Abstract
Cabeça e Pescoço Carcinoma de células escamosas (CECP) é o quinto câncer mais comum, afetando anualmente mais de meio milhão de pessoas em todo o mundo. Presentemente, não há biomarcadores aceitos para detecção e vigilância de HNSCC clínica. Neste trabalho, uma análise abrangente de todo o genoma de alterações epigenéticas em tumores primários CECP foi empregado em conjunto com as estatísticas outlier específicos do cancro para definir novos genes biomarcadores que são diferencialmente metilados para CECP. Os 37 candidatos biomarcadores identificados foram genes outlier top-marcando com metilação diferencial importante em tumores, mas sem nenhum sinal em tecidos normais. Estes candidatos putativos foram validados em coortes CECP independentes de nossa instituição e TCGA (The Cancer Genome Atlas). Usando os principais candidatos,
ZNF14
,
ZNF160
, e
ZNF420
, um ensaio foi desenvolvido para a detecção de câncer de CECP em amostras primárias de tecidos e saliva com 100% de especificidade quando em comparação com amostras de controlo normais. Dada a especificidade de detecção de altura, a análise de metilação do DNA ZnF em combinação com outros biomarcadores de metilação de ADN pode ser útil na prática clínica para a detecção de carcinoma epidermóide e vigilância, particularmente em pacientes de alto risco. Vários candidatos adicionais identificadas através deste trabalho pode ser investigado para o desenvolvimento futuro de um painel multi-gene de biomarcadores para a vigilância e detecção de HNSCC
Citation:. Gaykalova DA, Vatapalli R, Wei Y, Tsai HL, Wang H, C Zhang, et ai. (2015) Análise Outlier Define zinco dedo Gene Família DNA metilação em tumores e Saliva da cabeça e pescoço pacientes com câncer. PLoS ONE 10 (11): e0142148. doi: 10.1371 /journal.pone.0142148
editor: Kwok-Wai Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 10 de fevereiro de 2015; Aceito: 18 de outubro de 2015; Publicação: 06 de novembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Gaykalova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability: Affymetrix dados de expressão . disponível em GEO33205 e Illumina metilação de dados no GEO33202
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial e Instituto Nacional de Saúde Desafio Grant (RC1DE020324); Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial e concessão do National Cancer Institute (P50 DE 019.032 Head and Neck Cancer SPORE) para JAC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Cabeça e Pescoço carcinoma espinocelular (CECP) afeta cerca de 60.000 pessoas nos Estados Unidos e 600.000 indivíduos em todo o mundo anualmente [1, 2]. HNSCC é comumente causado pelo tabaco e exposição ao álcool, bem como pelo papilomavírus humano (HPV) [1]. Apesar dos avanços na compreensão da biologia HNSCC, cerca de metade de todos os pacientes com sucumbem HNSCC à doença no prazo de cinco anos após o diagnóstico [2-4].
É agora amplamente observado que todo o genoma hipometilação, acompanhado por específicos do gene hipermetilação do promotor, é uma característica geral de tumores sólidos [5, 6]. Hipermetilação do promotor foi descrita por um extenso número de genes, e geralmente resulta em gene supressor de tumor repressão transcricional [3]. Dada a elevada incidência de alterações da metilação do DNA em células cancerosas, bem como a estabilidade do sinal de metilação do DNA durante a divisão celular, a detecção da metilação do DNA é uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de marcadores para a detecção e prognóstico [7-9] cancro. Vários ensaios de metilação todo o genoma têm sido realizados para definir a assinatura de metilação do DNA de HNSCC [5, 10-14]. metilação do DNA de
DCC
,
EDNRB
,
DAPK
,
CCNA1
,
p16
,
HOXA9
e
KIF1A
genes foram detectados em tecidos primários e fluidos biológicos, incluindo o plasma e saliva [7, 10, 15, 16], derivadas de pacientes com CECP. metilação do DNA de vários outros genes, incluindo
MINT31
,
MGMT
,
NID2
,
ERCC1
, e
TIMP3
, têm sido propostos como biomarcadores de HNSCC que podem ser detectadas em fluidos biológicos de um paciente [11, 16]. Outros genes, como
CYGB
,
RASSF1A
,
SPARC
,
GSTM1
,
cyclinA1
,
MX1
,
WIF1
,
GNG7
,
CYP1A1
,
ZNF132
,
ZNF154
, e
ZNF447
demonstraram elevadas taxas de metilação do DNA em tumores primários CECP [13, 14, 16-23], e são candidatos a uma validação adicional de detecção da metilação do DNA em fluidos corporais. Genome-wide identificação de genes alterados em epigeneticamente HNSCC aumenta a uma compreensão dos mecanismos da carcinogénese. Além disso, estas abordagens podem descobrir novos eventos de metilação do DNA específicos de cancro que podem ser utilizados para estratégias de detecção moleculares nas margens cirúrgicas ou fluidos corporais, 24-27 [7].
Dados recentes sugerem que a detecção da metilação do promotor de
EDNRB
e
DCC
em pacientes com lesões orais de alto risco tem um desempenho semelhante no diagnóstico como a avaliação clínica especializada [25]. No entanto, testes utilizando
DCC
e
EDNRB
metilação do promotor é limitado a sensibilidade de 46% e 72% de especificidade para a detecção de câncer em salivar lavagens [25]. Enquanto baixa sensibilidade pode ser limitada pela raridade das alterações relacionadas com o cancro [11, 25, 28], baixa especificidade levanta preocupações técnicas. Embora o aumento do limite de detecção do teste pode aumentar a especificidade [10, 25], isto requer manipulações valor de corte adicionais que não são práticos na prática clínica. Portanto, a detecção de novos marcadores de DNA com especificidade absoluta para os tecidos de câncer pode melhorar os painéis de biomarcadores atuais e aumentar o potencial de aplicação clínica de estratégias de detecção molecular [7, 24-26]. Baixa sensibilidade de biomarcadores individuais que são altamente específicos para os tecidos de câncer podem ser superados através da combinação de vários genes altamente específicos para os painéis sem sacrificar a especificidade global [11].
Dada a natureza abrangente de técnicas de alto rendimento, milhares de diferencialmente regiões metiladas pode ser detectado ao comparar amostras de tumor e normais [10]. A heterogeneidade das alterações genéticas e epigenéticas em tumores sólidos tem apresentado desafios no uso de abordagens estatísticas convencionais, tais como t-testes ou testes de sinal-para-ruído. Estas dificuldades podem ser minimizados através da utilização de análises baseadas outlier para fornecer uma medida de significância estatística para alterações heterogéneos em tumores. análise do outlier com base forneceu um mecanismo para definir significativas, mas diversas, alterações em cancros. O método padrão utilizado na pesquisa do câncer para análise outlier é Cancer Outlier Análise de Perfil (COPA [29]), o que compara valores extremos a um nulo empírica. Para eliminar resultados isolados de sinal fraco, este trabalho implementado estatísticas baseadas em COPA com uma abordagem outlier rank sum, bem como definir um nível mínimo para a convocação de um outlier [30]. Este é o primeiro trabalho utilizando análise outlier [30] para a descoberta de biomarcadores.
Materiais e Métodos
As amostras de tecido
tecidos tumorais primárias e amostras de lavagem salivares combinados foram coletadas de HNSCC pacientes no Johns Hopkins Hospital depois de informado, foi obtido consentimento por escrito. Este estudo foi aprovado pelo Johns Hopkins Medicine Review Interno Board (IRB JHM) e realizada sob NA_00036235 protocolo de pesquisa. No geral, foram utilizados dois grupos independentes de CECP amostras de pacientes e amostras de controlo normais. Todos os seres humanos que participaram neste estudo foram de-identificados após a coleta de dados clínicos. A coorte descoberta foi composto por 44 tecidos CECP primárias e 25 amostras de mucosa normais de uvulopalatofaringoplastia (UPFP) cirurgias de pacientes do grupo controle não-cancerosas afetadas de estudos publicados anteriormente [31-33]. A coorte de validação independente incluída tecidos tumorais primárias e amostras de lavagem salivares correspondentes em 59 pacientes com CECP, 31 amostras de tecido normal UPFP, e 35 amostras de lavagem salivares de pacientes não-cancerosos. Todo o tecido primária e amostras de fluidos corporais foram armazenadas a -140 ° C até à sua utilização. Todas as amostras de tecido primárias foram analisados por investigadores do Departamento de Patologia do Johns Hopkins Hospital (WHW e JAB). As amostras de tumor foram confirmadas como sendo HNSCC e subsequentemente foram microdissecadas para produzir, pelo menos, 75% de pureza do tumor. As características clínicas de ambos os grupos estão listados nas Tabelas S1 e S2. A distribuição de CECP sub-tipos em ambas as coortes é representativa da distribuição de câncer de cabeça e pescoço, tanto nos Estados Unidos e no mundo, incluindo ~ 30% das relacionadas com o HPV (HPV +) casos de CEC de orofaringe. A validade desta coorte descoberta, e a sua adequação para várias análises tem sido demonstrada em várias publicações anteriores [31-34]. Em um esforço para reduzir o preconceito e obter câncer controles não afetados robustos, pacientes do grupo controle foram selecionados aleatoriamente a partir de amostras de tecido UPFP disponíveis e salivar lavagens, mas as características clínicas não foram capazes de ser correspondido.
preparação de ADN
microdissecadas amostras de tecido de tumor ou 250 mL alíquotas de amostras de saliva foram digeridas em solução de 1% de dodecilsulfato de sódio (SDS) (Sigma) e uma solução de 50 ug /ml de proteinase K (Invitrogen) a 48 ° C durante 48-72 horas. O DNA foi purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol, como descrito anteriormente [35]. O DNA foi ressuspenso em tampão de lote, e a concentração de ADN foi quantificado utilizando o espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific).
preparação de RNA
O ARN foi isolado a partir das amostras de tecido microdissecadas com o kit de isolamento de miARN (miRvana Ambion) as recomendações do fabricante, e concentração de ARN foi quantificada usando o NanoDrop.
Arrays
Dez microgramas de RNA e DNA foram submetidos à Facilidade de Johns Hopkins Núcleo de consulta de controle de qualidade e análise da amostra por matrizes de alto rendimento. As amostras foram corridas em GeneChips Affymetrix HuEx1.0 (contendo 1,4 milhões de sondas) para análise da expressão e Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChips (sondagem 27,578 dinucleótidos CpG) para a análise de metilação seguintes conversão bissulfito. Todas as matrizes foram executados de acordo com os protocolos do fabricante e os dados foram relatados anteriormente [31-33]. Affymetrix dados de expressão está disponível em GEO33205 e Illumina metilação de dados está disponível em GEO33202. Ambos os conjuntos de dados estão disponíveis no GEO Superseries GSE33232. Os dados podem ser acessados no https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE33232.
HPV análise
Os laudos referentes à status de HPV de tumores CEC de orofaringe foram obtidos a partir do Johns Hopkins Hospital Departamento de Patologia. Além disso, o estatuto de HPV de todos os SCC tecidos de tumor primário da orofaringe foi confirmado independentemente por PCR quantitativa (qPCR), utilizando iniciadores de HPV16 e sondas na em tempo real máquina de PCR [7] em relação ao CaSki linha (ATCC) celular, conhecida por ter 600 cópias de HPV16 por genoma. As amostras com número de cópias do HPV ≥ 1 copy /genoma /celulares foram identificados como HPV positivo.
Bissulfito Tratamento e Bissulfito Genomic Sequencing
O EpiTect Bissulfito Kit (Qiagen) foi utilizada para converter citosinas não metiladas em ADN genómico de uracilo. DNA tratado com bissulfito foi amplificado com primers desenhados usando MethPrimer [36, 37] (S3 Tabela). pares de primers foram concebidos dentro da ilha CpG circundante região promotora de grande proximidade com as sondas de matriz metilação. A amostra representativa a partir da descoberta coorte foram escolhidos com base em maiores diferenças na metilação e expressão simultânea, calculado durante a análise outlier para cada gene individual. seqüenciamento bissulfito foi escolhido para esta etapa a fim de verificar o absoluto (não parente ou normalizado) estado de metilação de vários dinucleótidos CpG na ilha CpG perto do promotor de cada gene. Touch-down PCR foi realizada [38]. Os produtos de PCR foram purificados utilizando o QIAquick PCR Purification Kit 96 (Qiagen) e produtos de PCR purificados foram sequenciados (Genewiz). estado do gene de metilação foi determinada como uma variável tricotômica (não metilado, hemimethylated ou hipermetilado) de acordo com a sequência de leituras.
quantitativa metilação específicas de PCR (QMSP)
Para QMSP, iniciadores foram concebidos para especificamente incluem dinucleótidos CpG que mostraram alterações na metilação como visto por sequenciação de bissulfito. QMSP foi realizada no tempo real máquina de PCR com normalização
controlo
referência não metilado β-actina [39]. A máquina Taqman PCR foi definido em no máximo 38 ciclos para eliminar sinais de falso-positivos. DNA de leucócitos converteu-bissulfito a partir de um indivíduo saudável foi utilizado como um controlo negativo. O nível relativo de ADN metilado em cada amostra foi determinado como uma proporção do gene amplificado
β-actina
[40] e multiplicado por 100. As sequências dos iniciadores e sondas utilizadas podem ser encontradas na Tabela S3.
transcrição reversa e quantitativa PCR em tempo real
Um mg de RNA a partir da coorte de validação foi transcrição reversa usando o High Capacity cDNA Transcrição reversa Kit. Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando ensaios de expressão de gene específico (Tabela S3) e Universal PCR Master Mix na em tempo real máquina de PCR 7900HT (todos da Applied Biosystems) com as recomendações do fabricante. A expressão do gene de interesse foi quantificado em triplicado em relação ao
GAPDH
e
18S
expressão usando o método 2-ΔΔCT [41].
A análise estatística
metilação normalização dos dados.
Para os dados de metilação do promotor, os valores de p (proporção de metilação) foram estimados a partir de medidas não metilado (U) e metilado (M) numa base de nível de sonda. estimativas a nível Gene foram produzidos por escolher os mais altos níveis de metilação entre todas as sondas ligadas a um mesmo gene (14.477 genes total).
núcleo significativo de determinação de sonda.
dados de expressão de genes foi normalizada com o robusto de multi análise -array média (RMA) usando o pacote Bioconductor oligo [42, 43]. estimativas a nível Gene foram produzidos por RMA usando as sondas núcleo, produzindo 22,011 genes para análise [31, 32].
Análise Outlier.
O método padrão utilizado na pesquisa do câncer para análise outlier é Câncer outlier Profile Analysis (COPA), que compara as distribuições outlier a um nulo empírica gerada pela permutação de rótulos de classe [29]. Uma abordagem soma outlier classificação modificado, modificado a partir Ghosh [44], foi utilizado, em que os níveis mínimos de mudança foram definidas para a definição de um outlier [30]. Isto eliminou diversos valores aberrantes em que a mudança não era biologicamente significativa (por exemplo, alteração inferior a 10% entre quaisquer duas amostras de metilação). Estas estatísticas foram aplicados ao ADN descoberta conjunto de dados de metilação, contendo 14.477 genes para tecidos tumorais 44, em que os sinais a partir de 25 amostras normais foram utilizadas para estabelecer a linha de base de ponto de corte para cada gene. Esquerda-cauda e valores atípicos direito de cauda foram determinadas usando o método de soma classificação [45]. pontuações discrepantes foram calculados tanto para-cauda direita e casos de esquerda-cauda, o que permitiu a definição de outliers que foram hypermethylated e hypomethylated em tumores, respectivamente [30, 45]. Dado que a análise outlier não tem um ponto de corte, um limiar foi selecionada para produzir cerca de 50 genes com maior pontuação. Este ponto de corte de 13,2 identificadas 37 principais candidatos para posterior validação (S4 Tabela).
Expression-metilação correlação.
Os dados de expressão gênica Normalizado foi correlacionada com os níveis de metilação do promotor em que os candidatos de metilação utilizando a correlação de Spearman (Tabela 1).
correlação e Concordância de DNA Detecção de metilação.
As correlações de sinais de metilação do DNA ZnF entre tecidos tumorais primárias e salivar lavagens (detectado pelo ensaio QMSP ) entre os pacientes com CECP da coorte de validação foram avaliadas através de coeficiente coeficiente e kappa de Spearman. Acordo de concordância foi calculada utilizando estatística kappa.
Sensibilidade e Especificidade quantificação.
Os valores QMSP metilação de amostras de saliva foram calculados usando um método de curva padrão e foram normalizados para um controlo de carregamento de DNA independente de metilação (
β-actina
). A metilação nível de cada gene foi tratado como uma variável binária (metilado versus não metilado) por dicotomização a metilação na detecção de zero a metilação de ADN por QMSP. Indivíduos com um diagnóstico de HNSCC foram definidos como “presença de doença”, ea “ausência de doença” temas foram definidos por controles normais. , verdadeiros taxas negativas, falso positivos verdadeiros positivos e falsos negativos foram então determinado para os genes individuais. Para a combinação de marcadores, o paciente foi classificado como “teste positivo”, se qualquer um dos marcadores foram positivos, e “teste negativo”, se todos os marcadores foram negativos. A sensibilidade foi estimada como a proporção de pacientes que estavam teste positivo entre aqueles com a doença, ea especificidade foi estimada como a proporção de pacientes que estavam teste negativo entre aqueles sem a doença. A confiança de 95% Intervalo (CI) para a sensibilidade e especificidade foi calculado assumindo distribuição binomial [46].
Resultados
Identificação de outliers de genes diferencialmente metilados
A partir do genoma-wide análise de metilação do DNA diferencial de 44 tumores primários e 25 controlos de tecido normal, os candidatos biomarcadores foram seleccionados com base no esquema mostrado na Figura 1. com base no número de amostras outlier e a intensidade de sinal relativa, 37 dos melhores candidatos de classificação foram escolhidos para posterior análise (Tabela S4). A correlação dos dados de expressão e de arrays de metilação permitidos para a descoberta de 24 genes candidatos (de 37 genes iniciais), com correlação negativa biologicamente relevante entre a metilação do DNA e a expressão do gene (Tabela 1). Notavelmente, todos os genes candidatos 24 mostrou hipermetilação e a diminuição da expressão em amostras de tumor. Além disso, todos os candidatos mostrou sinal de metilação de ADN mínima nos tecidos normais, com média máxima de β-valor para as amostras normais de 0,058, ou 6% de metilação (S1 e S5 Fig tabela). O t-teste padrão demonstraram que 23 dos 24 genes (96%) tinham diferença estatisticamente significativa na metilação do ADN entre as amostras normais e tumorais e todos entre as amostras normais e HPV-tumorais. Um gene,
CCND2
, não atingiu significância estatística com base em um t-teste, no entanto, este fez demonstrar uma diferença entre tumores e amostras normais por um teste exato de Fisher com base na presença de outliers hypermethylated em amostras de tumor.
contorno esquemático da abordagem integrativa utilizada neste estudo, que combina high-throughput screening de metilação do DNA e expressão gênica para a coorte descoberta de HNSCC: o emprego de dados de matriz de metilação do DNA com 27,578 sondas totais; normalização dos dados em R, 14.477 genes total; análise de outlier e cut-off para receber cerca de 50 genes principais (escore 13,2 outlier; 37 topo do ranking genes passados, consulte Métodos para detalhes); A integração dos dados normalizados a partir do ensaio de expressão (genes) 22,011; cálculos de coeficiente de correlação de Spearman (24 genes passados); 7 ZNFs validação seqüenciamento bissulfito; qRT-PCR, a expressão do gene de validação 5 ZNFs; Validação de 3 de detecção ZnF QMSP em amostras de saliva e de tumor em diferentes coortes.
O aumento da metilação e diminuição alterações de expressão gênica em pacientes HPV-
Sabe-se que o HPV + e HPV- casos CECP diferem em sua paisagem de alterações genéticas e epigenéticas [5, 12, 47, 48]. Ao separar 44 pacientes com CECP por estatuto de HPV, foi determinado que 92% (22 de 24) genes tinham significativamente maior metilação em HPV-HNSCC, em comparação a amostras normais (S5 tabela). Apenas 4% (1 de 24) candidatos tiveram a metilação do DNA em amostras de HPV + CECP significativamente maior em relação a amostras normais (S5 tabela). A maioria, 54% (13 de 24) genes tinham significativamente maior metilação em HPV-CECP, em comparação com HPV + amostras, de acordo com os dados publicados [12]. As amostras de tumor teve uma diminuição correspondente da expressão do gene candidato (S1 Fig e S6 Tabela). Assim, 71% (17 de 24) genes, demonstrou uma redução significativa na expressão de genes em todas as amostras CECP em comparação com amostras de indivíduos normais; 75% (18 de 24) genes mostrou uma diminuição significativa na expressão do gene em amostras de HPV-em comparação com amostras de indivíduos normais; e 21% (5 de 24) genes tinham diminuído significativamente a expressão de genes em amostras de HPV-comparado com HPV + amostras. A diminuição da expressão do gene em amostras de tumores foi consistente com o aumento da metilação do promotor global em amostras de tumores (Fig S1 e Tabela 1).
Validação da hipermetilação do promotor de genes candidatos
Para validar a metilação diferencial estado das ilhas de CpG perto da região do promotor de um dos 24 genes candidatos seleccionados, com bissulfito de sequenciação foi realizada em 5 amostras representativas das amostras de mucosas normais e 5 amostras de tumores primários HNSCC da coorte descoberta inicial. Dos 24 genes, 22 (92%) apresentaram aumento da metilação em tumores relativamente a amostras normais (Figura 2). Vinte genes candidatos (84%) apresentaram metilação em mais de 50% do tumor primário, incluindo
ADFP
,
FUZ,
ZNF71
,
ENPP5
,
ZNF211
,
e ZNF14
(Fig 2). dados de sequenciação de bissulfito fortemente correlacionado com os resultados a partir de dados de matriz, em que a metilação do DNA mínima foi detectada em amostras normais (Fig S1 e Figura 2).
resultados da sequenciação são mostrados na bissulfito de 5 amostras de tumor e 5 CECP tecidos normais da coorte descoberta original para os genes candidatos conseguir-top 24 (Tabela 1). caixas pretas sombreadas representam os promotores completamente metilados, caixas em cinza representam os promotores hemimethylated e caixas brancas representam os promotores não metiladas.
Zinco candidatos Dedo proteína
verificou-se que 7 dos 24 genes candidatos eram membros do grupo do zinco dedo proteína (ZnF), e uma análise adicional foi realizada neste grupo. A fim de elaborar sobre os candidatos ZnF, a metilação do DNA foi analisado em uma coorte de validação separada de 59 tumores e tecidos normais 31 (S2 tabela). Usando métodos de sequenciação bissulfito, aumento significativo de metilação do ADN por cinco dos genes foi detectado nesta coorte (S7 Tabela). No entanto, diminuição da metilação do DNA de
ZNF141
promotor na coorte de validação contradizia os dados de descoberta de coorte, e, sem a metilação do DNA foi detectado em
ZNF211
em amostras de coorte de validação. De todos os cinco genes de proteínas ZnF restantes,
ZNF14
,
ZNF160
,
ZNF71
,
ZNF420
e
ZNF585B
, a metilação do DNA foi significativamente superior nas amostras de tumor, em comparação com os controlos normais (Tabela S7).
ZnF regulação negativa está associada com o promotor metilação
para validar a hipótese de que a expressão de genes de proteínas individuais ZnF é afectada pela metilação dos seus promotores, a análise de qRT-PCR foi posteriormente realizada para
ZNF14
,
ZNF71
,
ZNF160
,
ZNF420
e
ZNF585B
expressão nas amostras a partir de uma coorte de validação independente (Fig S2). Todos mas
ZNF71
demonstrada a regulação negativa significativa de expressão em amostras de tumores em comparação com tecidos normais, o que foi consistente com o aumento dos níveis de metilação. Separação de amostras de tumores de acordo com o status do tumor HPV demonstraram que a expressão ZnF não foi significativamente diferente em HPV-e grupos de HPV + paciente (S2 figo e S7 tabela).
ZnF detecção de metilação do DNA é altamente específico para tecidos CECP primárias
com base nos resultados de metilação do DNA, foi formulada a hipótese de que ZnF metilação poderia potencialmente ser utilizada como um biomarcador clinicamente aplicável para HNSCC. Assim, iniciadores QMSP e ensaios com sondas foram projetados para
ZNF14
,
ZNF160
e
ZNF420
. Um ensaio QMSP altamente específico para
ZNF585B
não poderia ser concebido devido à sua elevada densidade de CpG.
Os ensaios foram validados QMSP primeiro para todos os três genes ZnF em amostras de tecido. Semelhante ao Bissulfito resultados de sequenciamento, os ensaios QMSP não detectar a metilação do DNA em todas as amostras normais, mas de metilação do DNA foi detectado em
ZNF14
,
ZNF160
e
ZND420
em 44,1% , 39% e 32,2% dos tumores, respectivamente. Pelo menos um ZnF foi metilada em 57,6% dos tecidos tumorais. (Mesa 2). Notavelmente, 17% dos doentes (10 de 59) tinha metilação detectados em todos os três promotores ZnF. taxas ligeiramente mais elevados de metilação do DNA foram observadas no grupo de HPV-, mas a diferença não foi estatisticamente significativa (Fig 3).
São mostrados ZnF QMSP resultados em 59 amostras de tumores e enxaguar salivar primários CECP em relação ao plasma normal e amostras de lavagem salivar da coorte de validação. ZnF metilação do promotor foi quantificada em relação ao BACT metilação e multiplicado por 100. Mais (+) ou menos (-) se refere a seu estado HPV dos pacientes com câncer. NS = amostra normal lavagem salivar (n = 35), N = tecidos primários normais (n = 31), TS = lavagem salivares de pacientes com CECP (n = 59, 41 de HPV + [TS +] e 18 do HPV-[TS-] ), T = amostras de tumores primários de pacientes com CECP (n = 59). Não houve metilação do DNA ZnF detectáveis em amostras normais. Significativa (p 0,05). Diferença entre os grupos é indicada por um asterisco (*), calculado pelo teste exato de Fisher
detecção de metilação do DNA ZnF em TCGA coorte
Para validar a metilação do DNA ZnF e sua correlação com a expressão em diferentes coortes CECP, os dados de matriz Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip e RNA-Seq foram baixados e analisados a partir de A coorte HNSCC Cancer Genome Atlas (TCGA), que contém 279 tumores CECP, incluindo 36 HPV +, com amostras normais correspondentes. metilação do DNA ZnF foi mínima em amostras normais TCGA (S3 figo e S10 Tabela), de acordo com os dados de identificação e coorte de validação. Todos os três ZNFs teve forte correlação negativa de metilação do DNA e expressão, especialmente
ZNF420
(S3 Fig). Notavelmente, fora de todas as sondas de metilação do DNA disponíveis a partir TCGA, sondas dentro
ZNF420
promotor teve a maior taxa de metilação do DNA em amostras de CECP com detecção de metilação mínima em amostras normais. No geral, observou-se uma alta concordância entre a descoberta, validação e coortes TCGA para a detecção de ZnF promotor metilação usando quatro diferentes técnicas para detecção de metilação do DNA (S9 Tabela).
ZnF detecção de metilação do DNA como biomarcadores potenciais CECP
para testar o desempenho de ensaios QMSP desenvolvidos para ZNFs para a detecção da metilação do DNA em fluidos corporais, combinados foram usadas amostras de enxaguamento salivares dos pacientes HNSCC coorte de validação. A comparação dos sinais de metilação do DNA em amostras de enxaguamento salivar de HNSCC e os pacientes não-cancerosas demonstraram que a especificidade do painel ZnF combinados para detectar HNSCC nestes fluidos corporais foi de 100% (95% CI: 89,9% – 100%), e o sensibilidade foi de 22% (95% CI: 12,3% – 34,73%) (Tabela 3). Notavelmente, a exploração de correlação de metilação ZnF com os dados clínicos por diferentes análises estatísticas não mostraram associações significativas.
Discussão
Apesar do desenvolvimento de tecnologias de alto rendimento ea identificação de promissora marcadores de metilação do DNA, ninguém biomarcador HNSCC atualmente tem sido aceite para a detecção e vigilância clínica. Uma das principais preocupações em biomarcadores CECP recentemente propostos é a alta taxa de falso-positivo. Como HNSCC é uma doença altamente heterogénea, é difícil de definir um único biomarcador com tanto alta sensibilidade e especificidade [10, 11, 25]. Muitos biomarcadores propostas têm sensibilidade razoável, mas relativamente baixa especificidade, e combinações destes biomarcadores provavelmente levaria a um aumento da taxa de falso-positivos [25]. Uso de métodos estatísticos convencionais podem subestimar alterações heterogêneas em malignidade; no entanto, esses desafios podem ser superados por meio de análise outlier desenvolvido recentemente adaptado a partir COPA. Para nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho publicado que utiliza a análise outlier para o desenvolvimento de metilação do DNA biomarcador. Enquanto o grupo ZnF de candidatos estudado neste trabalho desde 100% de especificidade, estudos adicionais podem aumentar a sensibilidade, validando genes candidatos mais metilados para o desenvolvimento de um painel à base de metilação do DNA multi-gene de biomarcadores CECP.
Há tamanhos de coorte uma série de publicações que utilizam análise de metilação do DNA de alto rendimento, porém muitos têm limitado [11-13]. Este estudo foi capaz de usar uma coorte publicado anteriormente constituído por 44 tumor e 25 controles normais para a descoberta de biomarcadores potenciais metilados. Além disso, os biomarcadores foram adicionalmente validado em uma coorte independente maior (com 59 amostras de tumores) e em TCGA (279 amostras tumorais). A utilização da matriz de metilação do DNA Ilumina 27, que tem sido utilizado com sucesso por outros [10-14], permitiram a definição de biomarcadores potenciais altamente específicos para HNSCC. No entanto, reconhece-se que as plataformas mais abrangentes de metilação do DNA pode permitir a descoberta de um grande número de alterações candidatos.
Correlação de metilação e de expressão é outra ferramenta poderosa que foi utilizado neste estudo para identificar mudanças de metilação biologicamente relevantes que provável ocorrer mais cedo no desenvolvimento do câncer [10, 14]. Apenas as alterações de metilação que ocorrem mais cedo no desenvolvimento do tumor vai permitir o desenvolvimento de alterações de expressão de genes subsequentes. mudanças de metilação do DNA que não se correlacionam com a expressão do gene foram eliminados para definir um painel mais focalizado de 24 candidatos biomarcadores de genes metilados. Além disso, a correlação de metilação do DNA com expressão a partir da matriz expressão do gene disponíveis ajuda a reduzir o viés plataforma única. Múltiplos passos de validação foram realizados neste estudo que incluiu um total de três grupos de amostras CECP, bem como quatro técnicas de detecção diferentes para a metilação do DNA (arrays Illumina 27 e 450, de sequenciação bissulfito e QMSP) e três técnicas diferentes para a expressão do gene (Affymetrix matriz, ARN-SEQ de TCGA e qRT-PCR). Resultados consistentes foram observadas entre os diferentes grupos e técnicas (S9 tabela). Essas etapas de validação confirmou elevada especificidade e confiabilidade dos biomarcadores à base de metilação do DNA ZnF detectados para CECP.
Foram observados níveis mais elevados de metilação do promotor de HPV-pacientes em vários genes supressores de tumor putativos incluindo membros da família dedo de zinco, consistente