Abstract

O ativador de plasminogênio uroquinase receptor (uPAR) desempenha um papel na progressão do tumor e tem sido proposto como um alvo para o tratamento de cancro. Recentemente, descreveu o desenvolvimento de um novo anticorpo monoclonal humanizado que tem como alvo uPAR e tem actividade anti-tumoral em vários modelos de tumor de xenoenxerto em animais. Este anticorpo, ATN-658, não inibe a ligação do ligando (i.e. do uPA e vitronectina) a uPAR e o seu mecanismo de acção permanece pouco claro. Como um primeiro passo na compreensão da actividade anti-tumoral de NTA-658, que previsto para identificar o epitopo em que a uPAR ATN-658 liga-se. Guiados por comparações entre primatas e humanos uPAR, estudos de mapeamento de epitopos foram realizadas utilizando várias técnicas ortogonais. local sistemática dirigida e mutagénese de varrimento de alanina identificaram a região do aa 268-275 de uPAR como o epitopo para ATN-658. Nenhuma função conhecida tenha sido previamente atribuído a esse epitopo percepções estruturais para reconhecimento do epítopo foram obtidos a partir de estudos estruturais do fragmento Fab de NTA-658 ligado a uPAR. A estrutura mostra que a RTA-658 liga-se ao domínio DIII de uPAR, perto do terminal C do receptor, corroborando os resultados de mapeamento de epitopos. Curiosamente, quando ligado a uPAR, a região determinante de complementaridade (CDR) de regiões de NTA-658 imitam de perto as regiões de ligação do CD11b integrina (αM), um ligando de uPAR previamente identificado pensa estar envolvida em leucócitos de rolamento, a migração e a fixação do complemento com nenhum papel na progressão tumoral de tumores sólidos conhecidos. Estes estudos revelam um novo epitopo funcional no uPAR envolvidos na progressão tumoral e demonstrar uma estratégia previamente não reconhecido para o direcionamento terapêutico de uPAR

Citation:. Xu X, Y Cai, Wei Y, Doe F, Juarez J, Parry L, et ai. (2014) identificação de um novo epitopo uPAR como um alvo para o cancro do Therapeutic Monoclonal Antibody ATN-658, um homólogo estrutural do uPAR de ligação integrina CD11b (αM). PLoS ONE 9 (1): e85349. doi: 10.1371 /journal.pone.0085349

editor: Francesco Bertolini, Instituto Europeu de Oncologia, Itália |

Recebido: 10 Abril 2013; Aceito: 04 de dezembro de 2013; Publicação: 21 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi suportado por concessões do NIH (HL086584) para MH, NCI (CA125564), para Harold Chapman (YW) e (CA151461) a (TVO e APM) e ea Fundação H e Breast Cancer Foundation Lynn Sage (APM). Este trabalho foi apoiado pelos serviços da biologia do tumor Núcleo (TBC), da Universidade Northwestern que beneficia de apoio filantrópico do Robert H. Lurie Cancer Center e da Química da Vida Processos Institute. dados de raios-X para este estudo foram medidos a beamline × 29 da Fonte Nacional de Luz Síncrotron e na APS SER-CAT beamline 22ID. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações. Fernando Doe, José Juarez, Graham Parry e Andrew P. Mazar foram empregadas pela Attenuon no momento do estudo. Andrew Mazar e Thomas O’Halloran tem participação acionária e Andrew Mazar recebe honorários de consultoria da Tática Pharma, uma empresa start-up, que agora detém os direitos de ATN-658. Andrew Mazar é um inventor sobre a patente emitida para ATN-658. Várias patentes americanas têm emitido cobrindo ATN-658, bem como o epítopo. Estas patentes são US # 8101726 “ligandos de ligação do complexo do ativador do tipo uroquinase plasminogênio (UPA) e seu receptor (uPAR) que inibem interações uPAR jusante: identificação e utilização em diagnóstico ou terapia” (Parry e Mazar) e US # 8105602 “uroquinase tipo de epitopo do receptor do activador de plasminogénio, anticorpos monoclonais derivados do mesmo e métodos de utilização do mesmo “(Parry e Mazar). Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

metástase e compartilhar a angiogénese muitas características comuns fenotípicas que levam à invasão e migração de células endoteliais e de tumor. Estes incluem a sobre-regulação de protease e a expressão da integrina, a perda de célula-célula e célula-matriz contactos, um aumento na capacidade de resposta aos factores de crescimento e de diferenciação, e a remodelação da matriz extracelular (ECM) e a membrana basal (BM) [ ,,,0],1], [2]. O sistema de urocinase do activador de plasminogénio (uPA), composta por uPA, um receptor de superfície celular específico de uPA (uPAR), e serpina inibidores de uPA, tais como activador de plasminogénio de inibidor-1 (PAI-1), desempenha um papel central em muitas destas actividades de [3] – [6]. A actividade deste sistema é responsável por iniciar cascatas que resultam na activação de plasminogénio e vários pro-metaloproteases (proMMPs) [7], [8], a libertação e o processamento de factores de crescimento latentes depositados na matriz extracelular, tais como FGF-2, VEGF, HGF, e TGF-β [9] – [12] e remodelação componentes da ECM, tais como vitronectina e fibronectina [13], [14]. Estas actividades são geralmente mediados pela função proteolítica do uPA quando ligado a uPAR, pode ser modulada por inibição da uPA por PAI-1, e ocorrem no ambiente extracelular. Além disso, uPAR também interage com muitos outros ligandos, além de uPA incluindo várias integrinas tais como α5β

1, α3β

1, e α5β

3 [15] – [17], bem como outras células ligandos de superfície e de ECM, incluindo vitronectina e receptores acoplados à proteína G [6]. Várias destas interacções foram demonstrou ser importante para a sobrevivência das células de tumor, invasão, angiogénese e [6], e envolvem sinalização uPAR-dependente.

Por estas razões, uPAR tem sido proposto como um alvo terapêutico para o tratamento de cancro. No entanto, apesar de uma abundância de literatura que demonstra a importância de uPAR na progressão da maioria dos tumores sólidos, incluindo cancro da mama [18], do cólon [19], da próstata [20], pancreático [21], do ovário [22], do pulmão [23] , e cérebro [24], bem como várias doenças malignas hematológicas, tais como leucemia e mieloma aguda [25], não uPAR alvo agente terapêutico tem sido desenvolvido ou cancerosas avaliadas em ensaios clínicos até à data. Uma série de anticorpos que inibem directamente a ligação do uPA para uPAR foram propostas e testadas em estudos pré-clínicos, mas a maioria destes só demonstraram actividade antitumoral modestos e, portanto, nunca foram avançada para a clínica

.

Recentemente, Foram identificados e desenvolvido um novo anticorpo monoclonal de uPAR alvo que demonstra efeitos anti-tumorais sólidas num número de diferentes modelos de tumores animais, mas não bloqueia a ligação do uPA para uPAR [22], [26] – [28]. Este anticorpo, ATN-658, tem vários atributos únicos que o diferenciam de uPAR anterior direcionados abordagens. Uma característica fundamental é que ATN-658 é que ele não bloqueia a ligação do uPA para uPAR e é capaz de se ligar a uPAR, mesmo quando é ocupado por uPA, mas não obstante, inibe a migração e invasão

In vitro

[22] , [27]. RTA-658 não tem qualquer efeito sobre uPA mediada por activação do plasminogénio, mas tem um certo número de efeitos sobre vias de sinalização e a expressão de vários genes implicados na progressão do tumor, quando avaliado em modelos de próstata e cancro do ovário

In vitro

e

in vivo

[22], [27]. Uma das observações mais marcantes com NTA-658 é que a segmentação farmacológica de uPAR por este anticorpo conduz a efeitos antitumorais robustos numa vasta gama de modelos de xenoenxerto de tumor sólido [22], [26] – [28]. efeitos anti-tumor foram observados independentemente da histologia do tumor nestes modelos e em adição à inibição de metástase

In vivo

, como seria previsto para um agente direccionado uPAR, ATN-658 também é capaz de inibir a proliferação do tumor e induzir apoptose [22], [26], [28]. No entanto, a base estrutural e mecanicista para estes efeitos antitumorais permanecem obscuros.

A fim de resolver esta questão, que caracterizou o epitopo em uPAR a que ATN-658 liga-se. O epitopo para ATN-658 foi inicialmente mapeada usando (espectrometria de massa /D de permuta H, ExSAR) mutagénese dirigida ao local e confirmada por uma técnica de espectrometria de massa de troca de deutério romance. Este epítopo foi determinada como sendo um epitopo para o qual nenhuma função no uPAR foi previamente descrito. Além disso, determinou-se as estruturas cristalinas do fragmento Fab ATN-658 sozinho e em complexo com uPAR, o terminal amino (domínio de ligação de uPAR) do uPA (ATF), e o domínio B somatomedina (SMB) de vitronectina. A RTA-658 Fab liga-se ao DIII de uPAR, consistente com os resultados de mapeamento de epitopos. O epitopo de uPAR por RTA-658 está próximo do terminal C, e não tem qualquer sobreposição com a uroquinase e locais de ligação de vitronectina. Este estudo também revelou homologia estrutural entre o ATN-658 laços CDR eo uPAR região de ligação da integrina αM. Além disso, mostrámos que bloqueia a ligação ATN-658 a associação de outra integrina, α5β1, para uPAR e assim prejudica a ades mediada pela integrina-α5β1 a matriz extracelular. Estes resultados sugerem um mecanismo previamente não reconhecido pelo qual uPAR pode funcionar na progressão tumoral e um epitopo de novo para o direcionamento terapêutico deste receptor.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

linhas de tumor humano PC-3 (adenocarcinoma da próstata), HeLa (carcinoma cervical), e linha celular de cancro do pulmão humano H1299 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio mínimo de Dulbecco modificado de Eagle suplementado com soro de bovino fetal a 10% e penicilina-estreptomicina. Rato linha celular de tumor de B-16 (melanoma), osteossarcoma cão (D-17) e imortalizadas Africano macaco verde (AGM) células de rim foram verificados (COS-1) para expressar uPAR por RT-PCR e transferência de Western utilizando um anticorpo policlonal de coelho uPAR antisoro (rD2D3) conhecida para reagir de forma cruzada com uPAR a partir de várias espécies como previamente descrito [29]. células que expressam uPAR foram então utilizados para avaliar a capacidade de NTA-658 para reagir de forma cruzada com uma variedade de uPAR não-humana. Ambos uPAR solúvel recombinante (suPAR, resíduos 1-277) e (resíduos de aminoácidos 1-143 de ATF do uPA) foram produzidos em células S2 de Drosophila como proteínas segregadas

E.Coli

[31].

Caracterização do anticorpo monoclonal ATN-658

ATN-658 foi criado contra um fragmento chymotryptic de solúvel uPAR (suPAR) compreendendo DIIDIII (aa 88-283 da madura uPAR), expresso em

Drosophila

As células S2, usando técnicas padrão. Resumidamente, ratinhos Balb /c foram imunizados com fragmentos suPARDIIDIII conjugado com KLH e a magnitude da resposta imune monitorizada por ELISA. Com base nestes dados, os hibridomas foram gerados por fusão de células de baço com a linha de células de mieloma P3x63Ag8.653. reservas congeladas de 10 hibridomas parentais foram feitas e cinco e foram purificados tal como descrito [30]. A proteína do domínio de SMB (resíduos de aminoácidos 1-50 de vitronectina humana) foi um presente do Dr. tipo Aiwu Zhou, expressa em um dos hibridomas submetido a diluição limitante. Os sobrenadantes de cultura de tecidos a partir destes anticorpos monoclonais foram então testadas quanto à actividade em ensaios de ELISA e do isotipo de cada anticorpo determinada utilizando IsoStrips (Roche) .ATN-658, isotipo IgG1K, ligado suPAR imobilizada ao plástico com uma K

D de ~ 1 nM e iodado ATN-658 ligada especificamente uPAR na superfície de células HeLa com um K

D de ~ 5 nM. O Kd de NTA-658 para suPAR também foi confirmada utilizando ressonância plasmónica de superfície (BIAcore). análise de Western blot demonstraram que ATN-658 era específico para uPAR humana e fez não reagem de forma cruzada com o mouse uPAR. RTA-658 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura de tecido por meio de cromatografia em coluna, utilizando proteína A-Sepharose, rendimentos típicos variaram 60-120 mg /L de sobrenadante de cultura de tecidos e a pureza do material final foi 95% como determinado por HPLC. Biotina-RTA-658 foi preparado para os ensaios de ligação de células totais e de citometria de fluxo, como previamente descrito [27].

Preparação de NTA-658 fragmentos Fab

fragmentos Fab ATN-658 foram preparados por extensa digestão proteolítica do anticorpo purificado (5 h, 37 ° C) com papaina imobilizada (Pierce). fragmentos Fab ATN-658 foram separadas a partir dos domínios de Fe de anticorpos por uma proteína de cromatografia de afinidade e os fragmentos Fab purificados caracterizados por SDS-PAGE. Para confirmar que os fragmentos purificados Fab ATN-658 mantiveram a capacidade de se ligar com elevada afinidade uPAR foram realizados ensaios de competição usando biotinilado ATN-658 [27] e imobilizada suPAR. A proteína foi concentrada para 5 mg /mL utilizando filtros Millipore Ultrafree centrífugos para a cristalização de proteínas.

A avaliação da ligação de NTA-658 às células in vitro

A especificidade de espécie de NTA-658 A ligação foi avaliada por ensaios de ligação de células totais ou de citometria de fluxo, como previamente descrito [27]. ensaios de ligação de células totais foram realizadas em células (300.000 /poço) plaqueadas em gelatina revestidas placas de 12 poços (Costar # 3516) e deixadas a ligar durante a noite. Após extensa lavagem com solução de Hank tamponada com sal (HBSS; Invitrogen, Inc.) contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma), as células aderentes foram incubadas com concentrações variáveis ​​de marcado com biotina ATN-658 em HBSS /BSA a 0,1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavar 3 vezes com células de BSA /0,1% de HBSS foram incubados com estreptavidina conjugada com HRP durante mais 0,5 horas à temperatura ambiente, os poços foram lavados como acima descrito e o anticorpo ligado detectado por incubação com substrato de OPD (Sigma). Após o desenvolvimento de cor de 0,1 ml de substrato foi transferido de cada poço para uma placa de 96 poços, a reacção foi parada pela adição de 20 uL 1mH

2SO

4 e a absorvância a OD-490 nm registada. Antes de citometria de fluxo as células aderentes foram colhidas com tripsina e ressuspensas em tampão de SCAF (soro fetal de bovino a 2% em PBS). As células (2 x 10

6 células em 200 uL de tampão de SCAF) foram incubadas com NTA-658 (concentração final 10 ug /ml), IgG de ratinho de controlo, um anticorpo policlonal de coelho (diluição 1:100) produzido contra um fragmento de uPAR humana (rDIIDIII) ou soro de coelho normal (NRS) durante 1 h a 4 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com 1 mL de tampão de FACS e ressuspensas em 100 ul de tampão FACS contendo quer de cabra anti-coelho ou ratinho de cabra anti-Alexa Fluor 488 anticorpos secundários conjugados (Invitrogen, Inc.) e incubou-se durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram lavadas como descrito acima e novamente suspensas em 0,5 mL de tampão FACS antes da aquisição de citometria de fluxo de dados.

estudos de mutagénese dirigida de ATN-658 ligam ao primata uPAR

Africano macaco verde ( AGM) suPAR foi clonado a partir de células COS-1 por PCR, sequenciadas e a proteína expressa como anteriormente descrito para suPAR humano [30], [32]. mutagénese dirigida ao local do molde de plasmídeo AGM suPAR foi realizada utilizando um kit de mutagénese dirigida ao local Quikchange (Stratagene, Inc.), de acordo com as instruções do fabricante, para gerar nove mutantes em que cada um dos aminoácidos única de AGM suPAR foi substituída pela a correspondente sequência suPAR humano. A sequenciação e digestão de restrição do plasmídeo de cada mutante foi usada para confirmar a alteração de sequência e que a sequência restante permaneceu intacta. suPAR ADNc mutante AGM foi então subclonado num vector de expressão de Drosophila (pMT /BiP /V5-HisA) que contém o epitopo FLAG V5 e utilizado para transfectar células S2. em pequena escala (500 mL) foram estabelecidas culturas de agitação para produzir proteína para as experiências e a expressão da proteína foi confirmada por Western blot usando um pAb [29] contra uPAR que reagiram de forma cruzada com suPAR primata. Os sobrenadantes de cultura (CS) para cada clone foram clarificados por centrifugação e as alíquotas imuno-precipitado utilizando ATN-658 e proteína-G Sepharose. As proteínas ligadas foram detectadas por Western Blot utilizando o anticorpo policlonal de reacção cruzada de coelho anti-DIIDIII descrito acima. Outra uPAR MAb, ATN-615, que também é espécies específicas para uPAR humana e para o qual o epitopo já era conhecido a partir de estudos de cristalografia de raios-X [33], [34], foi usado como um controlo para validar este método IP.

Alternativamente, os sobrenadantes de cultura foram analisados ​​por ELISA de captura utilizando um anticorpo anti-V5 e biotinilado anti-uPAR anticorpos ATN-658 e ATN-617. RTA-617 [27] é um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo diferente no uPAR e reage de forma cruzada com AGM suPAR. As placas foram revestidas com anticorpo V5 (1 mg /mL) em PBS (100 uL poço numa placa de ligação elevada 96 bem EIA /RIA). Após 3 h de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados e depois incubados com caseína a 1 × /água (200 ul /poço) durante 2 horas à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica. As cavidades foram lavadas e 100 ul de sobrenadante de cultura foi adicionado a cada poço e incubadas O /N a 4 ° C. Os sobrenadantes da cultura foram estimados para conter ~ 3 ug /mL de suPAR. Biotina ATN-658 ou biotina-RTA-617 (1 ug /ml) foi então adicionado aos poços e incubou-se durante mais 0,5 h à temperatura ambiente, seguido por lavagem extensa. Finalmente, foi adicionada estreptavidina-HRP e depois da incubação e de lavagem adicional, a cor foi desenvolvida usando OPD e ligado ATN-658 ou ligada ATN-617 foi detectado por absorvância medida a 490 nm, como descrito anteriormente [27].

mapeamento de epítopos de NTA-658 por espectrometria de H /D de permuta de massa (H /D-Ext)

1,5 mg de fragmento Fab ATN-658 foi imobilizada sobre 200 mg de resina POROS AL (Applied Biosystems) de acordo com a as instruções do fabricante. experimentos pull-down foram realizadas utilizando suPAR-DIIDIII para confirmar a especificidade e a capacidade da coluna de afinidade de ligação. RTA-658 Fab esferas conjugadas (353 ul) foram ressuspensas em 700 ul de tampão de fosfato de deuterado (50 mM KH

2 PO?

4, 50 mM de NaCl, pH 7,4) e deixou-se equilibrar-se a 4 ° C.suPAR- DIIDIII foi ressuspenso em 40 ul D2O a pH 7,4 (Cambridge Isotopes) para ambos os 150, 500, 1500 ou 5000 segundos para permitir que deuteração completa de amidas de superfície. Labeled suPAR-DIIDIII resina de afinidade e, em seguida, foram misturados em conjunto durante 10 min a 4 ° C. Voltar troca de amidas expostas solvente foi efectuada através da substituição do

2H tampão fosfato com H

2O e incubando a 4 ° C durante um tempo igual ao passo de rotulagem. Uma experiência de controlo foi levado a cabo por ligação não marcado suPAR-DIIDIII para ATN-658 Fab esferas conjugadas e rotular o material ligado por incubação com 700 uL de tampão de fosfato deuterado para os tempos acima listados. troca de volta, em seguida, foi realizada como descrito. As reacções foram paradas e suPAR-DIIDIII eluída a partir da coluna de afinidade, utilizando 40 uL de 0,8% de ácido fórmico. A seguir à adição de 20 ul de ureia 8M, 1 H TCEP, pH 3,0, o material eluído foi injectada na Hidrogénio /plataforma deutério Espectrometria de Massa de Troca (H /D-Ext) (ExSAR, Monmouth Junction, NJ), que consiste em tandem imobilizada pepsina C18 e colunas de separação. Os fragmentos digeridos foram separados e analisados ​​por espectrometria de massa e as identidades de cada pico identificado por comparação com os dados obtidos em experiências de controlo utilizando

cristalização de proteínas e de raios-X não marcado e suPAR-DIIDIII digerido com pepsina. Marcado com deutério recolha de dados

O complexo suPAR-ATF foi formada através de incubação com ATF suPAR à temperatura ambiente em HEPES 50 mM e NaCl 100 mM, pH 7,4, e foi purificado numa coluna de filtração em gel Superdex 75. O complexo eluído foi então adicionado em excesso ATN-658 de Fab, e o complexo ternário ATN-658-uPAR-ATF foi purificado novamente numa coluna de filtração em gel Superdex 200. Antes da cristalização, o SMB foi adicionada ao complexo ternário numa razão molar 02:01, e depois concentrou-se a 10 mg /ml sem qualquer purificação adicional. A cristalização foi realizada utilizando o método de difusão de vapor em gota sentado 22 ° C. Os cristais RTA-658 da qualidade de difração Fab foram gerados utilizando 20-22% de PEG 3350, 0,1 M de Tris pH 8,0-8,5. Para a cristalização do complexo quaternário ATN-658-uPAR-ATF-SMB, a proteína a 10 mg /ml foi misturado com um volume igual de solução de reserva contendo HEPES 0,1 M pH 7,5, 55% (v /v) Tacsimate, e dois % (v /v) de 2-metil-1,3-propanodiol. Cristais Triângulo eram tipicamente apareceu depois de um par de meses e cresceu a um tamanho final de 0,15 × 0,15 × 0,15 milímetros

3.

Os cristais Fab ATN-658 foram crio-protegidos com a adição de 20% de glicerol ao licor mãe. dados de difracção foram recolhidos a 100 ° K sobre o fóton Fontes Avançadas (beamline 22-ID, SER-CAT) coleta de dados de difração .X-ray para o complexo foi realizada a 100 K na NSLS Brookhaven National Laboratory (linha feixe × 29 ). A maioria dos cristais quaternários ATN-658-uPAR-ATF-SMB diffracted muito pouco, geralmente menos de 6 Å. Este é presumivelmente devido ao elevado conteúdo de solvente (76% de solvente) e a presença de um longo eixo dos cristais (c = 391,58 A). Após numerosos ensaios com diferentes cristais, diferentes estratégias de coleta de dados e a exploração de diferentes soluções de crioprotector. Os dados de difracção foram recolhidos a partir de um cristal arrefeceu-flash que foi crio-protegido por uma imersão sequencial em líquido mãe com o aumento da concentração de etileno glicol até à concentração final de 10% (v /v) para resolução de 4,6 Â. Os dados de difracção foram indexados e processadas utilizando o programa HKL2000 [35]. A coleta de dados e estatísticas refinamento estrutural finais para ambas as estruturas são integrados na Tabela 1.

para definir solidez e requinte

As estruturas da ATN-658 Fab foi resolvido pelo método de substituição molecular (MOLREP [36] do conjunto de programas CCP4 [37]), utilizando uma estrutura de anticorpo (PDB entrada 2DDQ) como um modelo de pesquisa. O modelo foi então submetido a várias rodadas de construção manual usando Coot [38] alternado com refinamento contido usando Refmac5 [39]. Nos ciclos finais do refinamento, TLS com vinte grupos TLS para cada cadeia (gerado pela determinação movimento TLS (servidor TLSMD) [40] foi incluído no refinamento.

Esta estrutura ATN-658 de Fab foi então usada como modelo de substituição molecular para resolver a estrutura do complexo quaternário (RTA-658-uPAR-ATF-SMB) pelo método de substituição molecular utilizando programas MOLREP [36] e do SNC [41]. um modelo suPAR-ATF (entrada PDB 1fd6 [ ,,,0],33]) foi então posicionado para os cristais dos complexos quaternários por substituição molecular (molrep [36]). Apesar da baixa resolução deste cristal (4,5 a), foram obtidas soluções de substituição molecular muito fortes para ambos os modelos. Depois de refinamento utilizando o programa CNS [41], a densidade de elétrons diferença Fo-Fc mostraram a densidade de elétrons para o domínio SMB da vitronectina, confirmando ainda mais as soluções corretas de substituição molecular. os modelos resultantes com todos os quatro componentes protéicos foram refinadas usando CNS v1.3 [41] e REFMAC [39], e ajustado manualmente pelo programa O [42] ou Coot [38].

Todas as estruturas finais foram analisados ​​e validados por PROCHECK [43], PyMOL [44] e MOLSOFT ICM [45] . As coordenadas da estrutura relatada foram depositados no Protein Data Bank (PDB). As estatísticas, validação e qualidade estereoquímica final para a estrutura são apresentados na Tabela 1.

Co-imunoprecipitação

HT1099 células foram lisadas em tampão de lise Triton (50 mMHepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, e 1% de Triton X-100) suplementado com inibidores de protease e PMSF 1 mM. lisados ​​clarificados foram imunoprecipitados com anticorpos ATN-615 e ATN-658. Os imunoprecipitados foram transferidas para uPAR (R2) ou α5 integrina (PAB).

A adesão celular ensaio

O ensaio de adesão de células foi realizada como descrito anteriormente [46]. Em resumo, as células H1299 foram incubadas em DME /BSA a 0,1% com 500 uM de RGD ou RAD péptidos durante 1 h a 37 ° C e foram em seguida semeadas em fibronectina (5 ug /ml, Sigma) -Revestido placas com ou sem NTA-615 . Após lavagem, as células ligadas foram fixadas e coradas com Giemsa. Os dados foram quantificados por medição da absorvância a 550 nm

Resultados

NTA-658 não se liga a uPAR não humano

Os estudos iniciais avaliada a ligação de NTA-658. para as células de várias espécies que expressam uPAR. expressão de uPAR foi confirmada em todas as linhas de células inicialmente por RT-PCR seguido por transferência de Western utilizando um anticorpo de coelho anti-humano uPAR Pab (rD2D3) que reage de forma cruzada com uPAR de roedores e cães. Este estudo foi realizado para identificar possíveis espécies animais que poderiam ser usados ​​para futuros estudos de toxicologia de ATN-658. Biotina-RTA-658, que reteve a actividade de ligação não modificada cheia de NTA-658 [27], foi utilizado para esta avaliação. Biotina-RTA-658 não se ligam a células de melanoma de rato (B16) (Fig. 1A) ou Africano macaco verde (AGM) (Fig. 1B) células de rim imortalizadas (COS-1) na saturação de célula inteira experiências de ligação, enquanto que a ligação saturável observou-se que a expressão de uPAR humano linha de células do cancro da próstata, PC-3 (Figura 1A . B), como previamente descrito [27]. Estes resultados foram confirmados e estendido para incluir células de osteossarcoma cão (D-17) usando não biotinilada ATN-658 e um isótopo combinado IgG como controle negativo e avaliados por citometria de fluxo (Fig. 1C).

A B. A especificidade de NTA-658 foi medida por ensaios de ligação directa utilizando uPAR melanoma expressando rato (B16), o carcinoma da próstata humana (PC-3) e (COS-1) e as células marcadas com biotina ATN-658 verde Africano macaco. B. A análise FACS foi realizada usando células HeLa (que expressam uPAR humano), D-17, células de carcinoma de pulmão (células que expressam uPAR canino e COS-1. Cada linha de células foi incubada com soro normal de coelho (NRS), um anticorpo policlonal de coelho criado contra um fragmento de humano uPAR (rDIIDIII), rato IgG (mIgG) ou ATN-658 eo FITC apropriado anticorpo marcado secundário.

Identificação do epitopo para ATN-658 em suPAR humana pelo Site-Directed mutagênese

alinhamento de sequências de sequências DIIDIII uPAR primatas revelaram que humana e AGM uPAR diferiu somente em nove posições de aminoácidos (Tabela 2). Estas diferenças de ácido nove aminoácidos foram suficientes para revogar completamente a ligação do ATN-658 a AGM uPAR. Assim, clonado e expresso AGM suPAR em células S2 e fez nove mutantes diferentes que sequencialmente substituídos um aminoácido da sequência de AGM em cada mutante com o aminoácido humano correspondente (Fig. 2A). a avaliação inicial destes mutantes foi onde a capacidade qualitativa de NTA-658 para imunoprecipitar (IP) de um mutante particular, a partir do sobrenadante da cultura (CS) a partir de células que expressam esse mutante foi avaliada. RTA-615, que também é humano específico de uPAR, mas para os quais já tinham identificado o epitopo [33], [34], foi usada para confirmar a utilidade desta abordagem. ATN-615 só foi capaz de IP do mutante H192R suPAR (clone 2; Fig. 2A). Isto é consistente com o descrito para o epitopo ATN-615, que é composta de AA 187-192 (Fig. 2A). Na verdade, a única diferença de aminoácidos entre AGM e uPAR humana neste epitopo é no aa 192. Da mesma forma, ATN-658 só foi capaz de IP do E268K (clone 8) suPAR mutante implicando este resíduo como parte do epitopo ATN-658 . Alanina mutagénese de varrimento em torno deste aminoácido mapeia a sequência de aa 268-275 como o epitopo para ATN-658 (S1). Desde IP é uma avaliação qualitativa de se ligarem, capturar ensaios ELISA foram criados para medir a afinidade efectiva de NTA-658 para os vários mutantes AGM suPAR como foi possível que talvez mais de AA 268 foi necessário a fim de restaurar a actividade de ligação total para RTA-658 quando a sequência de AGM suPAR foi mutado para a sequência humana. Uma vez que os mutantes suPAR AGM foram expressos com um sinalizador V5 incorporado, foi utilizado um anticorpo anti-FLAG para capturar V5 AGM suPAR em fase sólida. A afinidade de ligação pode ser então determinada para cada mutante AGM utilizando estudos de ligação de saturação como anteriormente descrito para ATN-658 [27]. Usando esta abordagem, a ligação de NTA-658 foi observada apenas para clonar 8 com um K

d

~ 2 nM, semelhante ao K

d

de ATN- 658 para suPAR humana e para células que expressam uPAR humanos indicam que essa mudança de um único aminoácido foi responsável pela anulação completa da ATN-658 ligação a AGM suPAR (Fig. 2B). Esta mudança de um único aminoácido não revogam ligação ATN-658 por meio de um efeito global sobre suPAR conformação desde a ligação de NTA-617, que se liga a DIIDIII e não reagem de forma cruzada com AGM suPAR, não foi alterada (Fig. 2C).

A. Os mutantes pontuais foram introduzidos em AGM suPAR de tal modo que um único aminoácido foi alterado a partir da sequência AGM para a sequência de uPAR humano e as proteínas expressas e purificadas tal como descrito nos Materiais e Métodos. Cada clone é identificado pelo número (1-9) com o ponto de mutação identificados abaixo o número utilizando o código de aminoácidos de letra única. Excepto para a mutação de ponto único, o resto da sequência que é suPAR de AGM. suPAR mutantes foram expressos em células S2 e os sobrenadantes incubadas ou com NTA-615 ou NTA-658 seguido de imunoprecipitação como descrito em Materiais e Métodos. suPAR foi então detectado através de Western blot utilizando um anti-soro policlonal de coelho criado contra suPAR humano. B. Captura ensaios de ELISA foram utilizados para medir a afinidade de ligação de NTA-658 para os vários clones suPAR descritos em (A). Captura na placa de ELISA foi através da tag V5 e detecção utilizado biotina-ATN-658. C. Biotina-RTA-617 foi usado em um formato semelhante ELISA, tal como descrito em (B) para confirmar que a introdução da mutação de ponto único não têm um efeito global sobre suPAR conformation.ATN-617 reage de forma cruzada com macaco suPAR e todos clones apareceram para reter esta reatividade após a introdução da mutação.

o alinhamento deste epitopo através de múltiplas espécies de uPAR ajuda a explicar a especificidade das espécies da ATN-658 de ligação (3). Os antigos primatas do mundo (macacos, chimpanzés) são mais próximos evolutivamente para o homem e têm homóloga uPAR para humano no epitopo para ATN-658. ATN-658 ligação tem sido observado por imuno-histoquímica para chimpanzés tecidos consistentes com esta observação. Em contraste, o novo mundo primatas (macacos, AGM) uPAR difere na maioria dos casos, num único resíduo, 268 aa, e isso é suficiente para eliminar completamente a ligação de NTA-658. O uPAR de mamíferos de ordem mais baixa também difere nesta posição, bem como outros consistente com a falta de ligação de NTA-658 a uPAR ou células que expressam uPAR a partir destas espécies, bem (Tabela 3).

a confirmação da ATN-658 epitopo de hidrogênio /deutério Exchange Espectrometria de Massa (H /D-Ex)

O hidrogénio-deutério (

1H-D) de câmbio é uma ferramenta útil para a identificação de locais de ligação de proteína ou interfaces. Após a substituição de água para um sistema de solventes à base de deutério (água pesada) uma proteína irá experimentar um aumento na massa como os átomos de hidrogénio da proteína são gradualmente substituídos com deutério. A probabilidade de um evento de troca de hidrogénio-deutério é largamente determinado pela estrutura da proteína e acessibilidade solvente. As diferenças na taxa de troca de hidrogénio amida identificar a localização de um epitopo.