Abstract

A conversão de receptor de andrógeno (AR) de sinalização como um mecanismo de crescimento supressão de células epiteliais de próstata normais com a de estimulação do crescimento em células de cancro da próstata é muitas vezes associada com AR mutação, amplificação e sobre-expressão. Assim, a regulação negativa da sinalização AR é comumente terapêutico para o câncer de próstata. A linha de células E006AA foi estabelecida a partir de um hormônio naïve, câncer de próstata localizado. células E006AA são geneticamente aneuploidia e crescem igualmente bem quando xenoenxerto em ambos os ratos intactos ou NOG macho castrado, mas não nuas. Estas células exibem: 1) a duplicação do cromossoma X e

amplificação do gene AR

, embora paradoxalmente não acoplado com um aumento da expressão de AR, e 2) somática, dominante-negativo Serina-599-Glicina mutação de perda de função dentro do superfície de dimerização do domínio de ligação ao DNA do

AR

gene. Nenhum efeito sobre o crescimento de células é observada usando E006AA knockdown alvo mutante endógeno de AR, a expressão ectópica de AR de tipo selvagem, ou o tratamento com androgénios ou anti-androgénios. células E006AA representam um protótipo para um subtipo recém-identificado de células de câncer de próstata que apresentam uma perda de função AR dominante negativo em um paciente hormonalmente naïve. Essa perda de função elimina a supressão do crescimento mediada por AR normalmente induzida por níveis fisiológicos normais de androgénios, produzindo assim uma vantagem de crescimento selectivo para estas células malignas em pacientes hormonalmente naive. Estes dados ilustram que a perda da supressão do crescimento de AR mediada é um processo independente, e que, sem modificações adicionais, é insuficiente para adquirir o vício de sinalização de oncogenes AR. Assim, os doentes com cancro da próstata células que abrigam tais mutações AR perda de função não irá beneficiar de hormônio agressivo ou anti-AR terapias mesmo que eles expressam a proteína AR

Citation:. D’Antonio JM, Vander Griend DJ , Antony L, Ndikuyeze G, Dalrymple SL, Koochekpour S, et al. (2010) Perda de supressão do crescimento receptor andrógeno-dependentes pelas células cancerosas da próstata pode ocorrer independentemente de adquirir Oncogênicos Dependência de receptor andrógeno sinalização. PLoS ONE 5 (7): e11475. doi: 10.1371 /journal.pone.0011475

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Abril de 2010; Aceito: 14 de junho de 2010; Publicação: 08 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 D’Antonio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. NIH Grant R01DK52645 eo Maryland Stem Cell Research Fund MSCRF-II-0428 generosamente apoiou esta investigação. Donald Vander Griend foi apoiado por um treinamento Grant Urologia (NIH T32DK07552), e por um Prêmio de Formação Pós-Doutorado DOD (PC060843). Jason Dantonio é apoiado por um treinamento Grant Urologia (NIH T32DK07552-21A1). Dr. Koochekpour foi apoiado por uma subvenção do NIH /NCRR-Center of Biomedical Research Excellence (COBRE; 1P20 RR021970) e concede R21CA149137. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

na última década tem havido um interesse renovado no receptor de androgénio (AR) de sinalização, no que se refere à função normal da próstata, a carcinogénese da próstata, e progressão metastática. Na próstata normal, por meio de funções de AR uma interacção parácrina recíproca entre as células epiteliais e estromais [1]. A conexão de andrógenos para o AR nas células estromais da próstata ativa uma cascata de transcrição resultando na produção e secreção de factores de crescimento parácrinos, conhecidos como andromedins, que se difundem para dentro do compartimento epitelial, receptores cognatos da superfície celular ligam-se e activam as vias de sinalização que estimulam a proliferação e sobrevivência das células epiteliais [1]. Na presença de níveis fisiológicos de androgénio, e, portanto, andromedins, AR ligado ao ligando localizada na célula epitelial luminal secretora impede o crescimento excessivo do compartimento epitelial por suprimir a proliferação celular e promover a diferenciação celular [1], [2], [3] , [4]. A importância desta capacidade de crescimento-supressiva AR dependente do contexto celular está documentada através de estudos que mostram que a perda condicional da expressão de AR no compartimento epitelial, mas não em células do estroma, resulta num aumento da proliferação celular epitelial luminal [5], [6]. Quando um nível fisiológico de androgénio não é mantido, tal como após a ablação de androgénio, o nível de andromedins diminui até um nível em que eles podem não estimular a proliferação, nem bloquear a activação da apoptose nas células epiteliais e, assim, a próstata regride [1].

Durante a carcinogênese de próstata, os dois mecanismos de sinalização AR-independentes e AR-dependentes contribuir para a transformação maligna de células epiteliais [7]. Na via independente de AR, AR proteína não é expressa e, por conseguinte, a supressão regulada por RA do crescimento de células malignas é perdida. Importantemente, quando Ar é, em seguida, ectopicamente expressa em tais células de cancro da próstata independente de AR, AR sinalização activadas por androgénio inibe o crescimento celular [8]. Na via dependente de AR, AR função é muitas vezes convertidos a partir de um supressor de crescimento a uma sobrevivência de células de cancro da próstata e do oncogene estimular a proliferação de [1], [9], [10]. Embora vias quer AR-independentes ou dependentes são possíveis, a maioria dos cancros da próstata adquirir sinalização oncogénica AR, proporcionando assim a razão de ser por ablação de androgénios é terapia padrão para o cancro da próstata metastático, uma vez que inibe a proliferação e activa a apoptose nestas células de cancro metastáticas [ ,,,0],11]. Além disso, a sinalização AR continua a ser uma meta central, mesmo para o câncer de próstata metastático resistente à castração [7]. Esta baseia-se no resultado de estudos que mostram que, embora pouco frequente em doentes hormonalmente naïve, mutação do gene de AR e de amplificação, resultando na expressão da proteína AR elevada, são detectados na maior parte dos tecidos de cancro da próstata metastático obtidos a partir de pacientes com doença metastática de castração-resistente [12], [13]. Consistente com estas observações clínicas, a mutação do gene de AR, a amplificação e a sobre-expressão da proteína são frequentemente observados na maioria das linhas celulares de cancro da próstata derivadas a partir de hospedeiros de castração-resistente [14], [15]. Estas linhas de células de câncer de próstata castração-resistente não sofrem apoptose quando andrógenos estão esgotados ou andrógenos antagonistas são utilizados; no entanto, eles param de proliferar e activar a morte celular se o nível de proteína AR é reduzido abaixo de um nível crítico, tanto

in vitro

[14], [16], [17] e

in vivo

[ ,,,0],18]. Estas observações são consistentes com o conceito de “vício oncogene” [19] para AR expressão e função das proteínas, e documento que tais células cancerosas da próstata castração-resistente permanecem viciado em AR sinalização para o seu crescimento maligno [1], [9].

a presença de expressão AR, mutações somáticas AR ou ampliação não significa necessariamente que, no entanto, que uma célula de cancro da próstata é viciado em AR sinalização. Esta afirmação baseia-se no presente estudo, que documenta um subtipo adicional de células cancerosas humanas da próstata. Neste subtipo, AR foi submetido a um dominante negativo, mutação de perda de função mesmo que AR é geneticamente amplificado sem que o paciente já receberam terapia de ablação de androgénio. Tal perda negativo dominante da função de AR nas células malignas produz uma vantagem de crescimento selectivo, eliminando a supressão do crescimento de AR induzida por sinalização dependentes de androgénio normal; No entanto, embora necessária, não é suficiente para estas células malignas adquirem um vício oncogênico a AR-sinalização.

Métodos

Declaração de Ética

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com animais protocolo MO09M434 aprovado pelo Comitê animal Care e Use o Johns Hopkins especificamente para este estudo.

Cells and Materials

E006AA [20], S006AA [20], LNCaP e PC-3 (obtido a partir de ATCC, Manassas, VA), e LNCaP C4-2B (obtido a partir de UroCor, Oklahoma City, OK), as células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), e LAPC-4 células em IMDM (Invitrogen) e 1 nM R1881 , ambos contendo 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT), 1 × Pen /Strep, e L-glutamina. CWR22 tecido do tumor xenoenxerto foi um presente amável de Thomas Pretlow (Case Western Reserve University, Cleveland, OH). Carvão /dextrano despojado de FBS (csFBS) foi obtido a partir de Hyclone e usada para completar o fenol livre de RPMI-vermelho (Invitrogen) para ensaios de luciferase e de imunoprecipitação da cromatina. O androgénio sintético R1881 foi adquirido da Perkin-Elmer (Boston, MA). análise do PSA foi realizada pelo Laboratório de Química Clínica JHMI. O crescimento celular foi medida por um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (CellTiter celular não radioactivo Ensaio de Proliferação de Promega Corporation (Madison, WI)). Resumidamente, as células foram semeadas em formato de 96 poços e deixou-se aderir durante a noite. As células foram tratadas com veículo ou droga. No dia específicos, 15 ul do reagente corante MTT foi adicionado a cada poço, as placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 horas, a 100 ul de Reagente de paragem foi adicionada a cada poço, e as placas lidas por um Dispositivos SpectraMAX molecular mais leitor de placas a 570 e 650 nm. As leituras de absorvância foram então representados graficamente contra uma curva padrão para determinar os números de células. Os resultados são apresentados a partir do dia 4. sobrevivência clonogénica foi ensaiada como se segue: 500 células (E006AA parental, E006AA LV-não-silenciamento-shRNA, e E006AA LV-AR-shRNA) foram plaqueadas por cavidade em placas de 6 poços, deixadas aderir e colonizar durante seis dias, em seguida, simultaneamente, H3>

análises do cariótipo e fluorescência a hibridação in situ

fixadas e coradas numa solução de 0,5% de violeta de cristal /metanol a 25% e as colónias foram contadas manualmente.

a análise citogenética realizada utilizando métodos padrão. anomalias cromossómicas foram descritos de acordo com as orientações ISCN [21]. FISH foi realizada sobre as linhas celulares e num controlo normal do sexo masculino usando sondas adquiridos de Vysis (Abbott Molecular), específicos para o gene de AR (Xq12) e X centrómero. A hibridação foi efectuada de acordo com as instruções do fabricante. Para cada linha celular, 100 núcleos em interfase foram marcados e o rácio de vermelho (AR) para sinais verdes (Xcen) foi calculada. Um total de 9-20 metáfases também foram analisados. As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio de epifluorescência e FISH Ver software (Applied Spectral Imaging).

In vivo

Ensaios tumorais

In vivo

crescimento ensaios padrão foram realizados como previamente descrito [22], [23]. Para injecções subcutâneas, um milhão de células E006AA em 200 ul de 80% de Matrigel (BD Biosciences, diluiu-se com HBSS frio) foram injectados nos flancos de ratinhos nus ou SCID macho-NOG. Para inoculações de xenotransplante CWR22, 20 mg de tecido foi injetado por mouse. A castração cirúrgica foi realizada como descrito anteriormente [22], [23]. Passagem de tecido de tumor foi realizada por trituração do tecido tumoral, passando-a através de um filtro de tecido estéril, lavando-o em PBS e re-injecção de 50 mg de tumor em 200 ul de 80% de Matrigel.

Detecção imuno

a imunocoloração para AR (N-20; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), PSA (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), ΔNp63 (LabVison /NeoMarkers, Freemont, CA), NKX3.1 (UMBC) , e CK5 (Babco, Richmond CA) foi realizada em secções de xenoenxertos, como descrito anteriormente [24], com as seguintes modificações: as secções de tecido foram deparrafinized, re-hidratados e brevemente equilibrada em água. Para Ar e NKX3.1 imuno-histoquímica, desmascaramento antigénio foi realizada por lâminas de ebulição em 1 mmol /L de EDTA (pH 8,0) durante 15 min. Para a coloração p63, as lâminas foram cozidos no vapor por 20 min em Antigen Unmasking Solution (Vector Laboratories, Burlingame CA) por 20 minutos. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação com peroxidase de bloco durante 5 min à temperatura ambiente. Para Ar e coloração NKX3.1, a ligação não específica foi bloqueada através da incubação em 1% de albumina de soro de bovino em tampão Tris-HCl a pH 7,5, durante 20 min à temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas com anticorpos primários, incluindo um anticorpo de coelho policlonal AR (diluição 1:25) durante 45 min à temperatura ambiente; anticorpo monoclonal de ratinho de PSA (diluição 1:50) 45 min à temperatura ambiente; anticorpo monoclonal de ratinho p63 (diluição 1:50) durante 45 min à temperatura ambiente; anticorpo policlonal de coelho NKX3.1 (1:1000 diluição) durante 45 min à temperatura ambiente; e anticorpo policlonal de coelho CK5 (1:2500 diluição) durante 45 min à temperatura ambiente. Após a aplicação do anticorpo primário, as lâminas foram incubadas com poli-HRP conjugado secundário (EnVision (AR, p63) ou PowerVision (PSA, NKX3.1, CK5)) em 1:3000 diluição durante 30 minutos à temperatura ambiente. detecção de sinal foi realizado utilizando tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAB) como o cromagénio durante 20 min. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado.

A infecção Lentivirus

de tipo selvagem de expressão de ADNc AR humano estável e separação por FACS para células positivas para GFP foi realizada como previamente descrito [8], [25]. mutante estável LV-AR S599G foi criado através de amplificação por PCR de ADNc contendo a mutação E006AA S599G. Tanto o fragmento de PCR e o de tipo selvagem lenti-viral AR plasmídeo foram digeridos com Eco81I e Tth111I. produto da PCR digerido e o plasmídeo LV-AR foram isolados, purificados, ligados utilizando ligase de T4 kit rápido (Fermentas), e sequenciados para confirmar a inserção S599G. knockdown Curto-hairpin de AR foi conduzida utilizando MISSÃO

TM partículas de transdução de shRNA lentivirais segmentação quer AR sozinha ou um controlo não-silenciamento shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 1 × 10

4 E006AA ou LNCaP foram plaqueadas por cavidade e deixadas a aderir durante 4 ou 24 horas, respectivamente. As células foram transduzidas a um MOI de 2 (2 × 10

4 partículas /poço) sem polibreno. selecção de antibiótico [1,5 ug /ml de puromicina (Sigma)] foi iniciado 48 horas mais tarde.

AR Sequenciação

O ARN foi colhido utilizando o Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) e contaminando o DNA foi removido utilizando o estojo livre de ADN Ambion (Ambion, Austin, TX). Transcriptase inversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 1 ug de ARN total foram utilizadas para gerar ADNc com iniciadores oligo-dT. O ADN genómico foi extraído utilizando o Qiagen Mini Kit de ADN e incubaram-se com RNase (Roche, Mannheim, Alemanha) a 37 ° C durante 30 min para remover contaminantes de ARN. A amplificação por PCR de ADNc e ADN genómico foi realizada utilizando Platinum

Pfx ADN polimerase (Invitrogen) de acordo com as especificações do fabricante com os seguintes conjuntos de iniciadores que se sobrepõem: (1) 5′-AGAGAGGTAACTCCCTTTGGCT-3 ‘e 5’-ACGCTCTGGAACAGATTCTGG -3 ‘(740bp), (2) 5′-TCCCGCAAGTTTCCTTCTCT-3′ e 5’-GATACTGCTTCCTGCTGCTGTT-3 ‘(756bp), (3) 5′-TGAGGAACAGCAACCTTCACAG-3′ e 5’-ACAGGGTAGACGGCAGTTCAA-3 ‘(704bp) , (4) 5’-GCCGAATGCAAAGGTTCTCT-3 ‘e 5′-TTGACACAAGTGGGACTGGGA-3′ (700 pb), (5) 5’-CAGTTGTATGGACCGTGTGGT-3 ‘e 5′-CTACACCTGGCTCAATGGCT-3’ (723bp), (6) 5 ‘ -CGGAAGCTGAAGAAACTTGG-3 ‘e 5′-AGAAGCGTCTTGAGCAGGAT-3′ (685bp), (7) 5’-ATTCCAGTGGATGGGCTGAA-3 ‘e 5′-TAGCTCTCTAAACTTCCCGTGG-3′ (714bp), (8) 5’-CTTCCCATTGTGGCTCCTAT-3 ‘e 5’-ACCTTCTCGTCACTATTGGC-3 ‘(361bp); e para a amplificação de DNA genómico do exão 3 ‘do gene de AR: (9) 5′-TGTTTGGTGCCATACTCTGTCCAC-3′ e 5’-GCATCCTCACTCACCTTCTGTTGG-3 ‘(530bp). Os produtos de PCR foram coluna purificado usando o kit Qiagen QIAquick (Qiagen) e foram sequenciados no Centro Johns Hopkins Análise DNA Universidade usando tanto frente e verso, primers.

Análise Western Blot

lisados ​​de células inteiras foram preparadas numa base por célula em tampão de lise (20 mM Tris-HCl pH 7,8, 140 nM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,5% de Nonidet P-40) suplementado com PhosSTOP comprimido de inibidor de fosfatase e comprimido inibidor da protease (Roche ), e ditiotreitol 1 mM. Os lisados ​​celulares totais foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em 5% de leite (TBS + 0,1% Tween-20) durante 1 h. O anticorpo policlonal de coelho AR (SC-816), e rato CK8 monoclonal (SC-53266) e anticorpo monoclonal de ratinho CK18 (SC-32722) anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), e o rato monoclonais ß-actina anticorpo foi adquirido da Sigma (A5441) e foram utilizadas em conjunto com um anti-coelho HRP-anticorpo (7074, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ou anti-ratinho-HRP (NA931V, GE Healthcare, Reino Unido).

fracções celulares citoplasmáticos e nucleares foram preparados usando o kit Complexo Nuclear Co-IP (motivo Activo, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram lavadas e depois raspadas em PBS frio suplementado com inibidores de fosfatase. As pelotas de células foram ressuspensas e lisadas em solução hipotónica 1 × mais detergente, centrifugada a 6000 × g durante 5 min a 4 ° C, e as fracções removidas citoplasmáticos. pastilhas nucleares foram ressuspendidos em tampão de digestão mais cocktail de corte enzimático e incubadas a 4 ° C durante 90 min. EDTA 0,5 M foi adicionado para parar as reacções enzimáticas e cisalhar lisados ​​nucleares centrifugadas durante 10 min a 4 ° C. Todas as fracções foram combinadas com igual volume de 2 × tampão de amostra SDS e desnaturado a 95 ° C durante 5 min. As amostras foram separadas em 4-15% PAGE e colocados a hibridar com ambos os anti-AR. (N-20; Santa Cruz), o marcador citoplasmático Vinculina (Sigma), ou o marcador de HDAC nuclear (Santa Cruz Biotechnologies)

medição AR transcricional Atividade

As células foram colocadas (por poço) em poliestireno branco, fundo transparente, estéreis placas de cultura de tecidos de 96 poços em conformidade: LNCaP C4-2B (9000); PC-3 (7000); E006AA, E006AA LV-AR, E006AA LV-não-silenciamento-shRNA, E006AA LV-AR-shRNA (5.000). As células com ou sem androgénio (1,0 nM R1881) foram plaqueadas em seis repetições em RPMI (Invitrogen) suplementado com 10% (Hyclone) csFBS mas sem vermelho de fenol ou Pen /Strep e deixadas aderir durante a noite. As células foram transf ectadas usando Fugene 6 (Roche) com 50 ng probasina-PSA-pirilampo e 5 ng de pRL-TK-Renilla (Promega, Madison, WI) de luciferase repórter constrói por poço numa proporção de 03:01 (ul Fugene: Total ug ADN) em meio isento de soro [26]. No dia três, seis poços de tratamento foram estimuladas com andrógeno, enquanto seis poços de controlo recebeu% de veículo 0.1. No dia 4, o meio foi cuidadosamente aspirado e as células foram processadas de acordo com as instruções do kit de ensaio de luciferase duplo (Promega # E1910). Resumidamente, 30 uL de tampão de lise passiva foi adicionado a cada poço e a placa agitada num agitador durante 15 min à temperatura ambiente. Pirilampo e Renilla actividade enzimática foi medida utilizando uma placa Wallac Microbeta injector Jet 1450. células LNCaP transfectadas C4-2B triplos receberam 50 ng probasina-PSA-pirilampo, 5 ng de pRL-TK-Renilla, e de 50 ng LV-AR-S599G constrói por poço numa proporção de 03:01 (ul Fugene: ug de ADN total) em meio isento de soro.

cromatina imunoprecipitação

C4-2B LNCaP e células crescidas em fenol-vermelho livre de RPMI, suplementado com 10% csFBS E006AA, foram colhidas através de tripsinização e cromatina preparado de acordo com o kit MagnaChip de Upstate, Temecula, CA. ~ 1 × 10

7 células foram ressuspensas em meios de 10 ml, fixadas por adição de 275 jil de formaldeído a 37% e suavemente agitadas a 22 ° C durante 12 min. Após ligação cruzada, adicionou-se 1 ml de glicina e células suavemente agitada durante 5 min a 22 ° C, lavadas duas vezes em PBS frio, ressuspenderam-se em 500 de tampão de lise celular ul mais 2,5 inibidores da protease ul (PIPES 5 mM, pH 8, KCl 85 mM, 0,5% de NP-40) e centrifugado durante 5 min a 4 ° C. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão de lise de células de 500 ul 2,5 ul mais inibidores da protease, incubadas 15 min em gelo com breve vortex todos os 5 minutos, e centrifugadas a 800 x g durante 5 min a 4 ° C. pastilhas nucleares foram ressuspendidos em tampão de lise nuclear, mais inibidores de protease de 2,5 ul (1% de SDS, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,1). Cromatina a ultra-sons para um comprimento médio DNA de 500-1200 pb usando Fisher Scientific o Sonic Dismembrator Modelo 100 (4 × 15 pulsos seg em ajuste 3). Cinco ul foi guardado para entrada de controlo e alíquotas de 50 ul foram diluídas em 450 ul de tampão de diluição (0,01% de SDS, 1,1% de Triton, EDTA 1,2 mM, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1, NaCl 167 mM). Quatro ug de anticorpo foi adicionado a tubos respectivos: 4 ul de 1 mg de IgG de coelho /ml ou 40 ul de 100 ug /mL de anti-coelho de AR (SC-816, Santa Cruz) e rodado O /N a 4 ° C. Os complexos imunitários foram centrifugados 10 min a 10000 × g durante 4 ° C para sedimentar quaisquer agregados ou complexos não-específicos. O sobrenadante (o desejar complexos imunes) foi colhido e combinado com 20 ul de proteína A Dynabeads (Invitrogen, CA) e suavemente agitada durante 2 horas a 4 ° C. Os tubos foram colocados em uma cremalheira magnética Millipore e complexos imunes sequencialmente lavada uma vez com tampão de baixo teor de sal (0,1% de SDS, 1% Triton, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 mM, NaCl 150 mM), tampão de alto teor salino (0,1 % de SDS, 1% Triton, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, NaCl 500 mM), tampão de LiCl, e TE, com 3 min de agitação a cada passo de lavagem. Para inverter as ligações transversais, as esferas foram ressuspensas em 100 ul de Chelex e fervida 10 min a 95 ° C, centrifugada 1 min a 12.000 x g a 4 ° C, e os sobrenadantes recolhidos. As pérolas foram ressuspensas em 120 ul de água, centrifugadas outra vez, e os sobrenadantes reunidos com o sobrenadante anterior. O ADN capturado foi purificado utilizando o kit Qiagen de purificação de PCR (# 28104) de acordo com as instruções do fabricante e analisados ​​por PCR e Q-PCR.

Análise por PCR de ADN imunoprecipitado

Usando 5 Prime HotMasterMix ( Eppendorf), reacções de PCR foram realizadas como se segue: 94 ° C durante 2 min, depois 32 ciclos de 30 s de desnaturação a 94 ° C, 30 s de emparelhamento (conforme indicado abaixo de cada par de iniciadores), e 30 s de alongamento a 65 ° C, em seguida, um alongamento final de 2 min a 65 ° C. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2% e corado com brometo de etídio. Os iniciadores para a amplificação de fragmentos de DNA são os seguintes: promotor de PSA são (52 ° C) 5′-FWD GCCAAGACATCTATTTCAGGAGC-3 ‘, 5′-rev CCCACACCCAGAGCTGTGGAAGG-3′; KLK2 promotor (52 ° C) fwd 5’-CTCCAGACTGATCTAGTATG-3 ‘, 5′-rev TTGGCACCTAGATGCTGACC-3’; local SP1 P45

promotor Skp2 (53 ° C) 5′-FWD GATCCACGCTCAGAGACGAC-3 ‘, 5′-rev TTCGAGATACCCACAACCCC-3′; elemento de ligação TCF4 na promotor c-Myc (55 ° C) fwd 5’-GCTCTCCACTTGCCCCTTTTA-3 ‘, 5′-rev GTTCCCAATTTCTCAGCC-3’.

Análise Quantitativa de PCR de DNA imunoprecipitadas

Usando BioRad QI Syber verde Supermix (Hercules, CA), as reacções de PCR foram realizadas com o BioRad iCycler como se segue: 95 ° C durante 3 min, depois 40 ciclos de 30 s de desnaturação a 95 ° C, 30 s de recozimento a 55 ° C, e 45 s de alongamento a 72 ° C (dados foram recolhidos durante a extensão), seguido por uma curva 110cycle fusão 45-100 ° C para assegurar a eficiência do iniciador. Anteriormente iniciadores desenhados para a amplificação quantitativa de fragmentos de ADN contendo uma putativa estão no promotor do gene de PSA e um ARE III na região do potenciador de PSA são: SÃO FWD CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA 5′-3 ‘, 5′-rev GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG-3′; ARE III fwd 5’-TGGGACAACTTGCAAACCTG-3 ‘, 5′-rev CCAGAGTAGGTCTGTTTTCAATCCA-3’ [27]. cálculos de entrada por cento foram feitas da seguinte forma:% input = 2 (Ct

AR Chip – Ct

entrada) x100. O teste t de Student foi utilizado para determinar o valor p.

Resultados

Células E006AA são tumorigénica em ratinhos inteiros e castrados NOG-SCID

Koochekpour et al. relatou a criação de uma nova linha humana de câncer de próstata celular, E006AA, que foi derivado de um câncer de próstata localizado Gleason 6 em um paciente com câncer de próstata hormônio-naïve de ascendência americana Africano [20]. Condizer células estromais da próstata normais, denominado S006AA, também foram cultivadas a partir dos mesmos radicais de prostatectomia amostra [20]. A origem epitelial das células E006AA foi confirmada por expressão positiva para citoqueratinas 8 (Ck8) e 18 (CK18), ao passo que a origem do estroma das células S006AA foi confirmada pela expressão positiva de marcadores mesenquimais desmina e actina de músculo liso alfa eo ausência de CK8 CK18 e [20]. Nos estudos originais, foram E006AA células não tumorigénicas quando xenoenxertados em ratinhos nus machos intactos [20]. Desde ratos pelados têm níveis anormalmente elevados de natural killer ativada (NK) células T, resultando em um host aumento imuno-reactividade para um tumor em crescimento [28], este levantou a questão de saber se estas células E006AA foram imortalizadas mas apenas parcialmente transformado ou se eles são totalmente maligna, mas sensível a morte das células NK. Para resolver este problema, celulares E006AA inoculações subcutâneas em ambos os sexos masculino intacta nude e NOG /SCID /γ

c

nulo camundongos deficientes triplos [isto é, os ratos NOG-SCID deficiente em NK, B e células T] foram iniciado [29]. Inoculação de células E006AA em ratinhos nus (n = 15) demonstraram que as células E006AA formar tumores palpáveis, atingindo ~100-200 mm

3 por seis semanas, em 100% dos ratinhos. Após seis semanas, no entanto, todos os tumores E006AA em ratinhos nus macho intacto pararam de crescer e regrediu durante um segundo período de 5-10 semanas (Figura 1A). Em contraste com a situação em ratinhos nus, os tumores E006AA cresceram a uma taxa acelerada em ratinhos SCID-NOG e não regrediu (Figura 1A). Curiosamente, embora tumorigénico, sem PSA do soro pode ser detectado em ratinhos portadores de tumor E006AA (n = 10).

(A) inoculação de células E006AA em ratinhos nus machos em comparação com ratos NOG-SCID machos. (B) Transferência de tecido de tumor derivado de um tumor de xenoenxerto E006AA estabelecida a partir de um rato SCID macho NOG-a ratinhos nus e NOG-SCID machos intactos. (C) O crescimento da E006AA e CWR22 próstata humana tumores de xenotransplante de cancro em castrados vs. ratos machos inteiros de oito semanas. (D) A análise histológica (H E) e imunocoloração de tecidos de xenoenxerto E006AA secções para AR, PSA, p63, e CK5 (imagens obtidas a 20 × 40 × e). (E) a análise Western blot de CK8 e expressão CK18 em LNCaP, PC-3, células E006AA e S006AA. ß-actina serviu como um controlo de carregamento.

Para confirmar ainda que a observada regressão espontânea de tumores de xenoenxerto E006AA em hospedeiros nu, mas não em ratinhos SCID-NOG, decorre de reconhecimento imunológico e eliminação de NK células, que removeu um tecido estabelecida e crescimento do tumor a partir de um hospedeiro E006AA NOG-SCID e transplantadas de volta para este tumor, quer intacta macho NOG-SCID (n = 5) ou ratinhos nus (n = 5). Semelhante às nossas observações anteriores, os tumores transplantados foram submetidos E006AA regressão retardada em ratinhos nus machos intactos enquanto formando tumores de crescimento contínuo em hospedeiros NOG-SCID (Figura 1B). Estas documento combinado resultados que as células E006AA são realmente tumorigénico, mas vulnerável a morte das células NK.

Tendo demonstrado a tumorigenicidade de células E006AA, nós próxima avaliada a sua capacidade de resposta andrógeno,

in vivo

, inoculando essas células em ambos os intacta (n = 10) e castrados (n = 8) anfitriões NOG-SCID machos. Os tumores desenvolveram igualmente bem em ambos os hospedeiros e não houve diferença na taxa de crescimento ou de volume do tumor nos animais comparada NOG-SCID intactos castrados (Figura 1C). Para garantir níveis de castração de androgénios circulantes, o crescimento do xenoenxerto CWR22 cancro da próstata humano de androgénio-responsivo em castrados (n = 5) vs intactos (n = 5) ratos do sexo masculino também foi analisada. Ao contrário em ratinhos intactos, o crescimento de tumores de xenoenxerto de CWR22 em hospedeiros castrados foi profundamente inibida (Figura 1C). Estes documentos resultados que as células E006AA apresentar um crescimento de castração-resistente,

in vivo,

apesar de terem sido originalmente criado a partir de um câncer de próstata primário hormonalmente naïve. Para caracterizar o fenótipo destas células E006AA, tumores de xenoenxerto NOG-SCID foram retirados e processados ​​para análise histológica e análise imuno-histoquímica. Figura 1D ilustra que as células E006AA são localmente invasivos, penetrando fibras musculares esqueléticas no site local da inoculação com as células invasoras exibindo características de marca registrada de núcleos de células de câncer aumentados e polimórficas na qual a expressão da proteína AR é detectável. De acordo com a análise do soro anterior, as células de xenoenxerto E006AA não coraram positivo para a PSA (Figura 1D), ou Ar-regulada NKX 3.1 proteínas (dados não apresentados). Além disso, as células de cancro não tinham expressão de células basais específica do marcador, o p63, mas foram positivas para os marcadores de células epiteliais citoqueratina 5 (CK5) (Figura 1D), CK8 e CK18 (Figura 1E), confirmando ainda mais a da origem epitelial das células E006AA [30], [31], [32].

para descartar uma explicação alternativa para por que as células E006AA foram mostrados para ser tumorigénico no presente estudo, ainda não tumorigénica nos estudos originais, células E006AA rotineiramente mantida

in vitro

foram cariotipadas directamente a partir de cultura de células (Figura 2A) e verificou-se que, um cariótipo anormal idêntico ao relatado originalmente para a linha celular E006AA [20]. Essas células foram inoculadas em hospedeiros NOG-SCID e um tumor em crescimento contínuo foi subsequentemente colhida para restabelecer

in vitro

E006AA culturas. A análise do cariótipo destas células E006AA derivadas de tumor documentada a mesma cariótipo anormal, como pode ser visto na

In vitro

-maintained linha celular (Figura 2B), eliminando a possibilidade de que células geneticamente E006AA tornou-se instável após inoculação em NOG- SCID e desenvolveram alterações citogenéticas adicionais que completaram a sua transformação maligna em uma variante tumorigénico.

(a) a análise do cariótipo das células E006AA antes da injecção e

in vivo

crescimento do tumor. (B) Análise de células E006AA derivadas de um rato portador de tumor NOG-SCID, documentando há alterações cariotípicas significativos durante o crescimento do tumor.

amplificação, mutação e expressão de AR em Castro-resistente células E006AA

fluorescência

in Situ

fluorescente (FISH) foi realizada com sondas específicas para o

AR

gene [Xq12] (sinal vermelho) e do centrômero X (sinal verde) ( Figura 3A). interfase análise demonstrou que em 91% das células examinadas, havia dois sinais vermelho associados com cada sinal verde. Uma vez que há uma duplicação do cromossoma X, isto significa que, em média, o

AR

gene é amplificado pelo menos de quatro vezes na linha celular E006AA.

(A) citogenética análise do estado de AR nas células de controlo e E006AA do sexo masculino normais, conforme determinado por fluorescência a hibridação in situ (FISH) utilizando sondas específicas para o gene de AR (Xq12, de cor vermelha) e o centrómero X (de cor verde). (B) Os resultados da sequenciação de sobreposição de iniciadores de amplificação por PCR de ARNm E006AA e ADNc identificada uma mutação sem sentido (Ser599Gly), que corresponde à posição “X” do motivo AXRND conservada em D-caixa de DBD (como indicado pela seta negra na posição