Abstract

Fundo e Objective

proteína Sim-associado (YAP) e co-activador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ) são effectors nucleares da via de Hipona. Apesar de serem abundantemente expressa no citoplasma e núcleo de câncer colorretal humano (CRC) e relacionadas ao estado de proliferação do tumor, houve poucos estudos sobre o papel preditivo de expressão YAP e TAZ na sobrevida global dos pacientes com CCR. Este estudo investigou a expressão YAP e TAZ em ambos os pacientes CRC e linhas celulares de cancro do cólon, e avaliou o seu valor prognóstico.

Métodos

parafina-embedded foram utilizadas amostras de 168 pacientes elegíveis para investigar YAP e expressão TAZ por imuno-histoquímica, e comparados com resultados experimentais em linha celular HCT116 do cancro do cólon para explorar seu significado clínico no CRC.

resultados

correlações positivas estatisticamente significativas foram encontradas entre a expressão da proteína de YAP e TAZ em tecidos de CRC. Os pacientes com maior YAP ou expressão TAZ mostraram uma tendência de menor período de sobrevivência; mais importante, o nosso estudo de coorte indicam que pacientes com ambos YAP e TAZ superexpressão apresentaram os piores resultados. Este foi apoiado por análise multivariada. Em células de câncer de cólon HCT116, a capacidade de proliferação, metástase e invasão foi drasticamente reduzida em knockdown de expressões YAP e TAZ por siRNA.

Conclusões

Co-superexpressão de YAP e TAZ é um preditor independente de prognóstico para pacientes com CRC, e pode contribuir para a proliferação superior, metástase, e os resultados de sobrevivência pobres desses pacientes

Citation:. Wang L, Shi S, Guo Z, Zhang X, Han S, Yang, A. et al. (2013) superexpressão do YAP e TAZ é um preditor independente de prognóstico no câncer colorretal e relacionados com a proliferação e metástase de células do cancro do cólon. PLoS ONE 8 (6): e65539. doi: 10.1371 /journal.pone.0065539

editor: Wanjin Hong, do Instituto de Biologia Molecular e Celular, Singapura

Recebido: 04 de fevereiro de 2013; Aceito: 25 de abril de 2013; Publicação: 10 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.072.117). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A via hipopótamo é um regulador importante do crescimento celular, proliferação e apoptose. Ele foi descoberto pela primeira vez por telas de mosaico genética em

Drosophila melanogaster

[1], [2]; No entanto, há um corpo crescente de provas que demonstram que a via Hipopótamo também limita o tamanho do órgão em sistemas de mamíferos [3], [4], através da inibição da proliferação celular e promover a apoptose. Os componentes desta via são altamente conservadas em mamíferos, e incluem MST1 /2; WW45; Lats1 /2; Mob1; YAP; TAZ; NF; FRMD6; e Fat4 [2]. MST1 /2 e last1 /2 são quinases, e WW45 e agir Mob1 como adaptadores /ativadores em mamíferos, em conjunto estes fazem-se a cassete de cinase núcleo da via Hippo. Os homólogos Yki: proteína Sim-associado (YAP) e a sua parálogo, co-activador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ), são os principais objectivos do núcleo Hipopótamo cascata de cinase, e são considerados como sendo os efectores nucleares de Hipona percurso [5].

estudos anteriores relataram que a alteração anormal dos componentes chave da via Hippo leva ao crescimento celular descontrolado, e está associada com o desenvolvimento de câncer [6], [7]. Isto implica que o caminho hipopótamo desempenha um papel crítico na supressão do crescimento do tumor [8]. activação aberrante de YAP tem sido associado com prognóstico pobre em vários cancros humanos [5], [9] – [11], incluindo hepatocelular, do ovário, e mesotelioma maligno, e pode agir como um oncogene no cancro da mama [15]. Como tal, YAP tem sido proposto como um oncogene candidato. Além disso, foi encontrado sobre-expressão de Yap para aumentar o tamanho do fígado e, eventualmente, levar ao desenvolvimento de tumores em modelos de ratinhos transgénicos condicionais [5], [12], [13]. Estudos adicionais mostraram que TAZ, e secreção TAZ-dependente de anfirregulina (AREG), também desempenha um papel significativo na tumorigénese da mama e de metástases: quando sobre-expresso TAZ é derrubado no carcinoma do pulmão de células não pequenas, (NSCLC), a sua proliferação e propriedades oncogénicas são suprimidas [16].

Embora ambos YAP e TAZ têm sido mostrados para ser envolvidos na progressão de cancros originários de vários tecidos, que é necessária para investigar o papel específico de tecido de expressão e YAP TAZ a fim de investigar o papel do YAP e TAZ no cancro colorectal humano (CRC) e entender melhor a função de Hipona via. Dados publicados recentemente sugerem que a sobre-expresso YAP podem interação com β-catenina para conduzir a proliferação de células cancerígenas do cólon, o que implica que YAP poderia desempenhar um papel na terapia do cancro [17]; no entanto, para o nosso conhecimento, a investigação sobre o significado clínico da YAP e TAZ, e o valor prognóstico do YAP e TAZ, tem sido limitado, eo significado de YAP e TAZ co-superexpressão no CRC, permanece indefinida.

neste estudo, nós investigamos o valor prognóstico de ambos YAP e TAZ em um estudo de coorte retrospectivo, com cinco anos de acompanhamento, para determinar o papel preditivo independente de YAP e TAZ em pacientes com CRC. Identificamos uma sinergia entre estas duas proteínas e um potencial mecanismo pelo qual o caminho Hippo modula a progressão CRC humano.

Materiais e Métodos

Pacientes e seguimento

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética da Quarta Universidade médica Militar (FMMU; Xi’an, China), e todos os pacientes participantes deram o seu consentimento informado por escrito. A coorte retrospectivo incluiu 168 pacientes com diagnóstico de CRC potencialmente ressecável entre fevereiro de 2006 e dezembro de 2007 no Departamento de Cirurgia Gastrointestinal de Xijing Hospital, FMMU. Os pacientes com os seguintes critérios foram excluídos da participação: tinham recebido quimioterapia adjuvante antes da cirurgia; tinham sido diagnosticados com tumor estromal gastrointestinal ou linfoma; tinham diagnósticos cancros adicionais; ou recusado consentimento. Todas as amostras clínicas foram recuperados a partir do arquivo de tecido do Departamento de Patologia, Xijing Hospital, FMMU. informações de acompanhamento foi atualizado a cada três meses, de todos os participantes, por telefone. A sobrevivência global foi definida como o tempo decorrido desde a cirurgia para o tempo de morte do paciente. morte do paciente foi estabelecida a partir de sua família

A imuno-histoquímica e Scoring

secções de tecidos normais e tumorais foram coradas para YAP (H-125 parafina-embedded:. sc-15407; Santa Cruz Biotechnology, EUA ) e TAZ (NP_056287: ab118373; Abcam, UK) expressão. À medida que o anticorpo contra YAP usado neste estudo é um anticorpo policlonal, utilizou-se Western blot para identificar a especificidade do anticorpo do Yap (Figura S1). A imuno-histoquímica (IHC) para YAP e TAZ foram realizados como previamente descrito [7] com pequenas modificações. Resumidamente, as lâminas foram desparafinadas em xileno e re-hidratadas através de uma série de álcoois graduados, antes da actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2 em metanol. Após o bloqueio contra ligação não específica de proteína, as amostras foram incubadas durante a noite com anticorpos primários ou YAP TAZ, diluído para as concentrações recomendadas (1:500), numa câmara de humidade a 4 ° C. As amostras foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), antes da aplicação de anticorpo secundário biotinilado durante 30 min à temperatura ambiente. A visualização foi realizada utilizando 3,3-diaminobenzidina cromogénio (DAB) durante 2-3 min. Os controlos negativos foram preparados mediante a substituição do anticorpo primário com soro de coelho pré-imune. YAP e TAZ coloração foram marcados por dois patologistas independentes, cegos para as características clínicas dos pacientes. O sistema de pontuação usado para classificar a expressão de YAP e TAZ é descrito na Tabela 1.

Cultura de Células

As seguintes linhas celulares de cancro do cólon humano: HCT116, LS174T, LOVO, SW480 , e SW480 foram usadas neste estudo. Todas as linhas celulares foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). células HCT116 e LOVO foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Invitrogen, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Hyclone); células SW480 e LS174T foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen, CA, EUA) suplementado com 10% de FBS; células SW620 foram cultivadas em L-15 (Invitrogen, CA, EUA) de meio de Leibovitz com 10% de FBS. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

A transfecção e Gene Silencing

Para pequeno ARN interferente (siRNA) transfecção, o seguinte siRNA duplexes foram sintetizados (Genepharma, Xangai, China): (5′-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3 ‘), tendo como alvo o gene YAP; (5’-GGAUACAGGAGAAAACGCATT-3 ‘), tendo como alvo o gene TAZ; e o duplex de controlo negativo, (5’-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ‘). Estes ARNic em cadeia dupla (100 nmol /L) foram transfectados em células HCT116 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As células HCT116 foram colhidas 48 h após a transfecção para análise do gene ou proteína.

quantitativo em tempo real da transcriptase reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase

O ARN total foi extraído a partir de linhas de células utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) , e subsequente síntese de ADN cíclico (ADNc; TaKaRa, Japão), foram realizadas de acordo com os protocolos dos fabricantes. Em tempo real quantitativa transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) foi realizada utilizando o sistema CFX96TM PCR em Tempo Real (BioRad, CA, EUA) com o kit de SYBR Green II (# DRR041A; TaKaRa, Japão) de acordo com os fabricantes “instruções. análise de qRT-PCR foi realizado num volume total de 20 ul com os seguintes passos de amplificação: um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min; seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s; e, em seguida, alongamento a 55 ° C durante 30 s. As expressões foram normalizados para o gene β-actina humana. Foram usadas as seguintes sequências iniciadoras: 5′-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3 ‘(sentido) e 5′-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3′ (anti-sentido) para YAP; 5’-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3 ‘(sentido) e 5′-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3′ (anti-sentido) para TAZ; 5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 ‘(sentido) e 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’ (anti-sentido) para β-actina.

Análise Western Blot

As células foram colhidas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (Santa Cruz Biotechnology). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% em tampão PBS, durante 2 h à temperatura ambiente, antes de ser alvejado om os seguintes anticorpos de acordo com as instruções do fabricante: anti-Yap (1:500); anti-TAZ (1:500); e anti-actina (1:5,000; AC40: A4700, Sigma-Aldrich, EUA). As membranas foram incubadas com os seus anticorpos associados rábano conjugada com peroxidase (HPC) secundárias, e as proteínas ligadas a anticorpo foram visualizados por quimioluminescência (New England Nuclear, MA, EUA).

Ensaio de Crescimento Celular (MTT)

proliferação celular

in vitro

foi analisada utilizando o sal de tetrazólio 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT); porque corante MTT amarelo é reduzido a um produto de formazano azul por enzimas respiratórias que só são activos em células viáveis, o grau de alteração de cor é indicativa de proliferação celular. As células HCT116 foram transfectadas durante 48h sem siARN (parental); siRNAs específicos (si-Con, si-YAP, ou si-TAZ); ou co-transfectadas com Si-Si e YAP-TAZ (Si-YAP-TAZ), e suspendeu-se em DMEM com FBS a 10%. Resumidamente, as células de cada clone 2000 (parental, SI-Con, Si-YAP, Si-TAZ, e Si-YAP-TAZ) foram plaqueadas em cinco placas de 96 poços em 200 ul de meio DMEM. Para a análise: 20 ul de substrato de MTT (a partir de uma solução de estoque de 2,5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço; as placas foram devolvidas ao incubador durante mais 4 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2; o meio foi removido; as células foram solubilizadas em 150 ul de dimetilsulf óxido; e análise colorimétrica foi realizada (comprimento de onda, 490 nm). Uma placa foi analisada imediatamente após as células aderidas (cerca de 4 h após o plaqueamento), e as placas remanescentes foram testados ao longo dos próximos quatro dias consecutivos.

citometria de fluxo e apoptóticos Cells

Células HCT116 foram transfectadas durante 48 h sem siARN (parental); específica siRNA (si-Con, si-YAP, ou si-TAZ); ou co-transfectadas com Si-Si e YAP-TAZ (Si-YAP-TAZ), antes de serem suspensas em PBS a uma densidade de 1 x 10

6 células /ml. As células apoptóticas foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um 500 fluxo Cytomics FC citómetro (Beckman Coulter), após incubação das células com um reagente contendo Anexina V-FITC e iodeto de propídio (BD Bioscience, CA, EUA) durante 15 min no escuro a temperatura ambiente .

Análise da invasão e Mobilidade (migração e invasão ensaios)

invasão celular e migração potenciais foram medidos

in vitro

por ensaios Transwell (Millipore, Billerica, MA) como segue: células HCT116 foram transfectadas durante 48 h sem siARN (parental); específica siRNA (si-Con, si-YAP, ou si-TAZ); ou co-transfectadas com Si-Si e YAP-TAZ (Si-YAP-TAZ); as células foram suspensas em DMEM com 10 g /l de BSA a uma densidade de 50 células /ml; 200 ul de suspensões de células foram semeadas em câmaras superiores dos Transwells, em que a membrana porosa ou foi revestido com Matrigel (BD Bioscience) para os ensaios de invasão, ou deixados sem revestimento para os ensaios de migração. DMEM com 10% de soro (500 ul) foi adicionado à câmara do fundo como um quimioatractor. Após a migração durante 24 h, ou invasão de 48 h, as células que tinham penetrado os filtros foram fixados em metanol e corados em 4 g violeta /l de cristal. O número de células que migraram e invasivos foram determinados a partir de cinco campos aleatórios sob um microscópio Olympus (Olympus) no × 10 ampliação.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software IBM SPSS Statistical (versão 20,0). teste de Spearman foi utilizado para avaliar a correlação entre as expressões YAP e TAZ; As curvas de sobrevida foram estimadas usando o método Kalplan-Meier; e distribuições foram avaliados pelo teste de longa-rank. riscos proporcionais de modelagem de fatores potencialmente relacionados com a sobrevivência de Cox foram conduzidos para calcular as taxas de risco (HR), e identificar quais fatores podem ter uma influência significativa na sobrevivência. As diferenças nas características entre os dois grupos foram examinados por qui-quadrado de Pearson (χ

2) e teste exato de Fisher. Todos

P valores

foram determinados a partir de 2 de cauda testes e diferenças com a

P

-valor. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

significado clínico da YAP e TAZ superexpressão em Câncer Colorretal Tissue

Para determinar a prevalência e significado clínico da YAP e TAZ no CRC, avaliamos a expressão da proteína YAP e TAZ por IHC em amostras de tecidos tumorais do nosso coorte retrospectivo de 168 pacientes de CRC após a ressecção do tumor. Dos 168 pacientes, 122 (72,6%) foram positivas para a expressão YAP, ou nuclear ou citoplasmático (Figura 1A); enquanto que 46 (27,4%) eram negativas para a expressão YAP (Figura 1B); 97 (57,8%) amostras foram positivas para a expressão TAZ; e 71 (42,2%) eram negativas para a expressão TAZ (Figuras 1E e F, respectivamente). Em contraste, somente 3 (18,75%) e 2 (12,5%) dos 16 amostras de tecido normal adjacente foram positivas para a expressão e YAP TAZ, respectivamente (Figuras 1C, D, G, e H). Além disso, houve uma correlação positiva entre YAP e TAZ (r = 0,630,

P Art 0,001; Tabela S1)., Indicando uma correlação potencial entre estas proteínas em CRC

( A) YAP-tumoral positiva; (B) tumor YAP-negativo; (C) o tecido normal YAP-positivo; (D) tecido normal YAP-negativo; tumor (E) TAZ-positivo; do tumor (F) TAZ-negativo; tecido normal (G) TAZ-positivo; tecido normal (H) TAZ-negativo. Imagens representativas foram tomadas sob um microscópio (x10). Estes resultados indicam o significado clínico da YAP e TAZ superexpressão no tecido CRC.

Como resultado destas observações, foi avaliada a relação entre YAP e expressão TAZ e as características clínicas de pacientes com CCR por chi de Pearson teste quadr ou teste exato de Fisher. Nossos resultados mostraram que a expressão do YAP e TAZ foram significativamente associados com o status do nó de linfa em tumores colorretais (

P

= 0,001

P

= 0,013, respectivamente), mas não foram significativamente correlacionada com género, localização do tumor, o tamanho do tumor, a diferenciação celular, ou a fase TNM (Tabela 2). O alto impacto prognóstico de metástases linfáticas, eo número total de linfonodos a ser ressecado, está bem estabelecida. Um estudo recente demonstrou que os valores de corte de Proporção de linfonodos (a razão de nós infiltrou-tumorais para linfonodos ressecados) são fatores prognósticos independentes fortes para pacientes com CCR, com base nas análises de dados clínicos e histopatológicos de 3026 pacientes de um único centro cirúrgico ao longo de um período de 25 anos [18]. Estas descobertas levaram-nos a investigar o papel do YAP e TAZ no prognóstico de pacientes com CCR.

YAP e TAZ Co-superexpressão foram associados à má sobrevivência geral

Para determinar o prognóstico significado da expressão YAP e TAZ em pacientes com CCR, buscou-se associar a expressão da YAP e TAZ aos resultados clínicos. O tempo médio de sobrevivência geral entre os pacientes de nossa coorte retrospectivo foi de 43 meses (intervalo: 1-56 meses), e no final do período de seguimento (60 meses), 70 dos 168 pacientes estavam vivos, e 98 pacientes estava morto. A associação entre a expressão da proteína YAP e TAZ e sobrevida global dos pacientes CRC foi investigada através de análise de Kaplan-Meier e teste log-rank para as estimativas de significância. Os pacientes foram divididos em dois grupos: aqueles com expressão positiva da YAP ou TAZ, e aqueles com expressão negativa de YAP ou TAZ. Houve diferença estatisticamente significativa entre a sobrevivência global dos dois grupos (long-rank test:

P Art 0,02 e

P Art 0,001, respectivamente). Pacientes com expressões mais elevadas de YAP ou TAZ tendem a ter um maior risco de morte em comparação com pacientes com expressões mais baixos de YAP ou TAZ, com o HR não ajustados sendo 1.617 e 1.643, respectivamente. Além disso, a diferenciação celular, metástase de nódulo linfático, e fase TNM foram encontrados para ser associado com prognóstico em pacientes de CRC (Tabela 3). A análise multivariada mostrou que a maior expressão de YAP ou TAZ foi associada com uma redução de sobrevida global, com ser o HR ajustado 2.168 (95% CI: 1,125-4,179;

P Art 0,001) e 1.544 (95% CI:. 0,999-2,451;

P

= 0,05), respectivamente, indicando que a expressão de YAP ou TAZ pode ser um fator independente de prognóstico destas características clínico-patológicas ajustadas (Tabela 3)

a seguir, investigou se co-superexpressão de YAP e TAZ poderia ter um papel prognóstico no CRC. Nossos pacientes coorte foram divididos em quatro grupos de acordo com seus níveis de expressão combinados de YAP e TAZ. Observou-se uma diferença estatisticamente significativa no resultado da sobrevivência global entre os quatro subgrupos de pacientes; aqueles com co-sobre-expressão positiva do Yap e TAZ tinha a pior sobrevivência global (Figura 2). O modelo de Cox proporcional riscos, ajustada por sexo, idade, tamanho do tumor, localização do tumor, estado de diferenciação e estádio TNM, em comparação com YAP ou expressão TAZ, mostrou que a expressão negativa de ambos YAP e TAZ foram associados com a sobrevida global melhorou significativamente; Considerando que a expressão de ambos YAP e TAZ foram associados com sobrevida global significativamente pobres (Tabela 3), com o HR ajustado sendo 3.118 (95% CI: 1,017-9,559;

P Art 0,001). Estes dados demonstram que YAP e TAZ co-sobre-expressão pode ter um impacto prognóstico específico e independente entre os pacientes CRC

(A) Correlação de expressão YAP com sobrevida global.; (B) correlação de expressão TAZ com a sobrevida global; (C) correlação de expressão YAP e TAZ combinado com a sobrevida global. A diferença estatisticamente significativa é mostrado nos resultados de sobrevida global entre os diferentes grupos de pacientes, com aqueles que têm co-sobre-expressão positiva do YAP e TAZ tendo o pior sobrevida global.

superexpressão do YAP e TAZ na HCT116 Colon Cancer Cell Linha

a fim de investigar o efeito do YAP e TAZ na progressão da CRC, testamos nossas conclusões preliminares do estudo de coorte em experimentos de linhas celulares. Em primeiro lugar, examinou os níveis de expressão gênica e protéica de YAP e TAZ na HCT116, LS174T, LaVO, SW620 e linhas celulares de cancro do cólon SW480. células HCT116 apresentaram os maiores níveis de expressão tanto YAP e TAZ (Figuras 3A e B); Portanto, a linha de células HCT116 foi escolhido para experiências posteriores para investigar YAP e TAZ em progressão CRC

(A) análise de qRT-PCR de expressões YAP e TAZ.; (B) Análise de Western blot de expressões YAP e TAZ. β-actina é usado como um controlo de carga interna. células HCT116 mostram os mais altos níveis de ambos YAP e TAZ expressão.

Efeito do YAP ou TAZ siRNA nos Níveis YAP ou TAZ em HCT116 humano linhas celulares de cancro do cólon

A seguir, examinou o efeito do YAP e TAZ na linha de células HCT116 através knockdown de expressão YAP ou TAZ usando alvo siRNAs. A especificidade de direccionamento para ARNsi YAP e TAZ foi confirmada por análise de Western blot. Em comparação com células que tinham sido transfectadas com ARNsi de controlo, a expressão de YAP e TAZ foi fortemente suprimida em células HCT116 transfectadas com 10 ug de siRNAs específicas (Figura 4A e Figura S2).

(A) análise de transferência de Western de linhas de células com níveis reduzidos de YAP e TAZ após transfecção com siRNAs: células HCT116 parentais transportam sem siRNA (parental); controle siRNA (si-Con); siRNA para YAP (si-YAP); siRNA para TAZ (si-TAZ); e co-transfectadas com ARNsi de YAP e siRNA para TAZ (Si-YAP-TAZ). (B) Os ensaios de crescimento celular MTT às células de controlo (parental, SI-Con); células com YAP reduzida ou expressão TAZ (si-YAP, si-TAZ); ou células com YAP reduzida e expressão TAZ (si-YAP-TAZ). Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3, *

P

0,05. (C) análise de citometria de fluxo de células coradas com Anexina-V-FITC e PI: células que transportam sem siARN (parental); controle siRNA (si-Con); siRNA para YAP (si-YAP); siRNA para TAZ (si-TAZ); e células com YAP reduzida e expressão TAZ (si-YAP-TAZ). Estes resultados indicam que a expressão YAP tem um maior efeito sobre a proliferação celular e supressão de apoptose em comparação com a expressão TAZ; no entanto, um papel sinérgico entre YAP e TAZ aumenta seus efeitos individuais combinados.

Efeito do YAP e TAZ Expressão sobre a proliferação celular

ensaios MTT foram usadas para determinar os efeitos da redução YAP e expressão TAZ nas taxas de crescimento de células de cancro do cólon HCT116. O grupo transfectadas com ARNsi YAP mostraram uma redução significativa na taxa de proliferação em relação ao grupo transfectadas com ARNsi de controlo ou parentais. Uma tendência semelhante foi observada com TAZ siRNA; No entanto, o efeito não foi tão forte. O grupo que foi co-transfectado com YAP e TAZ siRNAs mostrou o mais dramático e altamente significativa (

P

0,05), diminuição na taxa de proliferação celular em comparação com os grupos de ARNip parentais ou de controlo (Figura 4B); Portanto, estes resultados demonstraram que YAP e TAZ possuía um papel sinérgico de sobre a proliferação de células cancerígenas do cólon.

Efeito do YAP e TAZ Expressão em Células HCT116 apoptose Rácio

Em seguida, investigou a diferença em relação a apoptose entre o YAP e /ou grupos knockdown TAZ eo grupo controle para confirmar nossos resultados do estudo de coorte retrospectivo. A análise de citometria de fluxo mostrou que a razão de apoptose foi diminuída em células HCT116 transfectadas com ARNsi YAP em comparação com células transfectadas com HCT116 Con Si-parental ou siRNA (17,48% vs 1,62%,

P

0,05; 17,48% vs 2,28%,

P

0,05, respectivamente; Figura 4C); o efeito foi ligeiramente mais fraca em células HCT116 transfectadas com ARNsi TAZ relação aos transfectadas com parental ou SI-Con siRNA (6,48% vs.1.62%,

P

0,05; 6,48% vs 2,28%,

P

0,05, respectivamente; Figura 4C); No entanto, a razão de apoptose foi mais drasticamente diminuída em células HCT116 de co-transfectadas com ARNsi TAZ YAP e em comparação com as transfectadas com parental e SI-Con (33,60% vs 1,62%,

P

0,01; 33,60 % vs 2,28%,

P

0,05, respectivamente; Figura 4C). Colectivamente, estes resultados indicaram que a expressão YAP tinha um papel importante na promoção da proliferação celular e supressão da apoptose das células; TAZ desempenhou um papel importante, embora menos significativa, neste progresso; e um efeito sinérgico entre YAP e TAZ aumentou o seu impacto na proliferação celular e apoptose ainda mais.

Efeito do YAP e TAZ sobre Migração e Invasão

YAP e atividade TAZ já havia sido mostrado para mediar tumor migração celular e invasão. A nossa observação de que uma redução da expressão YAP e TAZ desempenhou um papel sinergístico na inibição da proliferação de células e aumento da apoptose de células HCT116 levou-nos a avaliar o efeito da co-transfecção YAP e TAZ siARN da capacidade de migração e invasão de cancro do cólon células. Padrão, e ensaios de Matrigel Transwell revestidas foram usadas para avaliar a migração e invasão, respectivamente. Ambos YAP e TAZ siRNA células transfectadas exibido migração estatisticamente significativamente reduzida em comparação com células de controlo; a redução foi mais significativa no grupo transfectadas com TAZ siRNA; No entanto, o grupo transfectadas com ambos YAP e TAZ demonstrou o efeito mais significativo sobre a redução da migração (Figuras 5A e B). As tendências foram semelhantes nos ensaios de invasão de Matrigel: clones com níveis reduzidos YAP ou TAZ mostraram uma redução estatisticamente significativa da capacidade de invasão em comparação com células de controlo; o efeito foi mais significativo no grupo knockdown TAZ; no entanto, a redução mais significativa da capacidade de invasão foi observada quando ambos YAP e TAZ foram derrubados (Figura 5C e D).

(A) Imagens representativas (× 10) de ensaios de migração de células HCT116 com níveis normais de expressão YAP e TAZ (dos pais e si-Con); células com níveis suprimidos de expressão YAP ou TAZ (si-YAP ou si-TAZ); e células com YAP suprimida e expressão TAZ (si-YAP-TAZ). (B) O número médio de células a partir dos cinco ensaios independentes de migração descritos anteriormente. (C) ensaio de invasão de células HCT116 parentais; células si-Con; si-YAP; si-TAZ; e células si-YAP-TAZ em câmaras de Boyden modificadas com membranas Matrigel-revestidas. Após 24 h, as células invasoras que tinha movido através da membrana de Matrigel foram coradas e contadas sob um microscópio com ampliação de × 10. (D) Representação gráfica de células invasoras calculados valor como média ± SD de cinco campos. Estes mostram estatisticamente reduziu significativamente a migração em ambos os YAP e TAZ siRNA células transfectadas em comparação com células de controlo; o efeito é maior no grupo transfectado com ambos YAP e TAZ. [Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas na YAP ou TAZ siRNA células transfectadas contra si-Con ou células parentais, (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01) .].

Discussão

YAP e TAZ são os principais alvos a jusante da via de sinalização Hippo. Até à data, tem havido um considerável conjunto de evidências que ligam o oncogene YAP /TAZ tumorigenicidade em vários tipos de sólidos de cancros, incluindo os do ovário, mama, próstata, fígado e pulmão [7], [9], [12], [15]. A sobre-expressão de YAP foi relatado para activar de forma aberrante um array de genes alvo responsáveis ​​pela proliferação celular, sobrevivência, anti-apoptose, migração e [19], [20]. Além disso, estudos anteriores identificaram YAP como um marcador de prognóstico independente para os tempos de sobrevida global e livre de doença de carcinoma hepatocelular (HCC pacientes); e clinicopathologically associada com a diferenciação de tumores [21]. Com base nos pontos de vista estabelecidos que YAP pode aumentar o tamanho do órgão, e funcionar como um oncogene [5], [9]; e que TAZ pode promover a proliferação celular, induzir a transição epitelial-mesenquimal (EMT), e aumentar a migração celular e invasão [22]; combinado com o potencial de similaridade de funções específicas do tecido de YAP e TAZ, examinamos e caracterizado o significado clínico da YAP e TAZ como um fator prognóstico independente para determinar os resultados de pacientes com CCR. Os resultados eram consistentes com um estudo anterior [7], em que os níveis de ambas YAP e TAZ foram significativamente elevados de expressão na maioria dos tecidos de CRC em comparação com tecidos normais adjacentes; No entanto, em contraste com relatórios sobre câncer de mama e carcinoma de células escamosas do pulmão, encontramos nenhuma discrepância entre a expressão citoplasmática e nuclear da YAP ou TAZ em tecidos CRC [15]. Variações na expressão de YAP entre os diferentes tecidos de câncer são, provavelmente, devido ao seu microambiente do tumor complicado. Usando regressão de Cox multivariada, descobrimos que a alta co-expressão de YAP e TAZ foi um preditor prognóstico para a sobrevida global dos pacientes com CCR, independente do sexo, idade, tamanho do tumor, estado de diferenciação, invasão vascular, e estágio TNM. Além disso, as menores taxas de sobrevida global foram identificados em pacientes que co-expressa YAP e TAZ, e foram associados a tumores com maiores capacidades de migração e invasão.

YAP é reconhecido como um oncogene candidato, e se tornou o foco da pesquisa, depois que foi identificado no cromossoma humano 11q22 amplicon que é evidente em vários cancros humanos [14]. TAZ é um parálogo YAP, inicialmente identificada como uma proteína de ligação 14-3-3 [23]; TAZ tem aproximadamente 50% de identidade de sequência com YAP, e uma topologia semelhante; TAZ actua como um co-activador transcricional de um modo semelhante ao YAP [23]; de nota, foi a descoberta de que YAP e TAZ dividir o factor de transcrição a jusante, DAET, para promover a proliferação celular, migração, crescimento independente de ancoragem, e EMT, que estão todos envolvidos na iniciação e progressão [24] do cancro. Além disso, os mecanismos de regulação e TAZ YAP por Hipopótamo são semelhantes. Estes achados sugerem regulação e função entre TAZ e YAP compartilhada;