescimento (DMEM, suplementado com 2% (v /v) de FBS, 100 unidades /mL de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina) foi adicionado. As células foram tratadas com concentrações crescentes do extracto (em triplicado). Cem uL de meio de cultura foi retirado e ensaio de LDH de citotoxicidade foi realizado de acordo com o manual fornecido. Cem uL de meio de cultura foram transferidos para uma placa de imuno mistura de reacção e 100 uL (mistura de catalisador e uma solução de corante) foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. A absorvância de todas as amostras foi medida a 490 nm e o comprimento de onda de referência foi de 680 nm. A percentagem de citotoxicidade foi calculada como [(amostra de teste – baixo controle) /(alto controle – baixo controle)] x100, onde o baixo controle é a absorção de meio de cultura, sem adição de qualquer extracto e alto controle é a absorção de meio de cultura, onde as células foram tratadas com 1% (v /v) de Triton X-100 para libertar 100% da LDH.

Reacção em Cadeia da polimerase (PCR) Análise

o ARN total foi extraído a partir de células utilizando o RNeasy Mini Kits (Qiagen, EUA). O ARN total extraído foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando o RevertAid primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). As expressões de dois marcadores de proliferação, Ki-67 e PCNA, e dois marcadores de invasão, CCL2 e IL6, foram examinados em células MDA-MB-231 tratados e não-tratados utilizando PCR e densitometria gel. Os níveis de ARNm foram expressos como a intensidade das bandas dos marcadores dos produtos de PCR em relação ao controlo de beta actina produto de PCR. Os iniciadores utilizados para as reacções de PCR foram as seguintes: antigénio Ki-67, para a frente: 5′-AACTATCCTCGTCTGTCCCAACAC-3 ‘, reverso: 5′-CGGCCATTGGAAAGACAGAT-3′; antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), Forward: 5’-AGAAGGTGTTGGAGGCACTCA-3 ‘, Reverso: 5′-GGTTTACACCGCTGGAGCTAA-3’; quimioquina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2), para a frente: 5 ‘GCTGTGATCTTCAAGACCATTGTG-3′, reverso: 5’-AGTGAGTGTTCAAGTCTTCGGAGTT-3 ‘; interleucina 6 (IL6), Forward: 5’-CCAGTACCCCCAGGAGAAGATT-3 ‘, Reverso: 5′-CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3′; actina beta, Forward: 5’-CATTGCCGACAGGATGCA-3 ‘, Reverso: 5′-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’. As reacções de PCR consistiram em 5 ul de ADNc (5 ng), 12,5 ul de Mistura de PCR, 1 ul de cada uma 20 pmol de iniciadores directo e inverso e água DNase /RNase livre de para um volume final de 25 uL. As reacções foram estabelecidas durante 30 ciclos, com as seguintes condições; pré-amplificação: 94 ° C durante 10 min, a desnaturação: 94 ° C durante 20 s, emparelhamento: 55 ° C durante 20 s, extensão: 72 ° C durante 30 s, terminação: 72 ° C durante 10 min. Cada reacção de PCR foi efectuada em triplicado e os produtos de PCR foram submetidos a electroforese em 2% (w /v) de gel de agarose contendo 0,1 ug /mL de EtBr. Bandas de produto de PCR em gel foram capturadas utilizando o gene Genius Image Analyser e a intensidade da banda foi analisada utilizando Quantity One Software (Bio-Rad, EUA).

em gel Digestão

digestão -gel foi realizada utilizando o método descrito por [16]. As bandas de proteína foram excisadas a partir de SDS-PAGE. Os pedaços de gel foram lavados com bicarbonato de amónio 100 mM durante 10 min e, em seguida, com acetonitrilo (ACN) durante 5 min. Este passo foi repetido duas vezes. Os pedaços de gel foram então secos numa centrífuga de vácuo Speed-. Os pedaços de gel seco foram adicionados com DTT 10 mM em bicarbonato de amónio 100 mM e incubou-se durante 1 hora a 56 ° C. solução excessiva foi removido. Os pedaços de gel foram então incubadas com ácido iodoacético 55 mM em bicarbonato de amónio 100 mM no escuro durante 45 min à temperatura ambiente. Os pedaços de gel foram lavados com bicarbonato de amónio 100 mM durante 10 min e, em seguida, com acetonitrilo (ACN), durante 5 min, duas vezes. Os pedaços de gel foram tratadas com 15 ng /mL de tripsina em tampão de digestão [bicarbonato de amónio 50 mM, 5 mM de CaCl

2] e incubou-se a 37 ° C durante a noite. O sobrenadante da digestão tríptica foi recolhido e os péptidos restantes foram extraiu-se 3 vezes em 5% (v /v) de ácido fórmico em 30:70 de ddH2O: ACN. Os sobrenadantes foram reunidos e golpe seco utilizando azoto gasoso.

Fase Reversa Cromatografia Capilar e espectrometria de massa

cromatografia capilar fase reversa (Waters Acquity Ultra Performance Cromatografia Líquida [UPLC]) foi acoplado com tempo- quadrupolo em tandem de-voo de espectrometria de massa (Waters, Milford, MA, EUA), ligado a um calibrador de massa exacta LockSpary. fonte de ionização utilizado foi ESI (ionização por electrospray mole). A amostra foi injectada para o sistema através de um amostrador automático. As amostras foram injectadas num UPLC Trizaic nanoTile (Waters, Milford, MA, EUA) consistiu de uma coluna de captura e uma coluna capilar. A proteína de digestão foi pré-concentrada e dessalinizada sobre o cartucho de aprisionamento coluna embalada com 1,8 um de alta resistência de sílica (HSS) partículas com um caudal de 8

μ

L /min de 99% de A durante 3 minutos. Os péptidos foram então eluida numa coluna capilar de fase inversa (1,8 um HSS de partículas, 85 um x 100 mm) a um modo de gradiente de 3% de B até 40% de B em 30 min a um caudal de 0,45 mL /min. Solvente A consistiu de água com ácido fórmico 0,1%, e o solvente B consistiu em acetonitrilo com 0,1% (v /v) de ácido fórmico. O eluato foi submetido a MS no sistema. Todos os espectros de massa foram adquiridos usando o espectrômetro de massa Q-TOF. Os parâmetros Q-TOF foram definidos da seguinte forma: modo positivo; capilar, 3,2 kV; cone de amostragem, 28,0; cone de extracção, 2,0; temperatura da fonte, 70 ° C; temperatura de dessolvatação, 200 ° C; fluxo de gás cone, 40,0 L /h; fluxo de gás dessolvatação, 600,0 L /h; tempo de verificação, 0,2 s. Os espectros foram registados a partir de

m /z Página 2 a 1200. Calibração externa foi aplicado a todos os dados usando [GLU1] padrão B -Fibrinopeptide (Waters). aquisição de digitalização levantamento foi feito on-line com capilar separação cromatográfica; uma inicial TOF-MS varredura foi adquirido ao longo da faixa de massa de 2-1200 m /z cada segundo, com critérios de distribuição para MS para MS /MS, que incluiu a intensidade de iões (100 contagens /s) e estado de carga (2). MS /MS de ião precursor seleccionado foi adquirida ao longo do intervalo de massa de 50-1600 m /z. A energia de colisão foi de 6 eV.

Protein Identificação

pesquisa Base de dados foi realizada com os dados MS /MS gerados usando toda a ordem taxonomia

Viridiplantae

sob banco de dados SwissProt. Péptido tolerância e tolerância massa fragmento foram fixadas em 0,1 e 2 BDA Da, respectivamente, e apenas uma clivagem desperdiçada é permitido. cisteína Carbamidomethylated foi definido como modificação fixo, enquanto que a metionina oxidada foi definido como modificação variável.

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão (SE) de três experiências indepent e a análise estatística foi feita usando o teste t de Student. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

tampão fosfato leve foi usado para extrair proteínas a partir da folha de

G.. procumbens

, a fim de evitar a desnaturação das proteínas.

In vitro

estudo bioatividade indicou que o extrato de folha bruto liofilizado de

G. procumbens

possuía actividade anti-proliferação contra a linha celular de cancro da mama MDA-MB-231. Portanto, o fraccionamento do extracto de proteína foi realizada a fim de isolar a proteína (s) de interesse. precipitação com sulfato de amónio foi utilizado como o primeiro passo na purificação das proteínas, conforme o método é não desnaturante para proteínas, este método de precipitação de sal destina-se a remover os compostos de baixo peso molecular a partir do extracto [17]. As proteínas sal precipitado, em seguida, foram submetidos a filtração em gel, em que uma maior separação de proteínas de acordo com o tamanho foi realizada. O eluato da cromatografia de filtração em gel foi recolhido em fracções de 5 ml de volume cada. Todas as fracções foram testadas para actividade anti-proliferação contra a linha celular de cancro da mama, MDA-MB-231

In vitro

. actividade anti-proliferação forte foi detectada nas fracções 11 e 12, onde fracção 11 foi consistiu na 51

st a 55

th mL eluato, enquanto fracção 12 foi recolhida a partir do 56

th a 60

th eluato mL (Figura 1) de um total de 180 mL de tampão de eluição usado. A Figura 2 mostra a análise de SDS-PAGE de fracções de 9 a 14.

A separação de filtração em gel foi realizada usando HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR coluna. As fracções de proteína foram eluídas com fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2, e velocidade de 0,5 mL /min de fluxo. As fracções de proteína activa 11 e 12 foram eluídas para dentro de 50 mL a 60 mL de tampão de eluição.

A nossa análise preliminar indicou que as fracções 11 e 12 possuíam actividade anti-proliferação em células MDA-MB-231. Ambas as fracções 11 e 12 mostraram perfis de proteínas idênticas.

As fracções 11 e 12 foram reunidas e denominada SN-F11 /12. ensaio de LDH citotoxicidade foi realizada na linha celular MDA-MB-231 em que a célula foi tratada com SN-F11 /12. Figura 3a mostra a percentagem de LDH libertada para os meios de cultura que foram tratados com diferentes concentrações (5-25 mg /mL) de SN-F11 /12, os tratamentos foram realizados durante 24, 30, 36, 42 e 48 horas e após cada percentual LDH período de tratamento liberada para os médiuns foi medido. (

50 CE) valor de concentração efectiva é definida como a concentração expressa em ug /mL de proteínas no extracto que inibia 50% do crescimento celular. CE

50 valores para os diferentes períodos de tratamento foram determinados e são mostrados na Figura 3b, a partir do qual a constante CE

50 valor para SN-F11 /12 verificou-se ser de 3,8 ug /mL de proteínas.

Cada curva de liberação% LDH foi registada em função do respectivo ponto de tempo de tratamento. valor B. A EC50 foi representada graficamente contra o respectivo ponto de tempo de tratamento para a determinação do valor de EC50 constante. O valor EC50 constante de SN-F11 /12 na MDA-MB-231 foi de 3,8 ng /mL.

Além disso avaliação do mecanismo anti-proliferação exibido por SN-F11 /12 na MDA-MB -231 foi realizada utilizando a técnica de PCR, em que o valor de EC50 determinado constante foi utilizada para tratar as células MDA-MB-231 e, subsequentemente, a expressão de dois marcadores proliferativas, Ki67 e PCNA, foram examinadas. beta actina foi utilizado como controlo de carga. A expressão de Ki-67 e PCNA foi encontrado regulada para baixo em comparação com as células cultivadas sem tratamento (Figura 4A). Ki-67 foi significativamente reduzida em células MDA-MB-23 após 36 e 48 horas de tratamento com SN-F11 /12 em comparação com as células tratadas com un. A expressão de PCNA entre células tratadas e não-tratadas não foi significativamente diferente embora o SN-F11 /12 células tratadas expressaram níveis mais baixos de PCNA (Figura 4b).

As figuras mostram a expressão de ARNm normalizado de (A) Ki67 e PCNA (B) nas células MDA-MB-231 tratadas. A expressão de ARNm de gene alvo foi normalizada para a expressão de ARNm de beta-actina. Cada dado representa a média ± DP de três experiências independentes. A análise estatística foi determinada utilizando

t

teste de Student com *

p

. 0,05 como significância estatística, em comparação com as células não tratadas em cada ponto de tempo

Para além dos marcadores de proliferação, a expressão dos dois marcadores de invasão, CCL-2 e IL-6 foram também examinadas utilizando a técnica de PCR. A expressão de CCL2 em células MDA-MB-231 foi regulada para baixo após SN-F11 /12 de tratamento, em comparação com a célula (Figura 5a) tratado com un. Pelo contrário, a expressão de IL-6, que é normalmente envolvidos na promoção da invasão celular, foi encontrado sobre-regulada seguinte SN-F11 /12 tratamento (Figura 5b).

As figuras mostram a expressão de ARNm de normalizada (a) CCL2 e IL6 (B) nas células MDA-MB-231 tratadas. A expressão de ARNm de gene alvo foi normalizada para a expressão de ARNm de beta-actina. Cada dado representa a média ± DP de três experiências independentes. A análise estatística foi determinada utilizando

t

teste de Student com *

p

. 0,05 como significância estatística, em comparação com as células não tratadas em cada ponto de tempo

perfis de proteína SDS-PAGE em SN-F11 /12 mostrou a presença de 15 bandas proteicas, cada banda foi excisada por digestão em gel e os péptidos trípticos digerido foram analisadas utilizando LC /Q-TOF. A Figura 6 mostra o perfil de SDS-PAGE da fracção activa SN-F11 /12 e a proteína identificada foi listada na Tabela 1, as bandas de proteína 13 foram identificados com sucesso, enquanto 2 bandas de proteína mostrou nenhum hit proteína.

A proteína identificada bandas foram contados como indicado à direita. A análise identificou 15 bandas de proteínas no gel.

Discussão

Anteriormente, compostos de baixo peso molecular do extrato etanólico das folhas e extrato aquoso da folha de

G. procumbens

foram mostradas para inibir o crescimento da linha celular de cancro da mama T47D [9] e a proliferação de células mesangiais humano [18], respectivamente. Até à data, não existe qualquer informação sobre a bioactividade do extracto de proteína a partir da folha de

L. procumbens

. Este é o primeiro relatório revelando a propriedade citotóxica das proteínas folha de

G. procumbens

. Neste estudo, os extratos de folhas de

G. procumbens

foram submetidos a alguns passos de purificação antes de ser usado para o teste. Os extratos foram submetidos à precipitação de sal para remover compostos de baixo peso molecular, enquanto as proteínas foram salgado como pellet. O sedimento foi demonstrado exibir actividade citotóxica na linha de células de cancro da mama MDA-MB-231 como observado sob um microscópio invertido. Subsequentemente, o pelete foi submetido a purificação por meio de cromatografia de filtração em gel para remoção de sal e também para maior separação de proteínas de acordo com o tamanho [17]. Depois disso, frações de proteínas activas 11 e 12 foram mostrados para ter perfis de proteínas idênticas e eles foram agrupados como SN-F11 fração /12. SN-F11 /12 foi encontrado para expor atividade citotóxica potente on-23 MDA-MB linha de células de cancro da mama, avaliada pelo ensaio de LDH citotoxicidade.

Os dados recolhidos a partir do ensaio LDH citotoxicidade indicaram que SN-F11 /12 exibida propriedade inibidora potente sobre o crescimento de células MDA-MB-231 com um valor de EC50 constante de 3,8 ug /mL. O efeito anti-proliferativo de SN-F11 /12 foi revelada pela supressão dos mRNAs de dois marcadores de proliferação, ou seja, de Ki67 e PCNA, que são essenciais para a replicação de ADN [20]. Ambos os marcadores são genes relacionados com o ciclo celular que habitualmente utilizados na avaliação de

in vitro

anti-proliferativa de drogas [19]. Ki67 é um antígeno nuclear expressas em G1, G2 e M fases [20] enquanto PCNA é expresso em G1, G2 e S fases [21] do ciclo celular. Os nossos resultados mostraram a expressão diferencial destas duas marcadores em SN-F11 /12-tratadas e não-tratadas células MDA-MB-231, em que a expressão de ARNm de Ki67 foi significativamente (p 0,05) sub-regulada no último enquanto o redução da expressão de mRNA PCNA não parecem diferir significativamente. Ki67 e PCNA têm características distintas e meia-vida [22]. Em geral, a expressão de Ki67 é unicamente indicando a proliferação de células, enquanto a expressão de PCNA, além de proliferação celular, indica também a reparação do ADN ou morte celular. A observação de diferentes níveis de ARNm de Ki67 e PCNA ARNm podia ser atribuído à meia-vida do PCNA que é 20 vezes maior do que a de Ki67. Além disso, a proteína PCNA é encontrado ciclo celular pós e morte celular. A detecção de PCNA após a morte celular pode ser a razão para a expressão PCNA insignificante diferencial entre células MDA-MB-231 SN-F11 /12-tratados e não-tratados. Por conseguinte, o efeito anti-proliferativo de SN-F11 /12 em células MDA-MB-231 é provavelmente correlacionados com Ki67 e PCNA, os índices proliferativas comumente utilizados para

In vitro

estudo.

CCL2 e IL6 estão envolvidas na invasão da célula cancerosa. No processo de desenvolvimento do cancro, CCL2 em conjunto com o factor macrófago estimulador de colónias (M-CSF) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) desempenham um papel activo para recrutar monócitos circulantes do sangue para o local do tumor, onde os monócitos recrutados será diferenciadas em macrófagos associados a tumores (TAM) e estabelecer uma relação simbiótica com as células tumorais. Subsequentemente, a TAM segregam factores de crescimento, tais como EGF, TGF, FGF, VEGF, IL-1, TNF e IL-6 que promovem a proliferação de células de tumor, invasão e metástase [23]. As expressões de ARNm dos dois marcadores de invasão, CCL2 e IL6, foram inversamente um ao outro. A expressão de ARNm de CCL2 foi regulada para baixo enquanto que a expressão de ARNm de IL-6 foi regulada em células SN-F11 /12-tratados MDA-MB-231. CCL2 é uma das quimiocinas essenciais para o desenvolvimento e progressão do cancro da mama [24]. Superexpressão de CCL2 promove a metástase do câncer de mama [25]. Pelo contrário, a inibição da CCL2 e a sua via de sinalização do receptor reduz a metástase

In vivo

e prolonga a sobrevivência de murganhos portadores de tumores [26]. IL6 é uma interleucina que desempenha um papel chave na patofisiologia de diversos cancros e várias desordens inflamatórias do sistema imune [27]. IL6 sobre-expressão tem sido implicada na tumorigénese do mieloma múltiplo, do ovário, de células renais, próstata, colo do útero e da mama carcinomas [28], [29], [30], [31]. Num estudo anterior, CCL2 foi relatada para contribuir para o desenvolvimento de fibrose pulmonar, reduzindo os níveis de IL6 [32]. Neste estudo, o tratamento de células MDA-MB-231 com SN-F11 /12 diminuiu a expressão de ARNm nas células CCL2. Pelo contrário, a expressão de ARNm de IL-6 nas células MDA-MB-231 SN-F11 /12-tratados foi regulado para cima quando comparado com as células da ONU-tratada. Como IL6 tinha sido mostrado para ser uma citoquina pleiotrópica com ambos indutor de tumores e actividade inibidora [33], a sobre-regulação da expressão de ARNm de IL-6 nas células MDA-MB-231 SN-F11 /-tratados 12 podem causar uma efeito inibidor para o crescimento da linha celular de cancro da mama.

Como SN-F11 /12 tem mostrado resultados promissores de anti-proliferação e anti-invasão por células MDA-MB-231, a fracção proteica foi ainda avaliada por SDS-PAGE e análise por espectrometria de massa. Dos doze proteínas identificadas na classe SN-F11 /12, duas proteínas, ou seja, superóxido zinco dismutase cooper (Cu, Zn-SOD) e Toll interleucina 1 Receptor-Nucleotide Binding Site-Leu-Rich Repeat (TIR-NBS-LRR) proteína de resistência a doenças pertencia à planta categoria proteínas de defesa. Estas proteínas de defesa da planta também tem sido detectada em

Corydalis cava

tubérculos extrair onde foram encontrados para inibir o crescimento da linha de células HeLa [34]. A superóxido-dismutase (SOD) é um antioxidante que catalisa a dismutação de radicais aniónicos superóxido em peróxido de hidrogénio e oxigénio [35]. A proteína pertence ao grupo metaloenzima em que a actividade depende de iões metálicos na forma de Cu, Zn-SOD, Mn-SOD e Fe-SOD [36]. Zhang

et al

. (2002) [37] relataram que a sobre-expressão de Cu, Zn-SOD suprime o crescimento de células tumorais humanas. No entanto, Cu, Zn-SOD extraído de alho exibida efeito antagonista de doxorubicina, uma das drogas anti-cancro mais vulgarmente utilizados, alivia a citotoxicidade de drogas anticancro em linhas celulares de tumores [38], [39]. Em nosso estudo, Cu, Zn-SOD foi detectada em quatro bandas de proteínas diferentes de SN-F11 /12. No entanto, se a Cu, Zn-SOD, é a proteína que contribui para a propriedade anti-cancro da fracção de proteína activo SN-F11 /12 exige uma avaliação mais aprofundada.

A classe TIR-NBS-LRR de resistência a doenças ( proteínas R) tem sido relatada a desempenhar um papel crucial na morte celular programada como parte do sistema imunitário de plantas [40]. A actividade de ATPase domínios NBS exibição enquanto o domínio LRR é conhecido por mediar a proteína-proteína e interacções proteína-ligando. A classe TIR-NBS-LRR de proteínas de resistência a doença (R) também está envolvido no reconhecimento específico de eliciador derivado do agente patogénico [41]. No reino das plantas, o domínio TIR que está presente na extremidade N-terminal de proteínas R transporta o NBS e LRR, sendo necessária para morte celular de sinalização [42].

ascorbato peroxidase (APX) é uma planta proteínas de defesa que também foi detectado em SN-F11 /12. APX, em conjunto com glutationa peroxidase e catalase, fazem-se as enzimas antioxidantes que estão envolvidas na desintoxicação de peróxido de hidrogénio (H

2O

2). A seguir à formação de peróxido de hidrogénio por meio de reacção enzimática de SOD, desintoxicação de peróxido de hidrogénio é levada a cabo por estas enzimas antioxidantes, os quais catalisam a conversão de peróxido de hidrogénio em água [43]. Uma relação de saldo de SOD para as enzimas antioxidantes é um necessária para a função apropriada da célula, onde os altos níveis de SOD em relação às enzimas antioxidantes irá conduzir a uma acumulação de radicais superóxido que são tóxicos para macromoléculas, enquanto que os baixos níveis de SOD relativa para as enzimas antioxidantes que resultará num aumento na concentração de peróxido de hidrogénio que irá ser subsequentemente convertido em hidróxido de radical (-OH), uma espécie muito reactivos, que é responsável pelo dano oxidativo da célula [37].

Malato desidrogenase foi a proteína mais abundante detectada na fracção de proteína activa de SN-F11 /12, uma vez que foi detectado em sete das bandas proteicas de SDS-PAGE. Malato desidrogenase catalisa uma NAD reversível

+ – reacção dependente de desidrogenase no ciclo TCA [44]. Kim

et.

ai (2008) [45] revelou que a actividade de desidrogenase do malato é antagonizada pela actividade da glicose 6-fosfato desidrogenase em desidroepiandrosterona (DHEA) ratos tratados com carcinoma hepatocelular.