Sumário

carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) é responsável por cerca de 90% de câncer de esôfago diagnosticado em países asiáticos, com a sua incidência em ascensão. células-tronco do câncer (CSC, também conhecidas como células iniciadoras de tumores, TIC) é inerentemente resistente à quimioterapia citotóxica e radioterapia e associados a um prognóstico ruim e falha terapêutica. Segmentação de terapia contra o cancro de células estaminais emergiu como uma abordagem terapêutica potencial para desenvolver regimes eficazes. No entanto, o marcador de CSC adequado CICAc para a identificação e a segmentação é ainda limitada. Neste estudo, nós analisamos os novos marcadores de proteína de membrana CSC usando duas características stemness distintos de linhas celulares de cancro através de uma abordagem comparativa. Após a validação de RT-PCR, qPCR e análises de Western blot, a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1) foi identificado como um potencial marcador de CSC CICAc. ICAM1 promove a migração de células de cancro, invasão, bem como o aumento da expressão do marcador mesenquimal e epitelial atenuar a expressão do marcador. Além disso, ICAM1 contribui para propriedades CSC, incluindo a formação de esfera, a resistência aos medicamentos, e tumorigênese no modelo de xenotransplante mouse. Com base na análise de proteínas reguladas-ICAM1, especulamos que regula ICAM1 propriedades CSC parcialmente através de uma via de ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1. Além disso, observou-se que ICAM1 e CD44 pode ter um efeito de compensação na manutenção das características de stemness CICAc, sugerindo que a combinação de terapias segmentação de vários deve estar sob consideração séria para adquirir um efeito terapêutico mais potente sobre CSC de CICAc.

Citation: Tsai ST, Wang PJ, Liou NJ, Lin PS, Chen CH, Chang WC (2015) ICAM1 é um marcador de haste do cancro celular Potencial de esôfago carcinoma espinocelular. PLoS ONE 10 (11): e0142834. doi: 10.1371 /journal.pone.0142834

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN

Recebido: 07 de setembro de 2015; Aceito: 27 de outubro de 2015; Publicação: 16 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tsai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan Grants NSC102-2320-B-039-050 e MOST 102-2911-I-002- 303. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de esôfago é o oitavo principal causa de doenças malignas em todo o mundo com a sua incidência em ascensão [1]. Ela representa 1% dos cânceres diagnosticados nos Estados Unidos, com um número estimado de 17.500 novos casos notificados em 2012 [2]. O câncer de esôfago é patologicamente classificados em dois subtipos principais, adenocarcinoma esofágico (EAC) e carcinoma de células escamosas do esôfago (ESCC). ESCC responde por cerca de 90% de câncer de esôfago diagnosticado em países asiáticos. Desde estratégias de detecção precoce não foram bem aplicados para a tela clínica, estes tumores são frequentemente diagnosticada em estágios avançados. Uma vez que a metástase ocorre, a mortalidade por câncer aumenta significativamente [3]. A taxa de sobrevida em 5 anos global após a ressecção cirúrgica é de 70% ~ 92% para pacientes sem envolvimento ganglionar, mas apenas 18% ~ 47% para pacientes com metástase ganglionar [4]. A falta de conhecimentos fundamentais sobre radiação e resistência à quimioterapia nestas células tumorais tem sido um grande obstáculo clínica para adquirir um melhor resultado. A limitada compreensão da biologia molecular dos tumores nos deixou com o empirismo na clínica

Cancro células-tronco. (CSC, também conhecido como célula de iniciação tumor, TIC) é definido como um subconjunto de células tumorais com a auto capacidade -renew e envolve na iniciação e progressão do câncer. CSC também é altamente resistente à radiação e quimioterapia e responsável pelo cancro da recaída depois do tratamento [5]. Portanto, a CSC tem sido visto como um alvo atraente para destrutivamente eliminar as células cancerosas. É importante identificar potenciais marcadores CSC que podem ser usados ​​para isolar e caracterizar os CSCs suas propriedades para ser terapeuticamente alvo. Embora CSC tem sido amplamente descoberta em tumores sólidos, incluindo cancro da mama, cólon, glioma, próstata, fígado, e melanoma [11/06], e vários marcadores para a sua identificação estão disponíveis, o marcador molecular para a CSC esofágica é muito limitada.

epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) é um processo de desenvolvimento essencial durante a formação de mesoderme e de formação do tubo neural, em que as células epiteliais adquirir um fenótipo mesenquimal migratório [12]. Os processos de invasão tumoral e metástase share muitas semelhanças fenotípicas de EMT, incluindo uma perda de adesão célula-célula e o aumento da mobilidade celular. A ligação entre a CSC e EMT foi estabelecido pela primeira vez no epitélio mamário transformado [13], e os resultados experimentais mostraram que EMT induzida por TGF foi associada com a aquisição de células de câncer de mama com CD44

+ /CD24

– /baixo fenótipo de iniciação do tumor, características mesenquimais, e aumento da capacidade de formar mammospheres. Recentemente, a prova adquiridos indicou que a CSC desempenha papéis importantes na metástase de vários tipos de carcinoma de [14,15]. Portanto, aumentar a nossa compreensão geral de biologia molecular do CSC provavelmente vai descobrir o papel da CSC na metástase de cancros.

Várias análises integradas, incluindo genômica, epigenomics, transcriptomics, e proteômica, foram recrutados para o estudo da biologia da CSC. Entre eles, proteômica detém uma posição única nesta área. Por exemplo, vários grandes avanços na investigação CSC deveram-se à identificação de proteínas utilizando abordagem proteômica como fatores estimuladores de colônias [16] e moléculas CD de superfície celular [17]. Além disso, proteômica está emergindo como uma poderosa ferramenta para identificar os complexos de sinalização que controlam a diferenciação CSC e regular as vias de manutenção CSC [18]. A abordagem proteômica sistemática para caracterizar as propriedades CSC irá lançar nova luz sobre CSC biologia e acelerar as aplicações clínicas no prognóstico, diagnóstico e terapia do cancro [19]

.

As proteínas da membrana, incluindo enzimas, receptores, canais iônicos, e transportadores, desempenhar muitas funções biológicas. A desregulação de proteínas de membrana tem sido associada a uma variedade de cancros humanos [20]. Portanto, muitas proteínas da membrana foram caracterizados como marcadores para objectivos de diagnóstico e terapêuticas, cerca de 70% dos alvos de drogas farmacêuticas existentes é a proteína de membrana [21]. Neste estudo, buscou-se identificar marcadores de superfície potenciais de CSC esôfago utilizando uma abordagem proteómica. As linhas celulares com vários CICAc capacidade formação esfera foram usadas para o rastreio de marcadores de superfície adequados. As propriedades CSC de potencial marcador foram ainda caracterizados utilizando ensaio de formação de colónia, ensaio resistente a medicamentos, e ensaio de tumorigenicidade em ratinhos imunodeficientes.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura celular

neste estudo, linhas de células de câncer de esôfago humanos foram adquiridos da coleção Bioresource e Centro de Pesquisa da Indústria Research Instituto de Alimentação e Desenvolvimento (Hsinchu, Taiwan; https://www.bcrc.firdi.org.tw/). As linhas celulares CE81T /VGH (CE81T; BCRC 60166) e CE146T /VGH (CE146T; BCRC 60167) foram derivados de 57- e 50-year-old homens de Taiwan, respectivamente. Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio mínimo de Eagle modificado por Dulbecco essencial (DMEM; Gibco BRL) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco BRL), 100 U /ml de penicilina, e 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco BRL), e mantida a 37 ° C em 5% de CO

2/95% de ar.

extracção de proteínas de membrana e em gel digestão

A extracção de proteína compartimental kits CNM (Biochain Institute) foi usado para extrair as proteínas de membrana de células cancerosas. O kit inclui CNM dois passos de extracção química: (1) a remoção de proteínas citoplasmáticas e nucleicos por tampão de reacção contendo HEPES, MgCl

2, KCl, sacarose, glicerol, e ortovanadato de sódio; (2) proteínas de membrana de extração de desoxicolato NP40 e sódio. Antes da análise espectrómetro de massa, as proteínas da membrana foram separadas por SDS-PAGE e dividido em dez fracções de gel, que foram então cortadas em pedaços de gel pequenas ( 1 mm

3) e sujeito a digestão em gel, individualmente. A in-gel procedimento de digestão inclui descoloração coomassie azul, redução do efeito de ligação dissulfeto, acrylation com iodoacetamida e digestão com tripsina, seguido nosso método descrito anteriormente [22].

Matrigel invasão e cicatrização de feridas ensaio

In vitro

invasão foi analisada utilizando (1 mg /ml; BD Biosciences) de Matrigel-revestido de membrana Transwell de PET inserir (BD Biosciences) em uma placa de 24 poços. As células cancerosas (1,5 × 10

5 células em 200 ul) foram suspensas em meio DMEM e adicionada à metade superior da câmara de inserção. meio DMEM suplementado com FBS a 10% foi adicionada como um quimioatractor para a metade inferior. Após incubação a 37 ° C durante 24 horas, as células cancerosas passados ​​através da inserção foram fixadas com formalina a 3,7% (Sigma-Aldrich) e coradas com 0,1% de violeta de cristal (Sigma-Aldrich).

Em vitro

migração foi analisada utilizando Ibidi Cultura-Insert (Ibidi). As células cancerosas (70μl; concentração: 7×10

5 células /ml) foram adicionados a Cultura-Inserir poço e cultivadas durante 24 h. Após a remoção da Cultura-Inserir, as células cancerígenas foram cultivadas durante 16 h. A distância de migração de células cancerosas foi gravado e medida usando imagem de software J.

Sphere formação de ensaio

ensaio de formação de Sphere foi realizada em seis centímetros placa de cultura revestido com 1% de agarose. As células cancerosas em suspensão em meio isento de soro foram semeadas a uma densidade de 5.000 células /prato e incubou-se durante 7 dias. Os números da esfera primária foram contadas manualmente no 7º dia sob o microscópio. Para o ensaio de esfera secundário, esferas de cultura primária foram recolhidas e incubadas com tripsina à temperatura ambiente durante 10 min. células tripsinizadas das esferas foram passados ​​através de 26 agulha G três vezes. As células dissociadas foram colocadas individualmente a 5000 células /prato de densidade em 6 centímetros prato de cultura durante 7 dias. Os números da esfera secundária foram contadas no 7º dia.

ensaio de tumorigenicidade em modelo de rato deficiente imunológico

O procedimento de animais (102-97-N) foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal (IACUC) na China Medical University Hospital (Taichung, Taiwan). Várias doses de células CE146T (10

2, 10

3, e 10

4) foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos NOD-SCID macho de 5 semanas de idade, para gerar tumores. flanco esquerdo foi injectado com grupo de células cancerosas controle e flanco direito foi injectado com o grupo experimental. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um compasso de medição quando os tumores se tornaram visíveis, e a duração da observação foi de oito semanas. O volume do tumor foi calculado pela fórmula: (comprimento x largura

2) /2

análise espectrômetro de massa

análise espectrômetro de massa foi realizada utilizando o ion trap-linear transformada de Fourier cíclotron de íons. espectrómetro de massa de ressonância (LTQ-FTICR MS; Thermo Fisher) equipado com uma fonte iónica de electropulverização de nano-(New Objective) e um sistema de nano-HPLC. separação nano-HPLC utilizado um nano-coluna reverso (75 pM Dl x 200 mm) empacotada com resina mágica C18AQ (tamanho de partícula 5 um, tamanho do poro 200 A °; Michrom Bioresources) e uma bomba de HPLC binário Agilent 1100 Series (Agilent Technologies) . O programa analítico foi fixado em um gradiente linear de 10% a 50% de ACN com um ciclo de funcionamento de 60 minutos. A verificação levantamento de MS análise (

m /z

320-2,000) foi realizada em LTQ-FTICR MS com uma resolução em massa de 100.000 em

m /z

400. Top ten multiplicam mais abundante íons carregados foram sequencialmente isolado por MS /MS pelo LTQ. Os dados resultantes foram aplicados ao software MaxQuant [23] para a identificação das proteínas. quantificação livre-label precisa foi realizada utilizando o programa MaxLFQ pela normalização e métodos de extração relação peptídeo máximas [24]. O limite de significância para a identificação foi definido como

P Art .01.

Estatísticas

Os dados foram expressos em média ± SD. O significado da diferença foi examinada pelo estudante de

t

-test (bicaudal).

P Art 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

CE146T tem características potenciais e stemness mais metastáticos do que CE81T

Para escolher célula alvo adequado para identificação de novos marcadores CSC, primeiro caracterizadas as propriedades metastáticas tais como migração e invasão e capacidade de formação de esfera de esôfago de células escamosas câncer linhas CE81T e CE146T. Os resultados mostraram que CE146T tem capacidades migração e invasão notavelmente mais elevados do que CE81T (Figura 1A e 1B), o qual foi identificado como uma célula de cancro bem diferenciado. Além disso, também CE146T tem maior capacidade de formação de esfera CE81T (Fig 1C). Estudos recentes demonstraram que a CSC de ESCC expressa altos níveis de CD44 [25,26]. Por conseguinte, utilizou-se citometria de fluxo para analisar a expressão de CD44 em CE146T e CE81T. O resultado mostrou que CE146T tem níveis mais elevados de CD44 do que CE81T (Figura 1D). Tomados em conjunto, estes dados indicam que CE146T tem mais população CSC e exibe mais propriedades CSC que CE81T, o que implica que somos capazes de identificar marcadores CSC, comparando as alterações proteômicas de CE146T e CE81T.

(A) Wound- cura ensaio. CE81T e CE146T foram cultivadas na Ibidi Cultura-Insert bem, e as imagens de migração de células cancerosas foram registrados em 0 H. (remoção de Cultura-Insert) e 16hr. distância de migração foi medida usando imagem de software ensaio de invasão J. (B) Matrigel. fotografias representativas contêm invadiram cancelar células que foram coradas com violeta de cristal. ensaio de formação (C) Sphere. Vários tamanhos de esferas em CE81T CE146T e foram contadas no dia 7. As experiências foram realizadas em triplicado (média ± DP). (D) a expressão de CD44 em CE81T e CE146T foi medida por citometria de fluxo.

Identificação de marcadores CSC usando uma membrana comparativa abordagem proteômica

proteína da membrana tem a vantagem na aplicação de diagnóstico e terapêutica . Assim, foi utilizada uma análise proteômica membrana comparativa para identificar os novos marcadores CSC de CE146T e CE81T. Embora CE146T e CE81T não são isogênico, CE146T pode expressar níveis mais elevados de proteínas associadas com propriedades CSC que CE81T com base em observações acima. Na análise por MS, duas repetições técnicas foram realizadas para cada amostra. identificação de proteínas e quantificação livre-label de sinais de massa foram analisados ​​utilizando o software MaxQuant [23]. Nesta análise, foram identificadas proteínas totais 652 de membrana, que incluiu 266 proteínas da membrana plasmática com base na definição Gene Ontology. Entre as proteínas de membrana, proteínas totais 13 apresentaram expressão específica ou mais do que um aumento de 50 vezes da expressão em comparação com CE146T CE81T (Tabela 1).

Para validar os resultados de MS, foi utilizado RT-PCR, PCR quantitativo (qPCR) e western blot para examinar os níveis de expressão gênica e protéica de proteínas candidatas, exceto dois antígenos de histocompatibilidade. qPCR resultados de RT-PCR e mostram que a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1) e prominin-2 (PROM2) ter uma maior expressão de genes em CE146T que em CE81T, o que é consistente com a constatação de proteómica (Fig 2A e 2B). Western blot mostrou que ICAM1 tem uma expressão elevada em CE146T, mas não PROM2 (Fig 2C). Assim, avaliou-se ainda mais o carácter de ICAM1 sobre as propriedades de CSC CICAc.

(A) Os níveis de ARNm de proteínas alvo foram analisados ​​por meio de ensaio de RT-PCR. GAPDH serviu como controle. (B) Os níveis de ARNm de proteínas alvo foram analisados ​​utilizando o ensaio de qPCR. Os níveis de proteína de ambos PROM2 ICAM1 e (C) foram analisadas utilizando um ensaio de Western Blot. β-actina serviu como controle de carga.

ICAM1 aumenta potencial metastático das células cancerosas

Para avaliar as funções de ICAM1 em propriedades CSC, foi utilizado o vector lentiviral expressar curto-specific ICAM1 hairpin RNA (shRNA) para derrubar expressão ICAM1. Dois tipos de ICAM1 shRNA foram transfectados em CE146T (rotulado como shICAM1 # 1 e # 2 shICAM1), ambas as células transfectadas mostraram knockdown óbvia de ICAM1 no ensaio de transferência de Western (Fig 3A). ICAM1 knockdown não teve efeito no crescimento de células de CE146T (Figura 3B), mas reduziu significativamente a migração celular e invasão de habilidades CE146T na cicatrização de feridas e Transwell ensaios, respectivamente (Figura 3C e 3D). Além disso, dois inibidores farmacológicos ICAM1, silibinin [27] e 18 ácido beta-glycyrrhetinic (18β-GA) [28], exibido efeito semelhante na redução das capacidades de migração e invasão de CE146T (Fig 3C e 3D). Os resultados indicaram que ICAM1 contribui para CE146T propriedades metastáticas

in vitro

. Portanto, nós ainda determinado se ICAM1 knockdown afeta os níveis de marcadores de EMT de expressão. resultado de Western blot mostrou que tanto shRNA e inibição farmacológica pode aumentar os níveis de marcador epitelial, tais como ZO-1 e atenuar os níveis de marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina e fibronectina (Figura 3E).

(A) expressão ICAM1 foi derrubado usando dois tipos de shRNA, shRNA Nº 1 sequência alvo é: GCCCGAGCTCAAGTGTCTAAA e shRNA # 2 sequência alvo é: CCTCAGCACGTACCTCTATAA. (B) o crescimento celular de CE146T foi analisado utilizando o ensaio de MTT. ICAM1 knockdown não afectou significativamente o crescimento das células CE146T. CE146T-shGFP serviu como controle. Os efeitos de ICAM1 knockdown sobre a capacidade de migração celular e invasão foram analisados ​​utilizando (C) de cicatrização de feridas e (D) Os ensaios de invasão de matrigel, respectivamente. Ambas as experiências foram realizadas em triplicado (média ± DP). (E) A expressão dos marcadores de EMT foi determinada utilizando um ensaio de Western Blot. CE146T foi tratado com silibinin inibidor ICAM1 (2¼m) ou 18β-GA (10 �) durante 24 horas. As expressões de marcador epitelial ZO-1 e marcadores mesenquimais N-caderina e fibronectina foram examinadas utilizando anticorpos específicos. β-actina serviu como controle de carga.

ICAM1 aumenta a formação de esfera e resistência aos medicamentos

CSC tem sido conhecido para aumentar a capacidade de formação de esfera e expressar altamente resistente à radiação e quimioterapia. Para carácter as funções de ICAM1 sobre a formação de esfera, que comparou a capacidade de formação de esfera entre shICAM1 # 1 e # 2 e shICAM1 seu grupo de controle shGFP de CE146T. O resultado indicou que ICAM1 knockdown reduz significativamente a capacidade de formação de esfera CE146Y, não importa em número esfera ou no tamanho esfera (Figura 4A). Além disso, também reduziu significativamente a formação secundária de esfera CE146T (Fig 4B).

Os ensaios de (a) formação de esfera primária e (B) formação de esfera secundária foram realizadas em CE146T com ou sem ICAM1 knockdown. número e tamanho Sphere foram observados e contados de principal em 7 de cultura dia. Análise (C) A resistência aos medicamentos. CE146T-shGFP e ICAM1-shICAM1 # 1 foram tratadas com várias doses de cisplatina durante 24 horas, e a viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT. Cada experiência foi realizada em triplicado (média ± DP).

A cisplatina é um agente citotóxico comumente utilizados na quimioterapia de cancro do esófago, ao passo que a cisplatina tem também um efeito clinicamente importante radio-sensibilizador que faz com que a terapia de combinação possível [29]. Para avaliar as funções de ICAM1 sobre a resistência à cisplatina, nós tratamos CE146T com várias doses de cisplatina e determinada a viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT. O resultado mostrou que ICAM1 knockdown reduz a capacidade de resistência à cisplatina de CE146T, e IC

50 de CE146T no grupo de controlo (shGFP) e grupo knockdown ICAM1 (shICA1 # 1) são 5