Sumário

cancro do ovário

epitelial é uma das neoplasias incidentes cada vez que é notório por causa de sua atitude evasiva para o diagnóstico precoce e altas taxas de mortalidade. cancros do epitélio do ovário são altamente dependentes da vasculatura patológica e Factor de Crescimento Endotelial Vascular é conhecido por ser um dos factores angiogénicos mais eficientes. Os polimorfismos do gene de VEGF, no presente estudo, foram avaliados para a associação com a malignidade e outros factores clínico-patológicos. 300 amostras de casos e 320 controles de status combinado idade e mensus foram inculcados no estudo. rs699947, rs833061, rs1570360, rs2010963, rs1413711 e rs3025039 foram os seis polimorfismos de nucleotídeo único que foram analisadas. A genotipagem foi realizada por reacção em cadeia da polimerase e polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição. rs 3025039 mostrou imensa promessa como um marcador para a agressão da doença e recorrência e um factor de mau prognóstico. rs699947 mostrou menos associação com a doença e fatores clínico-patológico estudado. rs833061, rs 1570360 mostraram associação significativa com alguns fatores clínico-patológicos, como a aflição bilateral dos ovários e pós operatórios níveis de CA-125. rs2010963 associada à presença de ascite em volumes mais altos. Os SNPs em análise não mostrou qualquer ligação formidável nas amostras de estudo. A análise de haplótipos (excluindo rs699947 e rs1413711) revelou 5 frontrunners estando presente em 85% da população com TGGC e CGCC associando de forma significativa como fatores de proteção e de risco, respectivamente. Estes haplótipos mostraram uma dose-dependente efeito aditivo da sua funcionalidade aparente. Este estudo é único e um primeiro de seu tipo realizada na população indígena do Sudeste Asiático

Citation:. Janardhan B, Vaderhobli S, Bhagat R, Chennagiri Srinivasamurthy P, Venketeshiah Reddihalli P, Gawari R, et ai. (2015) Investigando impacto do crescimento endotelial vascular fator de polimorfismos em cancros epiteliais ovarianos: Um estudo na população indiana. PLoS ONE 10 (7): e0131190. doi: 10.1371 /journal.pone.0131190

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN

Recebido: 27 de fevereiro de 2015; Aceito: 30 de maio de 2015; Publicação: 09 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Janardhan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho indiano de Pesquisa médica, Ref no: 5/13/28/2010-NCD-III. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário, a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas é a quinta causa mais comum de mortalidade em mulheres de raça caucasiana. Sobrevivência está diretamente relacionada ao palco com uma sobrevida em 5 anos de 93% para aqueles com diagnóstico de doença localizada, mas apenas 31% para aqueles com doença à distância. Infelizmente, dois terços dos pacientes apresentam doença distante no momento do diagnóstico. Na Índia, houve uma incidência baixa, mas um aumento constante na taxa de prevalência idade padronizada de câncer de ovário em 3% por ano em diferentes registros estaduais ao longo de um período de tempo [1].

A maioria dos ovário cancros (80-90%) são tumores ovarianos epiteliais (EOCs). A origem e patogênese da EOC de permanecer gallingly evasivo, em parte porque é raro encontrar lesões precursoras bem definidas, e em parte porque EOCs tendem a ter uma histologia complexa e heterogênea que desafia uma explicação biológica simples. A falta de métodos de rastreio funcional e a ausência de sintomas claros nas primeiras fases de progressão do tumor fez EOCs difícil de tratar com êxito. Paclitaxel (Taxol) e quimioterapia à base de platina (cisplatina ou carboplatina) representam terapia padrão após debulking cirúrgico. Infelizmente, mesmo com quimioterapia contemporânea, a maioria dos pacientes com recidiva da doença avançada e morrerão da doença.

Uma condição inevitável que se desenvolve em microambientes tumorais é hipóxia. Este é um importante fator estimulante para a angiogênese, o que é um fator de propulsão para neoplasias agressivas. Há vários fatores angiogênicos e ainda Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-A) tem sido apontado como a única molécula mais robusto no processo de angiogênese. O VEGF-A é segregada por muitas células tumorais in vitro e é altamente regulada positivamente na maioria dos cancros humanos. A expressão do VEGF-A correlaciona-se com a densidade de vasos intratumorais e mau prognóstico em pacientes de cancro e inibição é conhecido por diminuir a densidade de vasos do tumor e o crescimento do tumor [2, 3].

O VEGF-A gene está localizado no cromossoma 6p12 e inclui uma região de codificação de 14-kb, consiste em oito exões e exibe splicing alternativo de modo a formar uma família de proteínas. O VEGF-A gene contém hipóxia Responsive Elements (HREs) em seus 5`and 3`UTRs. O VEGF-A é regulada positivamente em condições de hipoxia pela ligação de HIF-1 (inducible factor hipóxia -1) para o HRE [4]. A hipoxia também medeia a estabilização do ARNm de VEGF-A através da ligação de factores não identificados, a sua 3`UTR. O VEGF-A também é modulada por uma variedade de factores de crescimento e citocinas. Assim, o gene está sujeita a modulação de vários níveis de expressão sob hipoxia [5]. O gene é altamente polimórficos e muito poucos estudos têm mostrado alguns dos SNPs para modular a expressão de genes e induzem níveis de VEGF-A plasmáticas mais elevadas.

Muitos estudos têm investigado o papel dos polimorfismos VEGF-A como um determinante genético para a suscetibilidade e evolução de mama, próstata, não-pequenas células do pulmão Carcinoma (NSCLC) e cancro colorectal. Globalmente, vários estudos sobre a associação destes polimorfismos com desfecho de risco e tratamento foram realizados, mas os resultados obtidos entre diferentes raças e tipos de câncer foram muito variável. Por exemplo, o rs3025039 alelo ‘T’ transmitido proteção contra o câncer de mama, mas por outro lado, o aumento do risco de câncer colorretal. Da mesma forma, o rs2010963 alelo ‘C’ previu maior risco de CPNPC e câncer de próstata, mas previu redução do risco de cancro do cólon, [6]. A falta de consenso sobre o papel destas SNPs poderia ser por causa da sua ligação com outros factores obscuras ou porque tais SNPs modular a expressão do gene, como um todo, o que tem várias isoformas que incluem ambas as isoformas pro e anti-angiogénicos que fazem um dois modulação de direcções viável por estes SNPs. Talvez, a associação com haplótipos será mais preditivo do que SNPs individuais. Maior compreensão da funcionalidade desses polimorfismos e seu papel na biologia do tumor é essencial para discernir os motivos para inconsistências na literatura, o que também pode ajudar na elaboração de estudos de associação no futuro.

Polimorfismos incluídos neste estudo são rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963, rs1413711 e rs3025039 e são comumente conhecidos como VEGFA-2578 A /C, -1154G /A, -460 C /T, 405 L /C, 674 C /T e 936 C /T, respectivamente. VEGFA-2578 A /C é chamada após a sua posição relativamente ao local de início da tradução (-1540 pb em relação ao local de início da transcrição), e está localizado na região promotora. Do mesmo modo 405 G /C também é conhecido como -634 G /C. Os nomes de outros polimorfismos baseiam-se nas posições relativas ao início da transcrição (-460, 405) ou extremidade (936) local, e, assim, estes estão localizados SNP no promotor, 5 ‘não traduzida (UTR) e 3’ -UTR regiões, respectivamente. 674 C /T está presente na região do intrão 1 do gene. Os SNPs no presente documento são referidos com os respectivos números de identificação dbSNP. Estes SNPs são em estreita proximidade com a região de HRE e a sequência de sinalização do péptido no gene. Isso os coloca no centro das atenções para as possibilidades de modulação da expressão do gene, dependendo do alelo presente.

Os 6 polimorfismos do VEGF-A do gene foram incluídas em nosso estudo de caso-controle de câncer epitelial de ovário com o objetivo de investigar o papel das variações genéticas como ferramentas de diagnóstico ou prognóstico e sua correlação com o estado da doença e fatores clínico-patológicos. Nós apresentamos um primeiro tal população empregando investigação do subcontinente indiano do Sudeste da Ásia.

Resultados

Associação dos polimorfismos com doença

Os seis polimorfismos genotipados em 300 casos e 320 controles foram todos encontrados em Hardy-Weinberg equilíbrio. A distribuição alélica e de associação é mostrado nas Figuras 1 e 2, em termos de OR e intervalo de confiança de 95%. rs 1570360, rs 833.061, rs 2010963 e 3025039 rs exibiram associação muito forte (p valor 0,001) com o estado da doença. rs 1413711 apresentaram associação significativa com a doença, bem como (valor p 0,01). rs 699,947 não mostrou associação com a condição de doença na coorte de estudo. A distribuição genotípica dos SNPs é mostrado na Figura 3 e uma avaliação, sob ambos os modelos dominantes e recessivos para a associação foi computado. Entre os modelos testados, o modelo dominante apresentou maior significado de associação com a doença (dados apresentados na S1 Tabela).

Associação dos polimorfismos com malignidade e outros fatores clínico-patológicos

Um total de onze fatores clínico-patológicos foram incluídos no estudo como a idade no momento do diagnóstico, estado menstrual, estágio FIGO, grau, histopatologia, aflição bilateral dos ovários, pré-operatórios de plasma CA-125 níveis, tipo de tumor , a presença ou ausência de ascite, presença ou ausência de doença residual e recorrência dentro de um período de um ano da cirurgia pós-operatório. (S2 Tabela alista os fatores clínico-patológicos incluídos no estudo). níveis de CA125 pós-operatório também foram avaliadas para a associação com os polimorfismos para correlacionar com prognóstico ao lado de recorrência, embora os dados para todas as amostras não puderam ser recuperados. No entanto, um teste de associação foi feito por subconjunto de dados disponível. Em uma análise de associação para toda a coorte caso entre os polimorfismos e fatores clínico-patológico, SNPs rs rs 699947 e 1.413.711 não mostrou associação com a malignidade ou doença status. Todos os outros SNPs mostraram associação significativa com a malignidade com um valor de p 0,001. A tabela 1 resume os resultados obtidos para a associação do polimorfismo com cada um dos fatores clínico-patológicos.

Os dados de ligação e associações de haplótipos

Não foi possível observar qualquer ligação significativa entre qualquer um dos polimorfismos (Fig 4). Embora rs1413711 e rs3025039 exibem uma medida justa de ligação com um D ‘valor de 0,605, mas é muito aquém do padrão cortado assumido no D’ de 0,8 ou mais. Avaliando os haplótipos incluindo todos os SNPs não deu qualquer precursor clara. Quando uma análise de haplótipos foi executado excluindo rs699947 e rs1413711, um conjunto de 5 haplótipos de 16 gerada através FASE tinha uma frequência de 5%. Os haplótipos em análise incluiu a rs833061 SNPs, rs1570360, rs2010963 e rs3025039. TGGC (37%), CGGC (19%), CGCC (9%), TGCC (12%) e TAGC (8%) são responsáveis ​​por 85% da população do estudo. Tabela 2 supõe estes haplótipos, a sua frequência nas coortes de caso-controle e o valor-p associação testado destes haplótipos com a doença. Destes TGGC foi observado em 50% da população total em controlos, mas apenas 24% nos casos e significativamente associada como um factor de blindagem. CGCC foi observada a ser de 11% em casos mas apenas em 6% nos controles e associado significativamente com o estado da doença.

Impacto da haplótipos na agressão da doença e malignidade

os haplótipos acima mencionados foram examinados por qualquer associação com a agressividade da doença e malignidade. Haplótipo TGGC associado de forma muito significativa como um fator de proteção (valor de p 0,001) na sua condição homozigótica. A condição TGGC heterozigotos não apresentaram qualquer impacto ou associação. CGCC associado significativamente com a malignidade (valor de p 0,0198). Observou-se também que grande potencial maligno foi observada em portadores de haplótipos CGCC no seu estado homozigótico heterozigosidade mas não teve qualquer impacto significativo. Isto dá origem à noção de que os haplótipos TGGC e CGCC pode ter uma cópia-número ou dose de efeito dependente. Observamos que hospedam os pacientes a CGCC apresentaram maior incidência de presença de ascite 500ml (significância estatística não alcançado) e superior plasma CA-125 níveis pré-operatórios (valor p 0,017). Hosts para haplótipos CGCC e CGGC também exibiu uma maior propensão à doença agressiva e malignidade. Tabela 3 dá uma visão geral das frequências de haplótipos em sua homozigotos e heterozigotos condições e sua associação com a ocorrência da doença é matriculou com correção de Yates aplicada. Não houve associação observada entre qualquer um dos haplótipos com recorrência da doença dentro de um período de um ano, nem foi associado com o estado de doença residual no estudo atual.

Discussão

A necessidade de um sistema de suporte vascular é essencial para o crescimento, seja células tumorais ou as células normais. Tumor angiogênese é um evento primário que preenche esta necessidade sem a qual as células tumorais não pode crescer além de 2 mm e ficar dormente [7]. Um equilíbrio complexo entre os fatores pró e anti-angiogénicos é necessário para a angiogênese saudável. EOCs, sendo dependente da angiogênese, exigem um interruptor angiogênico que inclina o equilíbrio favorecendo a angiogênese [8]. No cancro do ovário avançado, VEGF-A angiogénese patológica induzida leva à produção de ascite maligna e uma eventual progressão da doença e o insucesso do tratamento. Uma pletora de SNPs no gene VEGF-A tem sido descoberto que têm sido associados a modulação dos níveis de VEGF-A expressão da proteína e da susceptibilidade a vários carcinomas [9-13]. Estudos interrogar o efeito de polimorfismos e testar a sua validade como marcadores prognósticos ou fatores de risco são muito poucos ea maioria deles em corridas caucasianos. Estudos realizados com o subconjunto asiática são escassos.

Entre os poucos estudos em cancros do ovário, foi observada rs3025039 a ser associada como fator de risco em um estudo [14] e foi associada com melhor prognóstico em outro estudo [15] . Nosso estudo implicado o SNP com mau prognóstico e fator de risco, como no estudo anterior. rs2010963 associado fortemente com melhor prognóstico, mas fraca associação em caso de rs803361 [16]. O estudo também mostrou que a zygosity realizada significado prognóstico independente. Um estudo incluindo rs2010963, rs1570360 e rs699947 indicaram nenhuma associação significativa dos polimorfismos com os parâmetros clínico-patológicos, mas associada com alteração significativa de VEGF-A expressão, mas nenhuma associação com sobrevida livre de progressão e prognóstico e sugeriu significativo desequilíbrio de ligação entre esses polimorfismos [17 ]. A análise de haplótipos no estudo não mostrou associação significativa com os parâmetros clínico-patológicos, embora um de seus haplótipos AGCGC (rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963 e rs3025039) mostrou associação significativa com a sobrevida livre de progressão.

O SNPs em nossa estudo que exibiu forte associação com o estado da doença, não mostrou qualquer ligação significativa entre si, conforme relatado em vários outros estudos [18-22]. Vários dos SNPs incluídos mostraram associação significativa com determinados parâmetros clínico-patológicos. rs3025039 mostrou associações significativas com potencial maligno, estádios da FIGO, aflição bilateral, os níveis de CA125 plasma pós-operatório, ascite e recorrência indicando que ele seja marcador promissor para mau prognóstico. rs1413711 e rs2010963 associado significativamente com a presença de ascite, mas significância não foi visto com níveis aumentados de ascite. rs833061 associado com aflição bilateral dos ovários e ainda mais fortemente dentro do subconjunto maligna de amostras de casos. rs699947 não mostrou associação com o estado da doença ou outros parâmetros clínico-patológicos.

A ambiguidade em dados de polimorfismo entre as populações poderiam ser parcialmente explicada em termos das posições desses polimorfismos bem relatados e as isoformas de VEGF-A, que são conhecidos por serem anti-angiogénico. Tanto quanto um interruptor angiogénico ocorre em favor da angiogénese, no caso de a tumorigénese, há também um mecanismo de auto-regulação em relação ao VEGF-A gene que mantém um bom equilíbrio entre o pro- e anti-angiogénicos isoformas do VEGF gene -A.

Exon 8 do VEGF-a gene tem uma capacidade única de produzir ambas as isoformas pró e anti angiogénicos de VEGF-a. Enquanto exão 8a confere pró-angiogenecity, exão 8b confere anti-angiogenecity. O splicing alternativo de ARNm que produz com 8b codões produzir todo um conjunto de isoformas de VEGF-A, que são contraditórias completamente os efeitos do ARNm de subconjuntos 8a. Perrin et ai relataram que a expressão do VEGF-A

sub XXXb isoformas contribuir para a inibição competitiva por ligação aos receptores, mas não estimular a fosforilação da tirosina essencial para a actividade angiogénica como a jusante é causada por VEGF-A

sub XXXa isoformas. O VEGF-A

sub XXXb isoformas são, portanto, agentes anti-angiogénicos endógenos formados por splicing alternativo e são ditos ser influenciados por outros factores de crescimento e condições disponibilidades do factor de splicing. O VEGF-A

sub isoformas foram relatados para ser sub-regulada em diversos cancros, tais como carcinoma de células renais, da próstata e do carcinoma do cólon [23-25].

Este aspecto particular do VEGF-A splicing e produção isoforma alternativo é definitivamente um estudo detalhado uma vez que estudos exploratórios sobre SNPs em todo o mundo ainda não produziu um consenso de que os dados é implicative. Parte do motivo para esta condição é a variação in vivo em doentes com cancro. EOCs são ainda mais complicada, pois um relatório recente mostrou que eles sejam de mais origens mistas em vez de apenas epitélio [26] superfície. Este mileu Invivo heterogéneo torna a modulação do VEGF-A expressão do gene altamente complexa.

Os rs SNPs 699947, 833061 rs rs e 1550360 na região promotora são comuns tanto para o VEGF-A

XXXa e VEGF -A

isoformas xxxB e, portanto, uma associação desses SNPs com a doença pode significar tanto maneiras. Um deles, que poderia concordar que as isoformas pró-angiogénicos estão cada vez mais expressa ou também pode significar que as isoformas anti-angiogénicos estão sendo suprimidas. SNP RS 2010963 está dentro da região de 5 ‘UTR. O VEGF-A gene é único no facto de que tem uma região 5’UTR 1038bp que tem 2 IRES (locais internos de entrada do ribossoma (IRES) Elementos-A e B-IRES) que é diferencialmente posto em uso, dependendo das condições intracelulares de normóxia e hipóxia [27]. Por isso, o efeito de RS 2010963 poderia girar indistinta considerando o facto de que uma nova forma longa de ARNm de VEGF-A (com uma sequência de ácido amino adicionado 180) é produzido que modula a expressão adicional de ARNm de VEGF-A. rs 1413711 é, incluídos neste estudo, não é bem estudada como os outros polimorfismos, mas é ainda vale a pena assistir, sendo na região do intrão 1. Em nosso estudo, não exercer qualquer associação significativa com os fatores clínico-patológicos porém foi associado com uma importância considerável (p = 0,01) com o estado da doença. SNP RS 3025039 está bem documentada, sendo na região 3 ‘UTR do gene de VEGF-A. É conhecido para influenciar os níveis segregados de proteína VEGF-A e tem sido demonstrado que têm uma associação significativa na maior parte dos estudos de caso-coorte. Este SNP, em nosso estudo também exibiram muito forte associação com o estado da doença e pior prognóstico.

Este estudo de investigação é o primeiro em sua tentativa nessa população e, em resumo mostra rs3025039 a ser associada como um marcador altamente promissor para prognóstico, enquanto outros polimorfismos no estudo foram associados com alguns parâmetros clínico-patológicos e não foram conclusivos sobre suas capacidades de prognóstico. Os polimorfismos mostrou uma forte associação com a malignidade e, portanto, podem estar implicados como factores de risco. Este sumariamente é o único papel que aborda o efeito de polimorfismos VEGF-A em câncer epitelial de ovário na população do Sudeste Asiático, especificamente pan-indiana.

Materiais e Métodos

Coleta de amostra

Um total de 300 pacientes diagnosticados com tumores ovarianos epiteliais primários no Kidwai Memorial Institute of Oncology, Bangalore, Índia, foram incluídos no estudo.

o diagnóstico institucional inicial de câncer epitelial de ovário foi confirmada por revisão das lâminas patológicos por patologistas seniores. Dos 300 casos, 202 (67,3%) eram casos malignos, 31 (10,3%) eram potenciais (LMP) tumores borderline ou baixa malignos e 67 (22,4%) eram tumores benignos. Destes, o número de amostras pré-mensus situou-se em 88 (29,3%) e de pós-mensus amostras em 212 (70,7%). 320 indivíduos de controle saudáveis, pareados por idade e estado de menopausa, foram recrutados para o estudo. A idade média dos casos de coorte foi de 51 ± 12 anos e 48 ± 17 anos para controles. 30,9% (99/320) dos controlos foram pré-menopausa e 69,1% (221/320) foram pós-menopausa. 65,8% dos casos eram elevados palco e alto grau, e 63,8% dos casos eram cancros do ovário epiteliais serosa. 64,9% dos casos teve aflição bilateral e 86,6% dos casos apresentaram níveis elevados de CA125. A ascite foi observada em 80% dos casos. Tabela S2 na dá uma visão em detalhe da demografia dos casos levados em estudo. 5 ml de sangue foi coletado de todos os sujeitos, antes do tratamento, em VACUTAINERS heparina e processado imediatamente após a mesma. O sedimento celular foi armazenado em -20 ° C para o isolamento de DNA e genotipagem.

Todos os tumores foram classificados de acordo com critérios da OMS e encenado acordo com a Federação das Associações de Ginecologia e Obstetrícia classificação (FIGO). As informações sobre o diagnóstico de câncer, o estágio da doença (FIGO), grau histológico e subtipo, operativas níveis pré CA-125, doença residual e recorrência foram extraídos dos registros médicos.

aprovação do estudo foi dada pelo Conselho de Revisão Institucional e do Comissão de Ética médica e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

isolamento de ADN

DNA genômico foi extraído de amostra de sangue periférico usando kits de extração de DNA QIAamp® (QIAGEN), conforme o protocolo do fabricante. concentração de ADN foi medida por NanoDrop de Thermo Scientific.

A genotipagem

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) foi utilizado para determinar os polimorfismos 6 VEGF-A, utilizando protocolos previamente publicados com pequenas modificações.

A PCR foi realizada numa mistura reaccional de 30 ul com DNA molde 50-100ng, 1U de Taq enzima polimerase (Bangalore Genei) e 1X tampão fornecida juntamente com a enzima. 0,3 uM de iniciadores respectivos (Sigma), 0,5 mM de dNTP mix e 1,5 a 2 mM MgCl

2 constituído a mistura de PCR. A PCR foi realizada num termociclador Eppendorf PCR com uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 minutos seguido de 35-40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 40 segundos, emparelhamento durante 40 segundos, extensão a 72 ° C durante 20 -40 segundos e uma extensão final durante cinco minutos a 72 ° C. Os iniciadores de PCR e as respectivas temperaturas de emparelhamento usados ​​para cada SNP, listados na Tabela 4.

Os produtos de amplificação de ADN obtidos foram digeridos durante a noite com a enzima de restrição. As enzimas de restrição foram adquiridas da New England Biolabs e condições de temperatura de restrição seguido o protocolo do fabricante. As enzimas utilizadas foram BglII (rs699947), BstUI (rs833061), MnlI (rs1570360), BsmFI (RS 2010963), BaeGI (RS 1413711) e NlaIII (rs3025039). BstUI foi utilizado a uma concentração de 2U, enquanto o resto das enzimas foram usadas numa concentração 1U num volume de mistura reaccional de 25 ul. Os fragmentos amplificados digeridos foram separados num gel de brometo de etídio de 1,5 a 3% de agarose de acordo com o tamanho do fragmento amplificado. Os tamanhos da banda foram verificados com o uso de uma escada de 50 pb e 100 pb.

Linkage, haplótipos e análise estatística

A análise de ligação e de haplótipos foi realizada utilizando haploview 4.2 e fase 2.1.1 versão. O χ

2 de teste foi aplicada para determinar se as distribuições de genótipo foram dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. qui-quadrado e análises de regressão logística foram aplicados para analisar associação entre o transporte de marcadores e o estado da doença e outros fatores clínico-patológicos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 21.

Informações de Apoio

S1 Table. Uma análise dos polimorfismos sob os modelos dominantes e recessivos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0131190.s001

(DOC)

S2 Table. Demografia e aspectos clínico de casos (total 300)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0131190.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Estamos gratos aos pacientes com cuja cooperação deste estudo foi possível. Agradecemos Dr. V. Shanmugam, Ms. Lakshmi Subramaniam e Ms Anisha Raju para os seus insumos e assistência na análise de dados valiosos.