Abstract
Relatórios recentes sugerem que fatores múltiplos como a genética do hospedeiro, meio ambiente e dieta pode promover a progressão da mucosa saudável em relação carcinoma colorretal esporádico. Evidências acumuladas tem, adicionalmente, associado bactérias intestinais com a iniciação e progressão da doença. De modo a examinar e analisar a composição da flora intestinal na ausência de influências de confusão, nós estabelecemos um modelo animal de 1, 2-dimetil-hidrazina (DMH) induzida por cancro do cólon. Utilizando este modelo, realizamos pyrosequencing da região V3 dos genes de rRNA 16S neste estudo para determinar a diversidade e a amplitude das espécies microbianas intestinais. Nossos resultados indicam que a composição microbiana do lúmen intestinal difere significativamente entre os grupos controle e tumorais. A abundância de Firmicutes foi elevado ao passo que a abundância de Bacteroides e espiroquetas foi reduzida no lúmen de ratos CRC. Fusobactérias não foi detectada em nenhum dos ratos saudáveis e não houve diferença significativa em espécies Proteobacteria observadas quando se comparam as comunidades bacterianas entre os dois grupos. Curiosamente, a abundância de Proteobacteria foi maior nos ratos CRC. Ao nível de gênero,
Bacteroides
exibiram uma abundância relativamente mais elevado em ratos CRC em relação aos controles (14,92% vs. 9,22%,
p Art 0,001). Enquanto isso,
Prevotella
(55,22% vs. 26,19%),
Lactobacillus
(3,71% vs. 2,32%) e
Treponema
(3,04% vs. 2,43%), foram encontrados para ser significativamente mais abundante em ratos saudáveis do que os ratos de CRC (
P
0,001, respectivamente). Nós também demonstram uma redução significativa de bactérias produtoras de butirato como
Roseburia
e
Eubacterium
na microbiota intestinal de ratos CRC. Além disso, um aumento significativo no
Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae
e
Fusobacterium
foi também observada no grupo tumor. Uma diminuição em espécies probióticas, tais como
Ruminococcus
e
Lactobacillus
foi igualmente observada no grupo de tumores. Colectivamente, podemos concluir que uma diferença significativa na flora bacteriana intestinal existe entre ratos saudáveis e ratos CRC
Citation:. Zhu Q, Jin Z, Wu W, Gao R, Guo B, Gao Z, et al. (2014) Análise da Intestinal Lumen Microbiota em um modelo animal do cancro colorectal. PLoS ONE 9 (3): e90849. doi: 10.1371 /journal.pone.0090849
editor: Georgina L. Segure, University of Aberdeen, Reino Unido
Recebido: 10 de dezembro de 2013; Aceito: 30 de janeiro de 2014; Publicação: 06 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Nature Science Foundation da China (No. 81.230.057). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Cada ano, cerca de 1,2 milhões de pessoas são diagnosticadas com cancro colorectal (CRC) em todo o mundo [1]. CRC é o terceiro câncer mais comum em homens eo segundo mais comum em mulheres com a maioria dos casos que ocorrem no mundo desenvolvido. Existe uma comunidade celular complexa dentro de um tumor maligno. Esta comunidade foi constituída por células oncogenicamente transformadas, células não neoplásicas, tais como células do estroma e do sistema imunológico, e micróbios tais como bactérias e vírus, em alguns casos [2]. Muitos tipos de câncer estão associados a agentes infecciosos e estes cancros tendem a ocorrer em tecidos da mucosa que têm exposição de alto nível para os micróbios. Alguns acreditam que até um quinto de todos os cânceres são causados ou promovidos por agentes infecciosos [3]. Por exemplo, o cancro do colo do útero e cancros gástricos podem ser causadas por vírus de papiloma humanos e a bactéria,
Helicobacter pylori
, respectivamente [4].
é avaliada-se que o número total de células de diferentes espécies de bactérias no tracto gastrointestinal dos seres humanos é de 10
14, que é mais de 10 vezes o número de células eucarióticas humanos [5], e talvez tantos como 10 vezes mais vírus. Em um intestino saudável, a flora bacteriana normal mantém a homeostase com o host [6]. No entanto, alterações nas populações bacterianas e seus produtos metabólicos têm sido associadas a várias doenças, incluindo a colite ulcerativa, doença de Crohn e CRC [7] – [9]. E existem relatórios crescentes de que a flora intestinal desempenha um papel importante no desenvolvimento da carcinogénese do cólon [10]. Por exemplo, em estudos de modelos animais, os ratinhos mutantes que são geneticamente susceptíveis a CRC foram encontrados para desenvolver significativamente menos tumores quando mantidas em ambientes isentos de germes [11]. Wei e seus colegas determinaram a estrutura mudanças de microbiota intestinal de ratos em desenvolvimento lesões da mucosa pré-cancerosas induzidas pela substância cancerígena tratamento DMH, e demonstrou que a abundância de
Ruminococcus
-como e
Allobaculum
-como bactérias eram aumento nas fezes de ratos tratados com DMH [12]. Moore e colegas de trabalho também informou que 15 espécies bacterianas de flora fecal humana foram significativamente associados com um risco elevado de câncer de cólon e 5 foram associados com baixo risco de cancro do cólon [13]. Além disso, Bacteroides e Bifidobacterium foram mais fortemente associados com risco aumentado em seu estudo com indivíduos caucasianos, japoneses, havaiana e pacientes africanos. Estes estudos preliminarmente demonstrou que havia uma relação estreita entre a microbiota intestinal e no desenvolvimento de CRC [13]. No entanto, não há espécies bacterianas individuais transparentes foram identificados como factores de risco para CRC porque cerca de 80% das bactérias humanos foram consideradas incultivável [14]. Para ultrapassar este problema e investigar a diversidade microbiana, os pesquisadores se voltaram para o campo da metagenômica [15]. Em 2011, havia quatro mapas de alta resolução referentes à associação entre disbiose cólon humano e CRC surgiu em sucessão, que relatado por três grupos independentes [2], [8], [16], e várias espécies de bactérias foram encontrados para ser preferencialmente habitam tanto tecidos tumorais ou tecidos circundantes não tumorais. O enriquecimento de
Fusobacterium spp.
Nas amostras de tumor era surpreendentemente similar com esses microbiomes CRC documentados. Em particular, um isolado de Fusobactérias (CC53), foi demonstrada para ter em invasividade (2-Caco) células cultivadas [16] do cólon Adenocarcinoma-2. Estes estudos também relataram uma abundância relativa de
Bacteroidaceae
,
Streptococcaceae
,
Fusobacteriaceae
,
Peptostreptococcaceae
,
Veillonellaceae
, e
Pasteurellaceae
em tecidos cancerosos em comparação com o lúmen intestinal normais [17]. Além disso, a fim de estabelecer disbiose relacionada com o cancro colorectal, Sobhani
et al
. investigou a microbiota fezes de pacientes com câncer de cólon normal e usando pyrosequencing e subsequente análise de componentes principais (PCA) [18]. E eles detectaram uma mudança de composição na microbiota intestinal de pacientes com CCR. Em particular,
Bacteroides
e
Prevotella
espécies foram encontradas para ser mais abundante em pacientes com câncer do que nos indivíduos controle. Tomados em conjunto, estes estudos demonstraram que a microbiota intestinal pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de CRC
hospedeiras genética, meio ambiente e da dieta tem um efeito dramático sobre a microbiota série de indivíduos de diferentes países [19] -. [20 ]. Portanto, podemos observar que existe variação na composição da flora intestinal levando a associação clínica entre a infecção bacteriana e CRC. Neste estudo nós estabelecemos um modelo animal de 1,2-dimetil-hidrazina (DMH) cancro do cólon induzida e realizou pyrosequencing de genes 16S rRNA para comparar a microbiota no lúmen intestinal de ratos CRC e controles saudáveis. Temos adicionalmente identificados filotipos bacterianas que podem servir como potenciais biomarcadores no desenvolvimento CRC.
Materiais e Métodos
Animais e Reagentes
Quatro semanas de idade ratos Wistar machos (180 -200 g), adquirido a partir de Xangai Guincho animal Laboratory Corporation (Xangai, China) foram utilizados para este estudo. Todos os animais foram alojados em gaiolas de plástico (com quatro ou cinco ratos /gaiola) em condições controladas de humidade (44 ± 5%), a luz (12 h de luz /ciclo escuro) e temperatura (22 ± 2 ° C). 1, 2-dimetil-hidrazina (DMH) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). DMH foi preparada antes da utilização em 1 mM EDTA-salina e pH ajustado para 7,0 usando NaOH diluído solução.
Procedimentos Experimentais
Quarenta 4 semanas de idade ratos Wistar machos foram divididos em dois grupos : um grupo-tumoral induzida DMH (GT, n = 30) e um grupo-tumoral induzida não-DMH (grupo de controlo, GC, n = 10). Os animais foram aclimatados à dieta de roedores e água
ad libitum Compra de 1 semana. Depois da aclimatação, os ratos de TG foram intraperitonealmente (i.p.) injectados com DMH (40 mg /kg) uma vez por semana durante 10 semanas consecutivas. Os 10 ratos remanescentes foram injectados por via intraperitoneal com EDTA – solução salina normal como controlos. Os pesos dos animais foram registados uma vez por semana durante todo o período experimental. Começando na semana 12 do protocolo, três ratos foram sacrificados a cada 2 semanas, a fim de examinar a formação de tumores do cólon. Os animais foram anestesiados com Cetamina 100 mg /Kg e Xilazina 15 mg /kg de peso corporal por via i.p. sob condições assépticas. todo o cólon foi cirurgicamente removido e aberto longitudinalmente. Amostras de fezes foram recolhidas e imediatamente congeladas em azoto líquido. As amostras de fezes foram posteriormente transferidas para -80 ° C até à extracção de ADN foi realizada. O cólon foi fotografado e o número total de tumores foi contado. Para exame histológico, os tumores do cólon foram excisadas e fixadas em formalina a 10% tamponada com fosfato neutro separadamente.
exame histológico
para exame histológico, os tecidos fixados foram embebidos e seccionados a 5 mm intervalos. O tecido foi corado com hematoxilina padrão e eosina para exame microscópico de luz. As secções de tecido foram revisados por dois patologistas independentes de uma forma cega. Qualquer discrepância entre estes dois investigadores foi resolvido através da reavaliação pela terceira patologista até consenso de opinião foi alcançado.
bacteriana DNA Extraction
Os ácidos nucleicos foram extraídos de cada um amostras de fezes usando um método modificado de as orientações do fabricante para o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A quantidade de DNA foi determinada pela Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, EUA). Integridade e tamanho de ADN foi determinado por 1% (w /v) de electroforese em gel de agarose. Todas as amostras de ADN foram armazenados a -20 ° C até à sua utilização. Tubos contendo apenas os Stool Mini controles de extração de DNA Kit QIAamp foram incluídos em todas as etapas de lise e PCR para servir como controles negativos
PCR e 454 pyrosequencing
Os seguintes 16S universais primers de RNA ribossomal:. ( 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘, 533R: 5′- TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) correspondem às posições V3 do gene de rRNA 16S, com uma sequência de amostras de código de barras e os adaptadores FLX Tianium foram utilizados para amplificar a região V3 de cada amostra fecal através da reacção em cadeia da polimerase. A PCR foi realizada com o modelo de 10 ng, 0,4 ul FastPfu Polimerase (transgen Biotech, China), 4 uL 5 x tampão FastPfu, 2 de dNTPs ul (2,5 mM cada, Takara Bio, Japão), 0,4 ul iniciadores directos (5 uM) e 0,4 ul iniciadores (5 ^ M) num ABI GeneAmp® 9700 reciclador reversa. Os parâmetros dos ciclos foram como se segue: 5 min de desnaturação a 95 ° C seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 95 ° C (desnaturação), 30 segundos de emparelhamento a 55 ° C e 30 segundos a 72 ° C (elongação), com uma extensão final a 72 ° C durante 5 min. reacções de PCR foram realizadas em triplicado em cada amostra. Os produtos amplificados a partir de amostras de fezes foram verificados por electroforese em gel utilizando 5 uL da mistura de reacção de PCR num gel de agarose a 2,0%. Os produtos de PCR foram purificados usando o kit de extracção de Gel AxyPrepDNA (Axygen, EUA) e quantificada no QuantiFluor ™ -ST Fluorómetro (Promega, EUA). Os produtos de diferentes amostras foram misturadas em proporções iguais para pirossequenciao utilizando o Roche GS FLX 454 sequenciador de acordo com as instruções do fabricante.
Todos pyrosequencing lê foram então removidos dos seus iniciadores, códigos de barras, e sequências de adaptador, e adicionalmente rastreados e filtrou-se de acordo com as normas de controlo de qualidade tal como se segue: a eliminação de sequências que não coincidam exactamente com as proximal iniciador de PCR (mais de dois desemparelhamentos relativamente às sequências iniciadoras), aqueles com comprimento curto de sequenciação (menos do que 200 nt) sequências que continham repetições mononucleotídicos de 6 nt, sequências com personagens ambíguos, ou sequências com a qualidade da leitura de marcar 25. Finalmente, um total de 197,911 sequências de alta qualidade a partir de vinte amostras foram produzidas, que respondeu por 62,9% das sequências válidas de acordo com a filtragem barcode- e primer de seqüência.
análise bioinformática de Sequenciamento de dados
As sequências foram alinhadas usando banco de dados SILVA (https://www.arb-silva.de/), e delimitação de unidades taxonômicas operacionais (Otus) foi realizado com Mothur a 97% de corte de acordo com suas distâncias entre pares. Em seguida, foi realizada a análise da cobertura do Bom, diversidade estimadores (Shannon e Simpson), estimadores de riqueza (Chao1 e ACE), e curva de rarefação usando o pacote de software Mothur (https://www.mothur.org/wiki/Main_Page) a o nível de confiança de 80% [21]. O mapa de calor foi construído em informações género com a função heatmap 2 em pacote de R vegan. Além disso, as semelhanças Bray-Curtis foram utilizados para construir um dendrograma cluster. Também realizamos a análise métricas de distância não ponderada Unifrac usando OTUs de cada amostra, e realizada a análise de componentes principais em termos da matriz de distância. Uma abordagem descoberta de biomarcadores metagenomic foi empregado com lefse [análise discriminante linear (LDA) juntamente com a medição do tamanho do efeito] que realizou um teste de soma-rank não paramétrico de Wilcoxon seguido de análise LDA usando software online (https://huttenhower.sph.harvard.edu /Galaxy /) para avaliar o tamanho do efeito de cada taxon diferencialmente abundante [22].
Análise estatística
o
t
-teste e teste de Mann-Whitney foram realizadas utilizando SPSS versão 19.0 para Windows.
Ética Declaração
o protocolo experimental foi analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal e do Comitê de Ética do Hospital Filiado do Sexto Pessoas a Shanghai Jiao Tong University.
Acesso a dados
as informações sequência 16S gerado neste estudo foi submetido ao NCBI Sequence Leia Arquivo sob o número de SRA098098.
resultados
animal modelos e formação de tumor
de acordo com o protocolo experimental (Figura 1A), nós sacrificados três ratos tratados com DMH a cada duas semanas começando na 12ª semana. Adenoma foi encontrado pela primeira vez na 12ª semana em um dos três animais sacrificados. A maioria dos adenomas, no entanto, foram encontrados entre 14 e 18 semanas (7/9). Infelizmente, dois ratos tratados com DMH morreu na semana 19 de obstrução de cólon e caquexia. Nas amostras da 20ª semana, descobrimos que dois ratos demonstraram adenocarcinoma (2/3) com ocasionalmente adenoma dentro do tecido. Como um resultado, nós decidimos sacrificar o restante dos ratos tratados com DMH, bem como aqueles que pertencem ao grupo de controlo, na semana 22, a fim de manter o ciclo de vida dos ratos em concordância. Na necropsia, encontramos patologicamente confirmada adenocarcinoma de cólon induzida com sucesso em onze ratos tratados com DMH (11/13), sem evidência de metástase órgão. Os dois ratos remanescentes não exibiu sinais de formação de tumores. No entanto, um dos animais foi encontrada para ter uma obstrução cólon incompleta, por conseguinte, apenas dez ratos tratados com DMH foram incluídos no nosso grupo de estudo final. Enquanto isso, todos os ratos do grupo de controlo sobreviveu ao 22 semanas. O peso corporal médio nos dez ratos tratados com DMH selecionados foi 343,5 ± 10,74 g e 359,3 ± 7,61 g nos animais controle, sem significância estatística (
p
= 0,59). Detalhes de tumores induzidos por DMH estão resumidos na Tabela 1 e mostrada na Figura 1B-G.
Procedimentos experimentais
(A). (B) de cólon normal. (C) Adenoma (seta branca). (D) Adencarcinoma (seta amarela). A mancha de sangue em torno do tumor foi causado por úlcera do tumor, em vez de a dissecção. fotomicrografias representativas que mostram a mucosa normal (E), adenoma (F) e adenocarcinoma (G) foram ampliados em 40 × (à esquerda), e cada um dos micrografia direita (400x) destacou o distrito do retângulo verde correspondente.
Características de 454 pirossequencia�o
No total, 314,880 sequências válidos foram obtidos a partir de todas as 20 amostras, com uma média de 15,744 sequências por amostra. As sequências resultantes foram processados usando Seqcln (https://sourceforge.net/projects/seqclean/) e Mothor [23]. Depois de remover as sequências de baixa qualidade ( Q25) e as sequências mais curtas do que 200 pb, com homopolímeros de mais tempo do que seis nucleótidos, e contendo ligações de base ambíguas ou sequências iniciadoras incorrectas, um total de 197,911 sequências de alta qualidade foram produzidos com um comprimento médio de 481 bp por sequência. As sequências foram alinhadas contra o banco de dados silva (SSU111 versão: https://www.arb-silva.de/) usando k-mer busca (https://www.mothur.org/wiki/Align.seqs). Potencialmente sequências quiméricas foram detectados utilizando UCHIME (https://drive5.com/uchime) e removido. Os restantes leituras foram pré-agrupado (https://www.mothur.org/wiki/Pre.cluster) e, em seguida, agrupados usando o algoritmo de pares não corrigido. As características detalhadas de cada amostra encontram-se na Tabela 2. Além disso, as unidades operacionais taxonómicos foram definidos como a partilha 97% de identidade de sequência utilizando o método de vizinho mais longe (https://www.mothur.org/wiki/Cluster). O número total de OTUs a nível de similaridade de 97% foi 41.923, com uma média de 2.096 OTUs por amostra.
O valor médio de cobertura é bom para cada grupo foi de mais de 80%, indicando que o 16S rRNA sequências identificadas nos dois grupos representam a maioria das bactérias presentes nas amostras de estudo. Considerando que não respeitou o patamar da curva de refração (Figura S1A) com o seqüenciamento atual, as estimativas de diversidade de Shannon de todas as amostras já havia atingido valores estáveis a essa profundidade sequenciamento, o que sugere que, embora a identificação de novos filotipos seria esperado a partir da sequenciação adicional, a gama de diversidade dentro das amostras tinha sido capturado (Figura S1B, C, D). Diferenças estatisticamente significativas foram observadas nos índices de Shannon entre o grupo de tumor e grupo controle (5,92 ± 0,30 vs 6,17 ± 0,20,
p
= 0,042, Figura S1E). As diferenças demonstram que a maior diversidade poderia ser encontrado no lúmen intestinal não cancerosas de ratos do grupo de controlo que é confirmado por Simpson índice de diversidade (0,024 ± 0,013 vs. 0,013 ± 0,007,
p
= 0,037, Figura S1F). Os estimadores de riqueza de comunidade (Chao1 e Ace) e características detalhadas de cada amostra são apresentados na Tabela S1.
Comparação de microbiota intestinal entre o Grupo Controle e Tumor Grupo
A microflora e composições de dois os grupos foram analisadas e comparadas com a abundância relativa de UTOs usando a matriz não ponderada distância Unifrac para cada grupo. resultados subsequentes do PCA exibiu que houve diferença significativa na composição da comunidade bacteriana entre os ratos saudáveis e ratos CRC usando os primeiros dois principais escores dos componentes de PC1 e PC2 (31.32% e 20,4% da variância explicada, respectivamente) (Figura 2). Além disso, lefse foi realizada para se obter a representação cladogram e as bactérias predominantes da microbiota dentro dos dois grupos, o qual é mostrado na Figura 3A. Nós também mostraram as maiores diferenças de taxa entre as duas comunidades na Figura 3B.
Peptostreptococcaceae
,
Erysipelotrichales
,
Coriobacteriaceae
e
Porphyromonadaceae
foram enriquecidos em ratos CRC, enquanto que
Roseburia
e
Prevotella
foram enriquecidas em ratos saudáveis, todos os quais foram filotipos chave envolvidos na segregação da microbiota intestinal em ratos saudáveis e CDC, de acordo com a análise lefse.
Cada símbolo representa uma amostra. círculos vermelhos representam ratos saudáveis; círculos azuis representam ratos CRC.
(A) representação taxonômica de estatística e biologicamente diferenças consistentes entre ratos saudáveis e ratos CRC. As diferenças são representados pela cor da classe mais abundante (vermelha indicando grupo de controlo, o grupo do tumor verde e amarelo não significativa). O diâmetro do diâmetro de cada círculo é proporcional à abundância do taxon. (B) Histograma das pontuações LDA para gêneros diferencialmente abundante. Cladogram foi calculada pela lefse, e exibidas de acordo com o tamanho do efeito.
Comparações de microbiota intestinal a diferentes níveis entre ratos saudáveis e ratos CRC
Foram estudadas as comunidades de bactérias nas fezes do lúmen intestinal de ratos com ou sem CRC. Os diferentes géneros filos e foram avaliados pela designação taxonómica de todas as sequências e a composição microbiana global de cada grupo ao nível filo é mostrado na Figura 4A, B. De acordo com os resultados taxonómicos, demonstramos que Bacteroides, representando 79,26% e 63,95 % da microbiota intestinal em indivíduos saudáveis e CRC ratos, respectivamente, foi o filo mais predominante em nosso estudo. E Firmicutes eram do filo secundária com a proporção de 15,14% e 29,55%, respectivamente. Finalmente, espiroquetas e Proteobacteria constituída a terceira filos mais abundante, contribuindo 3,04% e 1,06% em ratos saudáveis, e 2,44% e 2,95% em ratos de CRC, respectivamente. A composição de filos dominante é mostrada na Tabela S2. Nós descobrimos que a composição microbiana mostra elevada variabilidade inter-individual (Figura 4C). Firmicutes representaram 3,39% -48,35%, e Bacteroides 43,24% -95,79% em todos os animais individuais (Tabela 3). Só que, a abundância de Bacteroidetes e cianobactérias foram maiores na microbiota intestinal de ratos saudáveis do que em ratos CRC, ea diferença mostrou significância estatística (
p
= 0,044 e 0,003, respectivamente) (Figura S2A, B ). Considerando que, Firmicutes e Actinobactérias foram significativamente menos abundante microbiota em ratos saudáveis (
P
= 0,01 e 0,035, respectivamente) (Figura S2C, D). A partir dos nossos dados não Fusobactérias foi detectada em nenhum dos ratos saudáveis (Figura S2E) e não houve diferença significativa em Proteobacteria (
P
= 0,175) (Figura S2F) ao comparar as comunidades bacterianas dos dois grupos, embora sua abundância foi maior nos ratos CRC. diferenças estatisticamente significativas entre o grupo do tumor e grupo de controlo ao nível da família também foram realizados em nosso estudo. Diferença na abundância relativa de Bacteroidetes (11,6% vs. 4,6%,
p
= 0,0029), Rikenellaceae (3,71% vs. 1,47%,
p
= 0,0008) e Peptostreptococcaceae (9,18 % vs. 1,61%,
p
= 0,046) foram significativas entre ratos CRC e ratos saudáveis, enquanto houve um nível extremamente baixo de Prevotellaceae (31,91% vs. 62,88%,
p
= 0,0027) e cianobactérias (0,3% vs. 0,82%,
p
= 0,003) em ratos CRC em comparação com ratos saudáveis.
(a) ratos saudáveis, (ratos B) CRC. Histograma representa a abundância relativa de filos bacteriana na microbiota de cada amostra (C). “Outros” representa as bactérias não classificados, Actinobacteria, as cianobactérias, Deferribacteres, Elusimicrobia, Fusobactérias e tenericutes.
No nível de gênero, estudamos a composição microbiana de cada amostra (Figura S3) e -se para ser significativamente diferente entre os dois grupos. Os dez gêneros mais abundantes no grupo de controle foram
Prevotella
,
Bacteroides
,
Lactobacillus
,
Treponema
,
Parabacteroides
,
Anaerovibrio
,
Ruminococcus
,
Roseburia
,
Oscillospira
e
Sutterella
. No entanto,
Prevotella
,
Bacteroides
,
Allobaculum
,
Treponema
,
Lactobacillus
,
Blautia
,
Parabacteroides
,
Paenibacillus
,
Anaerovibrio
e
Paraprevotella
foram os dez gêneros mais abundantes no grupo tumor, de forma correspondente (Figura S4). Curiosamente, embora
Prevotella
foi o gênero mais abundante em ambos os grupos, a abundância de que era muito mais elevado em ratos saudáveis. Estatisticamente,
Bacteroides
, com mais de 1% do total de bactérias nas fezes, eram relativamente abundantes em ratos CRC. De particular interesse, gêneros
Bacteroides. fragilis
foi encontrado principalmente em ratos CRC. Enquanto isso,
Prevotella
,
Lactobacillus
e
Treponema
foram encontrados para ser significativamente maior em ratos saudáveis do que os ratos CRC (Figura 5). Genera
Desulfovibrio
,
Clostridium
,
Actinobacillus
,
Succinatimonas
,
Dorea
,
Phascolarctobacterium
,
Parabacteroides
,
Bilophila
,
Paraprevotella
,
Helicobacter
e
Paenibacillus
exibiu baixa abundância; no entanto, eles foram todos estatisticamente enriquecida nas fezes de ratos CRC comparação com ratos saudáveis. Além disso, gêneros
Roseburia, Eubacterium
e
Ruminococcus
foram enriquecidos no grupo controle, e
Fusobacterium
estava ausente de ratos saudáveis. O heatmap do nível género de bactérias também demonstrou o mesmo fenômeno (Figura S5). Outras diferenças entre os dois grupos pode ser encontrada na Tabela S3.
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a importância das comparações entre os grupos indicados.
Discussão
a população microbiana no intestino é heterogêneo e complexo. roedores de laboratório têm sido fundamentais para ajudar os pesquisadores a desvendar as complexas interações que os mamíferos, incluindo humanos, têm com os seus comensais microbianas [24]. Nós utilizamos um modelo animal comum de CRC neste estudo para investigar a natureza da estrutura da comunidade microbiana no CRC comparação com os animais saudáveis. Os estudos realizados em modelos animais poderia ter importantes implicações relevantes para a doença humana [25].
Neste estudo, comparamos a composição bacteriana do lúmen intestinal de ratos entre o grupo saudável e grupo CRC usando a plataforma de Roche 454 sequenciador. Observamos diferenciação significativa da microbiota intestinal entre ratos saudáveis e ratos tratados com carcinógenos que desenvolveram carcinomas do cólon. Nós apresentaram maior abundância relativa de Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria no lúmen intestinal de ratos CRC, e ainda mostrou que Bacteroidetes foi menos abundante neste grupo. Este resultado está de acordo com resultados semelhantes por Zhao
et al.
[26] a partir de estudos em seres humanos. Tem sido relatado que as doenças inflamatórias do intestino tais como a doença de Crohn e a colite ulcerativa são conhecidos factores de risco para o cancro colorectal, e uma redução significativa dos Bacteroides phylum foi detectado nestas duas doenças por investigadores [27] – [28]. Em um estudo mais aprofundado, alterações entre os gêneros desse filo também foram detectados em nosso estudo. Especialmente, a constatação de que
B. fragilis
foi aumentada no lúmen intestinal de ratos CRC.
Estudos anteriores sugeriram que diferentes
Bacteroides
estirpes podem influenciar a saúde do hospedeiro através de seu potencial colitogenic ou probiótico. Waidmann e os seus colegas descreveram a estirpe isolada B. vulgates com possíveis propertites probióticas que foi capaz de melhorar o desenvolvimento de E. coli colite induzida por um mecanismo ainda desconhecido em ratinhos interleucina-2 deficiente em [29]. No entanto, um comensal do cólon humano, enterotoxigênicos
B. fragilis
ter sido demonstrado que a colonização do mesmo em vários neoplasia intestinal (min) ratinhos poderia resultar em um aumento marcado na espessura do cólon, inflamação do cólon e tumores visíveis, que acompanhada pela activação da STAT3 e a infiltração de t
células inflamatórias H17 [30]. Os resultados desta pesquisa estão de acordo com a nossa conclusão de que
B. fragilis
era em grande quantidade em ratos CRC. Além disso, Proteobacteria também têm sido relatados para ser aumentado na microbiota de animais com colite induzida experimentalmente e os pacientes que sofrem de IBD [31]. Ele pode ser relevante com a interacção directa entre Proteobacteria e células intestinais por meio de sistemas de secreção bacterianas tais como tipo III sistema de secreção (T3SS) [32]. Além disso, tem sido relatado que Firmicutes realizada a capacidade em aumentar a colheita de energia a partir da dieta [33]. O filo Firmicutes contém gêneros relevantes, incluindo
Ruminococcus
,
Clostridium
e os produtores de butirato
Eubacterium
,
Faecalibacterium
e
Roseburia
[34]. Butirato é uma importante fonte de energia para as células epiteliais do cólon, muitas vezes preferido ao longo circulatório glucose ou glutamina. Até 90% de butirato é metabolizado por colonócitos [35]. Aqui nós mostramos abundância de reduzida
Roseburia
e
Eubacterium
na microbiota intestinal de ratos CRC. Em dois estudos de intervenção dietética, densidades populacionais de
Roseburia
e
Eubacterium
foram provado que tem uma forte correlação com as concentrações de butirato fecais em resposta à oferta de carboidratos alterada [36], o que sugere a importância de
Roseburia
e
Eubacterium
na produção de butirato in vivo. Sengupta
et ai.
[37] indicaram que pode existir alguma evidência de que a entrega de uma quantidade adequada de butirato na mucosa intestinal pode proteger contra eventos precoces tumorigénicas. Portanto, o desequilíbrio estrutura neste artigo desempenha um papel importante na redução das bactérias produtoras de butirato no intestino dos ratos CRC.
Além disso, o desequilíbrio estrutura dentro do microbiota intestinal de ratos CRC está significativamente relacionada com o aumento em múltiplos agentes patogénicos potenciais e a diminuição da espécie probióticas. Tem sido demonstrado que
Bacteroides
populações e mais especificamente, os dos
B. fragilis
produzir uma metaloprotease conhecido como fragilysin em pacientes com cancro do cólon, mas não nos controlos. Este relatório sugere que esta subpopulação pode favorecer carcinogênese [38]. Além disso, o serried
Desulfovibrio
reduz sulfato de produzir sulfureto de hidrogénio (H
2S), que se demonstrou ser capaz de gerar danos no ADN que podem ser, em parte, responsável pela geração do instabilidade genómica e as mutações cumulativos observados em câncer colorretal [39] – [40].