Abstract

extrato de cevada Green (GB) foi investigada quanto à possibilidade actividade anti-cancro por análise das suas propriedades anti-proliferativas e pro-apoptóticos em linhas celulares de leucemia /linfoma humanos. Os nossos resultados indicam que GB exibe actividade anti-proliferativa selectiva sobre um painel de células de leucemia /linfoma em comparação com células não-cancerosas. Especificamente, GB interrompido a progressão do ciclo celular nas células BJAB, tal como se manifesta por prisão fase G2 /M e a fragmentação do ADN, e a apoptose induzida, como evidenciado por fosfatidilserina (PS) a translocação para a membrana citoplasmática exterior em duas linhagem B leucemia /linfoma linhas de celular. foi demonstrado que o efeito pró-apoptótico de GB para ser independente de despolarização mitocondrial, implicando, assim, vias de morte celular extrínsecos para exercer a sua citotoxicidade. Com efeito, GB provocou um aumento da produção de TNF-α, caspase-8 e caspase-3 de activação, e PARP-1 dentro de clivagem pré-B de leucemia linfoblástica aguda de células Nalm-6. Além disso, a caspase-8 e caspase-3 e PARP-activação um clivagem foram fortemente inibidos /bloqueados através da adição dos inibidores específicos de caspases Z-VAD-FMK e Ac-DEVD-CHO. Além disso, a sinalização intracelular análises determinado que o tratamento GB reforçada activação constitutiva de Lck e tirosina-quinases Src em células Nalm-6. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que GB induzida sinais anti-proliferativas e pro-apoptóticos preferenciais dentro de células de leucemia /linfoma de linhagem B, tal como determinado pelas seguintes características bioquímicas de apoptose: externalização PS, libertação aumentada de TNF-α, caspase-8 e a caspase-3 de activação, a PARP-1 e a clivagem a fragmentação do ADN As nossas observações revelam que GB tem potencial como um agente anti-leucemia /linfoma sozinho ou em combinação com terapias do cancro convencionais e, portanto, garante que a avaliação adicional

in vivo para

apoiar estas conclusões

Citation:. Robles-Escajeda E, Lerma D, Nyakeriga AM, Ross JA, Kirken RA, Aguilera RJ, et al. (2013) Pesquisando em Mãe Natureza para Anti-Cancer Atividade: antiproliferativa e pró-apoptóticos efeito provocado por Green Cevada em células de leucemia /linfoma. PLoS ONE 8 (9): e73508. doi: 10.1371 /journal.pone.0073508

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de abril de 2013; Aceito: 22 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Robles-Escajeda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento para este trabalho foi fornecida por NIGMS SCORE Grant 1SC3GM103713-01 para RJA; o Edward N. e Margaret G. Marsh Foundation, Lizanell, e Colbert Coldwell Fundação para RAK; Grants 8G12MD007592 à fronteira Biomedical Research Center (BBRC) e P20MD002287-06 à Saúde Hispânica Disparidades Research Center (HHDRC) dos Institutos Nacionais de Minority Saúde e Saúde Disparidades (NIMHD), um componente do National Institutes of Health (NIH) . ER-E e DL foram apoiados pelo aumento Scholars Program na UTEP através NIGMS Grant No. R25GM069621-08 e REU-NSF Grant No. DBI-0851881, respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Em termos globais, a cevada é considerada uma planta não-tóxico [1] que produz um grão de cereal que serve como uma base de malte na indústria cervejeira. É também um componente saudável de vários alimentos e bebidas (pão, sopas, guisados, cerveja, etc.) e quanto maior a forragem animal. Independente da sua textura, de 10 a 12 polegadas de comprimento folhas de cevada jovens, também referido como cevada verde, são ingeridos como uma infusão e também são preparados para o consumo humano, como pó seco. folhas de cevada jovens são recomendadas como um suplemento dietético devido ao seu conteúdo de vitaminas e minerais [2].

Estudos anteriores indicaram que os extractos dos grãos de cevada integrais apresentam efeitos anti-oxidantes e anti-proliferativa sobre o cancro colorectal humano Caco células -2 [3]. No entanto, a actividade anti-proliferativa dentro de folhas de cevada verde continua por ser elucidado. produtos de cevada verdes têm propriedades anti-inflamatórias e pode modular factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α) produção /libertação de células THP-1 por monócitos humanos [4]. Similarmente, outro estudo relatou que um composto isolado a partir de folhas verdes da cevada possuíam propriedades anti-oxidantes [5]. Além disso, moléculas pequenas (menos do que 1 kDa) purificado a partir de extracto de cevada verde (GB) inibiu a libertação de TNF-α a partir de células mononucleares obtidos a partir de doentes com artrite reumatóide (AR), sugerindo que a PT pode ser uma droga natural com anti-oxidante e anti- actividade inflamatória que alivia os sintomas de doentes que sofrem de RA [6]. estudos de purificação foram realizados utilizando métodos avançados para caracterizar os compostos específicos que são responsáveis ​​pelas actividades biológicas observadas de GB. Markham e Mitchell mostrou que a flavona-C-glicósidos, saponarin e lutonarin, a partir de folhas jovens de cevada verdes eram responsáveis ​​pelas propriedades anti-oxidantes [7]. Da mesma forma, a partir de biomassas plantas de cevada verdes possuem quantidades significativas das enzimas anti-oxidantes catalase e superóxido-dismutase, bem como a não-enzimática anti-oxidantes vitaminas C e E [8,9]. Consistente com estas observações,

in vivo

estudos envolvendo 36 indivíduos sugeriram que suplementos diários de folhas de cevada em combinação com anti-oxidantes vitaminas (C e E) diminuiu a lipoproteína de baixa densidade (LDL) -Vitamina conteúdo E e oxidação densa-LDL pequena inibido, consequentemente, reduzir alguns dos principais fatores de risco da aterosclerose e proteger pacientes diabéticos tipo 2 contra doenças vasculares [10]. Além disso, uma combinação de saponarin /lutonarin (4,5 /1 proporção) isolado a partir de folhas jovens de cevada foi encontrada para ter efeitos anti-oxidantes que eram comparáveis ​​com os obtidos a partir de α-tocoferol e hidroxitolueno butilado [11].

foi proposto que as atividades anti-oxidantes e anti-câncer em frutas e legumes são atribuíveis ao aditivo ou consequência sinérgica de sua mistura complexa de componentes fitoquímicos [12]. Além disso, a fracção total de polifenóis dentro arandos exibiu actividade anti-proliferativa mais eficiente em comparação com os seus componentes individuais, o que sugere um aditivo combinado ou influência sinérgica [13]. Além disso, vários estudos têm revelado que produtos vegetais podem atuar como agentes do ciclo celular supressora, interrompendo o início ou progressão fases de carcinogênese [14-17]. Além disso, constatou-se que os pacientes de câncer muitas vezes ingerem produtos vegetais, além de seus medicamentos prescritos [18] com base em uma suposição de que os produtos vegetais têm efeitos colaterais inócuos e são uma opção terapêutica bem estudado.

apesar da evidência do potencial da GB como um mediador anti-inflamatória, existe evidência insuficiente de a sua actividade anti-proliferativa e /ou citotóxica directa sobre as células normais ou transformadas. Neste estudo, procurou-se examinar a actividade anti-proliferativa e citotóxica dos GB em várias linhas celulares de leucemia /linfoma. Os nossos dados demonstram que GB tem efeito selectivo anti-proliferativa em várias células de leucemia /linfoma, com pouca ou nenhuma em células não-cancerosas. De quatro linhas celulares de cancro, células (Nalm-6) e amadurecer-B (BJAB) pré-B foram os mais sensíveis à atividade anti-proliferativa da GB. Pela primeira vez, o nosso estudo mostrou que GB levou à morte celular apoptótica induzida-por meio de libertação de TNF-α, caspase-8 e caspase-3 actividades, a PARP-1 de clivagem, PS translocação, do ciclo celular associada a fragmentação do ADN-prisão. Estes estudos fornecem suporte para a utilidade potencial da GB contra a leucemia /linfoma e justificar uma investigação mais sistemas de modelo animal.

Materiais e Métodos

extratos de cevada Green (GB) preparação

pó de cevada verde de folhas jovens de

Hordeum vulgare L.

, vendido comercialmente como um suplemento de ervas como uma fonte pró-ativa de vitaminas e minerais (vitamina Mundial; www.vitaminworld.com), foi utilizada. Desidratada pó GB foi ressuspensa com tampão fosfato salino (PBS; Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) a uma concentração de 10% w /v. As suspensões de pós re-hidratadas foram então expostas a três ciclos de congelamento /descongelamento consecutivos à temperatura de -80 ° C /quarto, respectivamente. Em seguida, as amostras foram sonicadas várias vezes (Vibra celular; Sonics and Materials Inc., Newtown, CT) a amplitude máxima de 40%, ~ 14 watts, utilizando um ¼ “microponta, por um impulso de ultra-sons 20 seg seguido por intervalos de repouso de 30 seg , durante sete ciclos sucessivos. Os tubos contendo as misturas foram mantidas em suspensão pré-arrefecida num banho de gelo-água durante todo o processo para evitar um aquecimento. Após centrifugação a 15.000 ×

g

durante 30 minutos, os sobrenadantes foram recolhidos e filtrada assepticamente, inicialmente através de poros de membrana de 0,45 pm, seguido por uma segunda filtração através de poros de membrana de 0,22 mícrons (Cole-Parmer, Chicago, IL). As amostras de PBS estéril sem GB foram utilizados como controlos. Além disso, o peso seco do material solúvel em GB foi medida para determinar a concentração de peso seco, em mg /ml, utilizado em cada tratamento. Três alíquotas de 1 ml a partir de ambas as amostras GB preparadas em PBS foram liofilizadas (liofilizador Labconco 4,5 L, Stanford, CA) durante a noite. Além disso, alíquotas de 1 ml de PBS por si só foram usadas para subtrair a contribuição PBS solvente, e calculou-se o peso seco. volumes típicos utilizados neste estudo e seus equivalentes peso seco de GB estão representados na Tabela S1

linhas de células e condições de cultura

Quatro /linhagens de células de linfoma de leucemia humana foram utilizados:. YT Natural Killer- como [19], madura-T leucemia linfoblástica aguda Jurkat [20], pré-B leucemia linfoblástica aguda Nalm-6 [21], e linfoma de Burkitt madura-B BJAB [22]. Para fins comparativos, uma linha de células de origem não-cancro, neonatal dérmica fibroblastos de prepúcio humano (HS27 HS27; ATCC, Manassas, VA), foi também incluído. O meio de cultura para a leucemia /linfoma (YT, Jurkat, Nalm-6 e BJAB) e células de fibroblastos (HS27) foram RPMI e DMEM (Hyclone, Logan UT), respectivamente. Ambos os meios de cultura foram suplementados com 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (Hyclone), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 0,25 ug /ml de anfotericina B (Lonza, Walkersville, MD). As células em crescimento exponencial, em cerca de 60-75% de confluência, foram contadas e semeadas em placas de 24 poços. As condições de incubação das células foram 37

° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. Para garantir uma elevada viabilidade, as células foram processadas como anteriormente descrito [23].

anti-proliferativa ensaio

células de leucemia /linfoma e não cancerosas foram semeadas em formato de placa de 24 poços a 1×10

5 células /poço e 1.25×10

4 células /poço em 1 ml de meio, respectivamente. Depois que as células foram expostas a 50 ul /ml de PT durante 96 h, o número de células por mililitro absoluto foi quantificado utilizando um microscópio invertido e uma câmara de Neubauer (hemocitómetro), para estimar a actividade anti-proliferativa em comparação com os controlos negativos não tratados. As células que crescem em suspensão foram homogeneizados directamente, e uma alíquota foi aplicada num hemocitómetro e contadas. Para as células HS27 aderentes, o sobrenadante contendo as células flutuantes (principalmente mortas) de cada poço foram colhidas em um tubo, ao passo que as células aderentes foram separadas por tripsinização, como anteriormente descrito [24]. De flutuação e as células aderentes foram homogeneizadas e contadas, tal como detalhado acima. Os resultados são expressos como a média das culturas em quadruplicado. Os controlos tratados com PBS, diluente da GB, foram normalizados para 100% e utilizado como referência para calcular a percentagem de proliferação das células-tratada GB.

A citotoxicidade monitorizado por corante vital propídio ensaio de exclusão com iodeto de

Para a quantificação da citotoxicidade, amostras de células foram colhidas, coradas com iodeto de propídio corante membrana impermeabilizante (PI) e monitorado no modo de células vivas

via

citometria de fluxo (Cytomics FC500; Beckman Coulter, Miami , FL). Este ensaio identifica células individuais PI-positivas com as membranas plasmáticas interrompidas que são consideradas as células mortas. Aproximadamente 10.000 eventos foram coletadas para cada amostra, e os dados foram analisados ​​conforme relatado anteriormente [25]. Como controlos citotóxicos /antiproliferativos positivos, as células foram expostas a 1 mg /ml de G418, um inibidor de síntese de proteínas. Além disso, como controlo negativo, as células tratadas com volumes equivalentes de GB diluente sozinho, PBS, e as células não tratadas foram incluídas nas culturas paralelas. A aquisição e análise de dados foi realizada utilizando software CXP (Beckman Coulter). Análise

ciclo celular através da medição do conteúdo DNA celular

A análise do conteúdo de DNA e do ciclo celular distribuição celular foi realizada por PI coloração e acompanhamento da sua fluorescência

via

citometria de fluxo. A influência da GB como um disruptor possível do ciclo celular foi investigada na linha de células BJAB assíncrono após 96 h de incubação. As células foram semeadas numa placa de 24 poços, cultivadas como descrito acima e colhidas como anteriormente descrito [24]. núcleos celulares foram preparados usando o kit de reagentes de ADN Prep-Coulter (Coulter Beckman) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram colhidas e centrifugadas a 262xg durante 5 min. O sobrenadante foi descartado e, em seguida, as peletes de células foram suavemente ressuspensas por vórtice a baixa velocidade usando 100 ul de lise de ADN-Prep e um reagente de permeabilização (detergente), seguido pela adição de 400 ul de ADN Prep reagente de coloração (50 ug /ml de PI e 4 kU /mL de RNAse). Subsequentemente, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente no escuro durante 60 min, seguido de análise de citometria de fluxo (LSRII; BD Biosciences, San Jose, CA). Como um controlo positivo para a paragem do ciclo celular, duas experiências independentes foram realizados em que as células foram expostas a 1 mg /ml de G418 e 80 nM de etopósido (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) durante 96 h. Como um controlo para efeitos não específicos, o diluente da GB, PBS (10 e 50 uL), tal como consta das amostras experimentais, foi incluído. As células não tratadas foram usadas como controlos. As percentagens de células com diferentes distribuições de conteúdo de ADN foram determinadas a partir do histograma com portões para sub-G0 /G1, hipodiploidia; G0 /G1, diplóide; S, hyperdiploid; e G2 /M, tetraploid. Gating foi aplicado para excluir dupletos. A população em fase S foi definida como a percentagem de células com um teor de ADN entre G0 /G1 (diplóide) e G2 /M (tetraplóides). Além disso, este tipo de análise foi utilizado para a sua capacidade para detectar um padrão de fragmentação de ADN associada a apoptose ao nível da célula individual, que se manifesta por um aumento na subpopulação de células sub-G0 /G1 [26]. Para deconvolute os histogramas de conteúdo de DNA, FACS Diva (BD Biosciences) ou FlowJo (árvore da estrela, Ashland, OR) software foi utilizado.

Análise de fosfatidilserina (PS) de distribuição em membranas celulares

Para investigar se a interrupção da assimetria de PS na membrana celular está envolvido como um mecanismo de morte celular induzida pela GB, as células foram monitorizadas

através de citometria de fluxo, após coloração dupla com anexina V-FITC e PI. As células foram semeadas em placas de 24 poços T a uma densidade de 100.000 células por poço em 1 ml de meio de cultura. Após incubação durante a noite, as células foram tratadas com 50 ul de GB ou controlo de PBS durante um período adicional de 48 h e 96 h, para células Nalm-6 e BJAB, respectivamente. As células foram colhidas, lavadas com PBS frio e processadas seguindo as instruções do fabricante (Beckman Coulter). Resumidamente, as células foram coradas com uma solução contendo uma mistura de anexina V-FITC e PI em 100 ul de tampão de ligação, incubadas em gelo no escuro durante 15 min, seguido pela adição de 400 ul de tampão de ligação gelado e imediatamente analisados

via

citometria de fluxo (Cytomics FC 500; Beckman Coulter). A percentagem total de células apoptóticas foi definido como a soma de ambas as fases precoce e tardia de apoptose (anexina V-FITC positivo), superior e inferior quadrantes direita num fluxo de citometria de gráficos de pontos, respectivamente. Para cada amostra, 10000 eventos foram recolhidos e analisados ​​utilizando o software CXP (Beckman Coulter). Cada ponto e controles experimental foram avaliados em quadruplicado.

detecção de células ao vivo de intracelulares caspase-3 ativação

proteases de cisteína-aspártico (caspase) -3 ativação no Nalm de 6 células tratadas com GB foi medida usando um NucView 488 Caspase-3 kit fluorogénico para células vivas (Biotium, Hayward, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células que exibem um sinal de fluorescência verde foram monitorados

via

citometria de fluxo (Cytomics FC500). As células foram semeadas em formato de placa de 24 poços como descrito acima e exposta durante 6 h e 8 h a 50 ul de extracto de GB. Vários controlos foram incluídos nesta série de experiências: células tratadas durante 8 h com extracto de GB foram expostas a 10? M de Ac-DEVD-CHO (DEVD; N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aldeído), um potente e específico e inibidor irreversível da caspase-3 [27], antes da adição de substrato NucView; células tratadas durante 8 h com 2 ug /ml de camptotecina, um indutor conhecido da apoptose

através

activação da caspase-3 [26], como um controlo positivo; e células não tratadas foram usadas como um controlo negativo. recolha e análise das células caspase-3-positivos dos dados foi realizada utilizando o software CXP.

análise Western blot de PARP 1-clivagem

A clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) foi avaliada por transferência de Western tal como descrito previamente [28]. Resumidamente, foram adicionados 50 uL ou de 100 uL GB a 1×10

5 Nalm-6 células em 1 ml de meio e incubou-se durante 24 h. Como um controlo positivo de indução de clivagem de PARP-1, utilizou-se 2 ug /ml de camptotecina. Um potente inibidor da caspase-3, Ac-DEVD-CHO (20 | iM), foi adicionado às células em simultâneo com GB para determinar a contribuição da caspase-3 em PARP-1 de clivagem. Quantidades iguais de os extractos de células, 100 ug de proteína por pista em tampão de Laemmli de redução, foram separados utilizando uma mistura 10% de mini-gel (Bio-Rad, Hercules, CA) para SDS-PAGE. As concentrações de proteína dos extractos celulares foram quantificadas com o kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL). Após a electroforese, as proteínas foram transferidas do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) como descrito anteriormente [29]. Em seguida, manchas de membrana de PVDF foram bloqueadas com 5% (w /v) de leite em pó desnatado em TBST durante 1 h. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo de coelho anti-PARP-1 (Cell Signaling, Danvers, MA) e de coelho anti-β-actina (Sigma, St. Louis, MO), diluído 1: 1000 e 1: 3000 com solução de bloqueio. Anti-PARP-1 detecta reagente de comprimento total de PARP-1 (116 kDa), bem como o seu fragmento grande (89 kDa). Em seguida, as proteínas marcadas imunologicamente com anticorpo primário foram hibridizados com a HRP-conjugado de cabra anti-coelho (diluição 1: 3000; Sigma). A mobilidade dos marcadores de pesos moleculares está especificado. As membranas foram tratadas com reagente de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, MA) e expostas a filmes de raios-x (Phenix, Candler, NC) para visualização banda de proteína. Fotografias dos filmes desenvolvidos foram capturados usando um sistema de documentação de gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

análise policromática do potencial de membrana mitocondrial (

Δ

Ψm)

Nalm-6 as células foram tratadas com 50 ul de GB e incubados durante 4 h, como detalhado acima. Em seguida, as células foram coradas com 2 | iM do fluoróforo 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC-1) seguindo as instruções do fabricante (Life Technologies, Grand Island , Nova Iorque). O rompimento de mitocondrial

ΔΨm

é evidenciado por uma mudança significativa do sinal de fluorescência de vermelho para verde. JC-1 agregados ou monômeros, emitindo sinal vermelho ou verde, foram identificados

via

fluxo citometria (Cytomics FC500), utilizando detectores de FL2 ou FL1, respectivamente. Como um controlo positivo um ionóforo de protões que dissipa o mitocondrial

ΔΨm

, cianeto de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP, 50 uM), foi usado. As células tratadas com o diluente GB (PBS) e células não tratadas foram usadas como controlos. A recolha e análise de dados foi realizada utilizando software CXP.

Luminex multiplex análise

Nalm-6 células semeadas em uma placa multi-poço foram expostos a 25 e 50 ul /ml de GB para 3 h antes de os sedimentos de células e sobrenadantes de meios de cultura foram recolhidos por centrifugação. Os sobrenadantes de cultura de células de cada amostra foram então analisadas para quantificar factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) e ligando Fas solúvel (SFAS-G) citocinas níveis, seguindo as recomendações do fabricante (Millipore, Billerica, MA). Além disso, os sedimentos celulares foram lavados com PBS e lisaram-se com a célula de MAP Milliplex sinalização tampão de lise contendo inibidores de protease (Millipore, Billerica, MA). quantificações de proteína foram realizadas utilizando o reagente BCA (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL). O kit MILLIPLEX MAP Src humana da família da quinase (Millipore, Billerica, MA) foi utilizado para detectar fosforilada Lck (Tyr394), Src (Tyr419), Fyn (Tyr420), preto (Tyr389) e Fgr (Tyr412), em 25 ug de um total de ligado celular de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. As proteínas alvo foram analisados ​​utilizando a tecnologia xMAP baseadas em esferas (perfilamento multianalitos) na plataforma Luminex 200 (sistema 3D FlexMAP; Millipore, Billerica, MA) juntamente com Xponent 3.1 software (Luminex, Austin, TX) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante (Millipore ). Cada ponto experimental e de controlo foram realizados em triplicado.

Detecção em tempo real de intracelular de caspase-8 activação

caspase-8 na activação Nalm-6 células foi determinada utilizando a célula permeável e irreversivelmente vinculativo caspase-8 inibidor marcado com f luoresceína, FITC-IETD-FMK, e monitorizada

através de citometria de fluxo [30]. As células em um formato de placa de 24 poços, cultivadas a uma densidade de 100.000 células por poço em 1 ml de meio de cultura de crescimento, foram expostas a 10 e 50 ul /ml de PT durante 4 h e subsequentemente incubadas com o reagente FITC-IETD-FMK , para fins de coloração, seguindo o protocolo do fabricante (Abcam, Cambridge, MA). Os seguintes controlos foram utilizados: 50 uL de extracto GB concomitantemente adicionada com o inibidor da pan-caspase Z-VAD-FMK (Abcam) a 20 pM, o que bloqueia a ligação de FITC-IETD-FMK; 2 mM de H

2O

2, como um controlo positivo para a caspase-8 de activação; 50? L de PBS como controlo do solvente; e células não tratadas como um controlo negativo. As distribuições celulares com sinal de fluorescência verde foram analisados ​​utilizando o detector FL-1. aquisição e análise das células caspase-8-positivo dos dados foi realizada utilizando o software CXP (Beckman Coulter).

A análise estatística

Cada ponto de dados foi realizada no mínimo três vezes. Para indicar variabilidade experimental, os dados foram expressos como a média com o desvio padrão correspondente. Bicaudal emparelhado de Student

t

-Testes foram realizados para estabelecer a significância estatística das diferenças entre amostras experimentais e seus controles correspondentes. Para denotar se as comparações de dois tratamentos têm significância estatística, um valor de

P Art 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

GB diminuiu a proliferação de células de leucemia /linfoma

Inicialmente, examinamos a atividade anti-proliferativa potencial da GB sobre o câncer e não células de origem do cancro por quantificação do número total de células após 96 horas. células /linfoma de leucemia tratados GB demonstraram uma redução estatisticamente significativa em seus números totais (

P Art 0,05; Figura 1). Após a normalização dos controlos tratados com PBS a 100%, foi calculada a percentagem de proliferação de células tratadas com PT. GB exercido um gradiente de inibição da proliferação de células de leucemia /linfoma, causando redução na proliferação de células de 73% em Nalm-6, 40% em BJAB, 34,5% em YT e 24,7% nas células Jurkat (Figura 1A-D). Curiosamente, esta actividade anti-proliferativa não afectou significativamente a proliferação das células não cancerosas HS27 (Figura 1E). Além disso, a linhagem B Nalm-6 e as células BJAB foram mais afectados (Figura 1A-B). Assim, estas linhas de células foram usadas em experiências adicionais para explorar o mecanismo subjacente GB toxicidade celular. Até agora, os nossos resultados sugerem que P possui uma actividade de supressão da proliferação celular preferencial de leucemia /linfoma.

O número total de células por mililitro (

Y

-axis) foram quantificados utilizando um hemocitómetro após 96 h de tratamento: (A), (B), BJAB (C) NK-YT, como células Nalm-6 (D) Jurkat e (e) HS27. Como um controlo positivo de um efeito anti-proliferativo, 1 mg /ml de G418 foi incluído. As células não tratadas foram utilizadas como um indicador da viabilidade celular durante todos os períodos de tempo de incubação. Controlos adicionais do diluente dos extractos, PBS, foram também examinados. Cada barra representa a média de quatro repetições e as barras de erro representam o desvio padrão. A proliferação celular, anotada de topo de 50 ul GB células tratadas, é mostrado como uma percentagem da proliferação celular de células tratados com PBS, que é considerada 100% de crescimento. Cinquenta ul GB em PBS é equivalente a 1,5 ± 0,048 mg /ml pó liofilizado.

GB induz citotoxicidade em pré-B leucemia /linfoma aguda Nalm-6 células

concomitante com o quantificação do número total de células, determinou-se a citotoxicidade induzida GB. Surpreendentemente, a citotoxicidade foi observada apenas em células Nalm-6, mas não em BJAB, YT, ou células de Jurkat (Figura 2A-D), implicando que a actividade anti-proliferativa observada não foi necessariamente associado com a citotoxicidade. Com a excepção de Nalm-6, a viabilidade das linhas celulares de leucemia /linfoma consistentemente se assemelhavam aos valores dos controlos de PBS-tratados ou não tratados (Figura 2). Do mesmo modo, também se observou uma falta de citotoxicidade em células não-cancerosas normais derivadas de (Figura 2E)

Após 96 h de incubação, foi observada toxicidade em (A) células Nalm-6.; enquanto que (B) BJAB, (C) YT, (D) e Jurkat (E) células HS27 não cancerosas eram resistentes a este efeito tóxico. As células foram coradas com PI e a percentagem de citotoxicidade (

Y

-axis) foi monitorizada utilizando um método de citometria de fluxo. Como um controlo positivo de actividade citotóxica, 1 mg /ml de G418, foi utilizado. As células não tratadas foram utilizadas como um indicador da viabilidade celular durante o período de incubação. O diluente do extracto GB, PBS, foi também analisada. Cada barra representa a média de quatro repetições e as barras de erro representam o desvio padrão. 1 x 10

4 eventos por amostra foram adquiridos e foram analisados ​​utilizando software CXP (Beckman Coulter). Cinquenta ul GB em PBS é equivalente a 1,5 ± 0,048 mg /ml pó liofilizado.

GB provoca a fragmentação do DNA e G2 /M prisão em células BJAB

análises de distribuição do ciclo celular foram realizadas para decifrar mais em pormenor o mecanismo que GB usa para inibir a proliferação celular. Para este fim, as células BJAB foram expostos a 10 e 50 ul GB durante 96 h e, em seguida, preparada para análise do teor de ADN celular

através de citometria de fluxo. Este método baseia-se sondas fluorescentes que se ligam ao DNA, permitindo, assim, todo o conteúdo de ADN por núcleo para ser monitorizado com precisão [31]. Foram observadas diferenças significativas na distribuição do ciclo celular em células tratadas com 50 ul de GB, enquanto que 10 ul de células tratadas com GB não exibiu alteração significativa na frequência de células de todas as fases do ciclo celular (Figura 3A-D). As células com ADN fragmentado apoptótica pode ser distinguido pelo seu teor de ADN hipodiploidia (sub-G0 /G1peak) durante a análise do conteúdo de ADN celular univariada. Os valores foram hipodiploidia aumentada para 11,8% em células tratadas com 50 ul de GB, enquanto que em amostras expostas a 10 ul GB, PBS ou controlos não tratados, os valores hipodiploidia eram menos do que 1% (

P

= 0,01173; Figura 3). O valor de G0 /G1 de 25,4% nas células tratadas com P foi significativamente reduzida (

P

0,04) em comparação com 40,1% e 39% para as células-PBS tratados e não tratados, respectivamente. As diferenças na frequência de células na fase S foram imperceptível. A percentagem de células na fase G2 /M sobre células tratadas com P foi de 43,7%, que foi mais elevada quando comparada tanto com as células que foram tratados com PBS, 37,5%, ou os controlos não tratados, 37,1% (

P

= 0,01945 e

P

= 0,02426, respectivamente).

Depois de 96 h GB induzida fragmentação do DNA apoptótica e /prisão fase G2 M em uma modalidade dose-dependente. As células foram colhidas, permeabilizadas e coradas e analisadas

via

citometria de fluxo. Cada barra representa a média de três replicados independentes, e as barras de erro representam o desvio padrão correspondente. (A-D) A percentagem de frequência de células é representada graficamente ao longo do

y

-axis, e os diferentes tratamentos são plotados ao longo do

x

-axis. (E-I) representativos histogramas de parâmetro único, onde quatro portões são anotados apresentando a percentagem de frequência de células em cada fase do ciclo celular. Gates, da esquerda para a direita: sub-G0 /G1 (hipodiploidia; contados como uma subpopulação de apoptose), G0 /G1 (diplóides), S (hyperdiploid) e G2 /M (tetraplóide). Esta série de experiências incluiu vários controlos: dois compostos que provocam a alteração do ciclo celular, (G) 80 nM de etoposido (ETO) e (H) 1 mg /ml de G418; (F) o diluente GB, PBS, tal como consta nas amostras experimentais; e (I), as células não tratadas (Unt), como um controlo negativo. A significância das diferenças entre os 50 ul células tratadas com P, em comparação com as células 50 ul de PBS-tratada, e também, com as células não tratadas, é de

P

0,03 (*) e

P Art 0,04 (‡), respectivamente. GB 10 ul = 0,3 ± 0,009 mg /ml, e 50 ul GB = 1,5 ± 0,048 mg /ml de pó liofilizado.

GB evoca externalização de fosfatidilserina em linhas de células B da linhagem

duas linhas de células de linhagem B foram expostos a GB discernir a sua indução potencial de fosfatidilserina (PS) externalização. Este foi monitorado

via

ensaio PI anexina V-FITC /e citometria de fluxo. Para determinar se a citotoxicidade GB exercida sobre células Nalm-6 também translocação PS composta, as experiências foram realizadas após 48 h de incubação com 50 ul de GB. Neste ponto de tempo, 37,2% das células estavam apoptóticas e 24,9% de e as células foram necrótico (Figura 4A). As células tratadas com 50 ul de PBS e as células não tratadas não apresentou um aumento substancial tanto em valores apoptóticas ou necróticas (Figura 4C-D). Além disso, o aumento da fragmentação de ADN apoptótico observada em células BJAB-tratados GB foi adicionalmente investigado sob as mesmas condições que foram aplicadas para a análise do ciclo celular. células tratadas com PT foram de 26,3% anexina V-FITC positivo, em contraste com 15.1 e 3,4% para as células de PBS-tratadas ou não, respectivamente; ambos os valores foram significativos com

P Art 0,05 (Figura 4A’-E ‘). As diferenças nos números de células necróticas, essencialmente, não foram detectados.