Abstract

família domínio recrutamento Caspase, membro 8 (CARD8) pode coordenar imune inata e adaptativa respostas e sensibilizar as células para a apoptose, que podem participar na tumorigénese do carcinoma induzido pelo vírus hepatocelular (CHC) e cancro cervical. Por análises de bioinformática, foram identificados vários polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) dentro de uma nova identificados longo RNA não-codificante (lncRNA) como loci expressão de características quantitativas (eQTLs) para CARD8. Neste estudo, nós, portanto, a hipótese de que CARD8 eQTLs SNPs dentro lncRNA podem influenciar o risco de HCC e câncer cervical. Foram realizados dois estudos caso-controle independentes de 1.300 casos com HCC HBV-positivos e 1.344 controles normais, juntamente com 1.486 pacientes com câncer cervical e 1.536 indivíduos de controle para testar a associação entre eQTLs SNP (rs7248320) para CARD8 eo risco de HCC e do colo do útero Câncer. O genótipo variante rs7248320 foi significativamente associada com um risco aumentado de HCC e câncer cervical [GG vs. AA /GA: odds ratio (OR) = 1,28, intervalo de confiança de 95% (CI) = 1,03-1,61,

P

= 0,028 para HCC; OR ajustado = 1,34, 95% CI = 1,09-1,66,

P

= 0,006 para o cancro do colo do útero]. Além disso, o efeito do rs7248320 no risco de câncer cervical foi mais proeminente em mulheres na pré-menopausa. Uma análise mais aprofundada interativo detectada uma interação significativamente multiplicativo entre rs7248320 e estado de menopausa no risco de câncer cervical (

P

= 0,018). Estes achados sugerem que CARD8 eQTLs SNP pode servir como um marcador de susceptibilidade para HCC relacionado com o vírus e câncer cervical

Citation:. Yin J, Wen J, Asa D, Han J, Jiang J, Song C, et al . (2015) Expressão Quantitative Trait Loci para CARD8 Contribui para Risco de Dois relacionadas-Infecção cânceres carcinoma hepatocelular e câncer cervical. PLoS ONE 10 (7): e0132352. doi: 10.1371 /journal.pone.0132352

editor: Yifeng Zhou, Faculdade de Medicina da Universidade de Soochow, CHINA

Recebido: 31 de março de 2015; Aceito: 14 de junho de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Nacional de Ciência Natural da National Science Foundation Natural da China (81172757); National Science Foundation para Ilustre Casal Eruditos da China (81225020); Fundo Nacional de Ciências Naturais da National Science Foundation Natural da China (81373079); Fundação da província de Jiangsu para Distintos Jovens Pesquisadores (BK2012042); Programa Nacional Key Pesquisa Básica Para Jovens (2013CB911400); Fundação para o Programa de New Century excelentes talentos em University (NCET-10-0178); Programa Nacional de Apoio de alto nível Jovens Profissionais; Província de Jiangsu Projetos de Tecnologia Ciência Clínica e (BL2012008); Collaborative Innovation Center para o cancro medicina personalizada na província de Jiangsu ea prioridade Programa Acadêmico para o Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior Jiangsu (Saúde Pública e Medicina Preventiva); Fundo Nacional de Ciências Naturais da National Science Foundation Natural da China (30901236); Pequim Natural Science Foundation (7123225); Programa Nova Pequim (xx2012067); Fundação de Pesquisa Científica para devolvidos Scholars, Ministério da Educação da China para a realização da pesquisa e preparação do artigo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) e cancro do colo do útero são dois tipos de câncer mais comuns em todo o mundo. Em 2008, estimava-se que mais de 80% do HCC e casos de câncer cervical ocorreu em países em desenvolvimento, incluindo a China [1,2]. persistência do vírus da hepatite B (VHB) e vírus do papiloma humano (HPV) têm sido bem estabelecidos como fatores de risco para o fígado [3] e câncer cervical [4]. No entanto, apenas uma pequena fração de portadores persistentes virais eventualmente desenvolver câncer, sugerindo outros fatores podem influenciar os resultados clínicos após infecções por vírus. Foi relatado que as variações genéticas do hospedeiro desempenham um papel fundamental na carcinogênese do CHC e câncer cervical [5,6].

Caspase família domínio recrutamento, membro 8 (CARD8) representa um novo membro de domínios de recrutamento associadas a caspase (CARD) da família, que são os módulos de interacção proteína-proteína encontrada extensivamente em proteínas que desempenham papéis importantes na apoptose e a activação do factor nuclear kappa B (NFkB) [7]. Os defeitos de apoptose são observados em praticamente todos os tipos de cancros humanos [8]. CARD8 pode suprimir a actividade de NFkB activados por mediadores inflamatórios [9]. Além disso, a activação de NFkB, uma característica da resposta inflamatória, é frequentemente detectada em tumores e pode constituir um elo perdido entre a inflamação e cancro [10,11], e é fundamental para o desenvolvimento de cancros induzidos por virus, incluindo carcinoma hepatocelular e cancro cervical [11-13]. Por exemplo, a activação da transdução do sinal de NFkB exige a interacção entre a proteína da hepatite B virus X e AIB1 oncogene [14], e o vírus do papiloma humano 16 E5 medeia oncoproteína carcinogénese do colo do útero por meio de sobre-regulação de COX-2 por meio de NFkB [11].

RNAs não-codificantes longas (lncRNAs) são definidos como transcrições não-codificadores de proteínas maiores que 200 nucleotídeos. Elas controlam a expressão do gene no núcleo através da modulação da transcrição ou por meio de mecanismos de pós-transcrição de segmentação o splicing, a estabilidade, ou a tradução de ARNm [15]. LncRNA AC008392.1 é um dos lncRNAs recentemente identificados, que localiza na região a montante de CARD8 no cromossoma XIX e é expressa em várias linhas de células tais como GM12878 (linfócito B humano) e HeLaS3 (células de cancro cervical humano). Por bioinformática análises, foram identificados dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (rs7248320 e rs12459322) em AC008392.1 pode representar o loci expressão de características quantitativas (eQTLs) para CARD8 (https://www.regulomedb.org) [16]. É possível que os SNPs influenciar a interacção entre AC008392.1 e CARD8, alterando desse modo a expressão de CARD8. Aqui, a hipótese de que CARD8 eQTLs SNPs podem contribuir para modificar o risco de dois HCC relacionado com o vírus e câncer cervical. Para testar a nossa hipótese, realizamos dois estudos independentes de caso-controle, incluindo 1.300 casos com HBV-positivos HCC e 1.344 indivíduos de controle, bem como 1.486 casos de câncer cervical e 1.536 indivíduos de controle para avaliar as associações entre eQTLs SNPs para CARD8 e a susceptibilidade de os dois tipos de câncer.

Materiais e Métodos

os sujeitos do estudo

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto de Câncer e Hospital da Academia chinesa de Ciências Médicas e Nanjing University Medical . Todos os participantes fornecer seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo e os comitês de ética aprovados este processo de aprovação. inscrição dos sujeitos foi descrito anteriormente [17-20].

Resumidamente, os pacientes com CHC foram recrutados consecutivamente entre janeiro de 2006 e dezembro de 2010, no Tumor Nantong Hospital, Qidong Liver Cancer Institute, eo Hospital Primeira Affiliated de Nanjing médico da Universidade da província de Jiangsu, China. O diagnóstico de HCC foi apoiada por um exame patológico e /ou elevação da alfa-fetoproteína ( 400 ng /mL), combinada com a ressonância magnética e /ou tomografia computadorizada. Uma vez que a infecção por HCV é raro em populações chinesas, foram excluídos pacientes HCC com infecção por HCV. Como resultado, os pacientes HCC 1.300 HBV-positivos consentiram em participar do estudo. De setembro de 2009 a março de 2010, 149,172 habitantes, que residiam em cinqüenta e dois aldeias na província de Jiangsu, China, durante pelo menos um ano inteiro, foram incluídos em um estudo transversal, de base comunitária. Entre eles, um total de 11.474 participantes eram seropositivos HBsAg. Depois, de setembro a novembro de 2010, 8,006 indivíduos (69,8%, 8006/11474) que concordaram em ser regularmente acompanhadas a cada 1-2 anos foram chamados de volta e verificado seromarkers vírus da hepatite mais uma vez. Finalmente, 7.250 indivíduos que foram HBsAg soropositivos com coleta de amostras duas vezes em, pelo menos, intervalo de 6 meses, negativo para HCV e ter informações da terapia antiviral foram incluídos na coorte de base comunitária. Entre eles, um total de 1.344 indivíduos foram seleccionados aleatoriamente como os controlos serviram como um grupo de comparação de casos de HCC. Todos os controles foram HBV transportadoras persistentes que eram positivos tanto para o antigénio de superfície de HBV (HBsAg) e anticorpo contra o antigénio do núcleo da hepatite B (anti-HBc), mas negativa para o anticorpo de HCV (anti-HCV). Sem história de vacinação contra HBV foi relatado para estes temas. Estes controles selecionados foram pareados com os casos de carcinoma hepatocelular na idade (± 5 anos) e gênero, e declarou sem malignidade anterior.

Para o estudo do cancro do colo do útero, os 1.486 pacientes com câncer cervical confirmou-histologicamente foram recrutados consecutivamente entre março de 2006 a dezembro de 2010 do Hospital Tumor Nantong e do primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica de Nanjing, Jiangsu, China. Os 1.536 controles também foram selecionados aleatoriamente de um pool de controle de mais de 40.000 pessoas que participaram de outro programa de triagem baseada na comunidade para doenças não infecciosas realizados na província de Jiangsu, com taxa de acompanhamento de 98,1%. Os controles foram os casos da idade (± 5 anos) pareados por freqüência. Todos os controles não tinha história de câncer auto-referida.

Depois de consentimento informado por escrito foi obtida, cada participante foi agendada para uma entrevista por meio de um questionário estruturado para coletar informações sobre dados demográficos, história menstrual e reprodutiva e história de exposição ambiental. Indivíduos que fumavam um cigarro por dia há mais de um ano foram definidos como fumantes e aqueles que consumiram uma ou mais doses de álcool por semana por mais de 6 meses foram classificados como bebedores de álcool. Todos os pacientes e controles eram independentes chineses Han étnicas. Após entrevista, uma amostra de sangue venoso de cerca de 5 ml foi coletado de cada participante (HCC paciente, paciente de cancro do colo do útero e controle).

sorológica Testing

HBsAg, anti-HBc e anti-HCV foram detectados a partir do soro de cada participante pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (Kehua Bio-Engineering Co., Ltd., Shanghai, China) seguindo as instruções do fabricante, conforme descrito anteriormente [17].

Selecção e genotipagem de SNPs

com base nos dados da base de dados de UCSC (GRCh37 /hg19), banco de dados reguloma e os critérios de frequência menor alelo (MAF) 0,05 em chinês Han, encontramos dois eQTLs SNPs comuns para CARD8 nas proximidades lncRNA AC008392.1. Os dois CARD8 eQTLs SNPs (rs12459322 e rs7248320) estão em desequilíbrio de ligação elevada (LD) (D ‘= 1,000). Assim, optamos rs7248320 como o SNP tagging. O ADN genómico foi extraído a partir de um sedimento de leucócitos pela proteinase K de digestão tradicional e seguido por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. rs7248320 SNP foi genotipados usando a plataforma Sequenom MassARRAY Iplex (Sequenom Inc). A informação sobre iniciadores é mostrado na Tabela 1. A genotipagem foi realizada às cegas, sem saber o estado do caso, ou controlo. Duas em branco (água) controles em cada placa de 384 poços foram usados ​​para controle de qualidade e mais de 10% das amostras foram selecionados aleatoriamente para ser repetido, produzindo uma taxa de concordância de 100%.

Análise Estatística

as diferenças de características demográficas e freqüências genotípicas de rs7248320 SNP entre os casos e controles foram calculados pelo teste t de Student (para variáveis ​​contínuas) e χ

2 de teste (para variáveis ​​categóricas). As associações entre os genótipos e os riscos de câncer foram estimadas calculando odds ratio (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC) a partir de análises de regressão logística. Heterogeneidade de associações entre subgrupos foi avaliada pelo χ

2-baseado no

test Q

. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software R (versão 2.13.0; A Fundação R para Statistical Computing). Todos os testes foram em frente e verso, e o critério de significância estatística foi fixado em

P Art 0,05.

Resultados

As características demográficas dos 1.300 pacientes HBV-positivos HCC e 1.344 indivíduos de controle, e 1.486 pacientes com câncer cervical e 1.536 indivíduos de controle foram descritos anteriormente (Tabelas 2 e 3) [ ,,,0],17-20]. Não houve diferenças significativas na proporção da idade, sexo e tabagismo entre os casos e controles HCC. No entanto, a proporção de beber era significativamente mais elevada em casos de carcinoma hepatocelular do que nos controlos (

P

0,001). Comparado com o grupo controle, os pacientes com câncer cervical apresentaram significativamente maior proporção de fumantes (

P Art 0,001), estado pré-menopausa (

P

= 0,002) e maior paridade (

P

= 0,001).

a distribuição dos genótipos de rs7248320 nos pacientes e controles foram apresentados na Tabela 4. as freqüências genotípicas de rs7248320 estavam em Hardy-Weinberg nos controles (

P

= 0,718 para controles HCC e

P

= 0,343 para controles de câncer cervical). Nos modelos de regressão logística multivariada, rs7248320 genótipo variante GG foi associado com um risco aumentado de HCC por 1,28 vezes (IC 95% = 1,03-1,61,

P

= 0,028) em comparação com o AA genótipos /GA. Da mesma forma, o genótipo GG aumentou o risco de câncer cervical em 1,34 vezes (IC 95% = 1,09-1,66,

P

= 0,006), quando comparado com os genótipos AA /GA (Tabela 4).

a associação entre rs7248320 eo risco de HCC foi aprofundado na análise estratificada (Tabela 5). No modelo recessivo, o efeito de risco para rs7248320 foi ligeiramente mais proeminente em indivíduos mais jovens (≤ 53 anos), do sexo masculino, e aqueles que nunca haviam fumado. No entanto, teste de heterogeneidade não foi significativa para estes estratos. Tabela 6 exibida a associação do rs7248320 com o risco de câncer cervical. Embora o efeito de risco para rs7248320 foi ligeiramente mais acentuada entre as mulheres mais jovens (≤ 53 anos), indivíduos que nunca fumaram, assuntos que não tinham história familiar de qualquer tipo de câncer, e menos de paridade (0 a 1), sem heterogeneidade entre estes estratos foi observado. Curiosamente, foi observado um efeito de risco mais forte de rs7248320 entre as mulheres na pré-menopausa (OR ajustado = 1,82, 95% CI = 1,33-2,48) (

P

= 0,014 para o teste de heterogeneidade). Por uma análise mais aprofundada interativa, foi observada uma interação significativa multiplicativo entre rs7248320 e estado de menopausa para o risco de câncer cervical (

P

= 0,018). A análise do cruzamento sugeriu que, em comparação com as mulheres da menopausa com genótipos AA /GA, as mulheres na pré-menopausa com genótipo GG tiveram o maior risco para o câncer cervical (OR ajustado = 3,18, 95% CI = 2,24-4,52,

P Art 0,001) (Tabela 7).

Discussão

nestes dois estudos caso-controle independentes, foi investigada a associação entre rs7248320 ea susceptibilidade do HCC e câncer de colo uterino de uma população chinesa. Descobrimos que rs7248320 eQTLs SNP para CARD8 foi associado com o risco aumentado de HCC e câncer cervical. Além disso, também foi observada uma interação significativa multiplicativo entre rs7248320 e estado de menopausa para o risco de câncer cervical.

Uma vez que o projeto ENCODE e análise de RNA-seq identificaram milhares de novos lncRNAs, as variantes genéticas e função biológica de lncRNAs estão se tornando ponto quente em estudos de doenças complexas. Vários estudos relataram que vários lncRNAs foram desregulados em HCC e câncer cervical, tais como HOTAIR e MEG3 [21-25]. Além disso, nós relatado anteriormente que ZNRD1 eQTLs SNPs aumentou o risco de HCC [20]. LncRNA AC008392.1 localiza na região a montante do CARD8, o que pode influenciar a expressão de CARD8. Um estudo anterior demonstrou que o genótipo variante de rs7248320 e rs12459322 foram associados com a expressão de baixo CARD8 em monócitos [26]. Há evidências que sugerem que CARD8 é um regulador negativo de activação NFkB, que resulta na supressão da imune e inflamatória [27,28]. Além disso, a redução de CARD8 sugere uma diminuição na defesa anti-apoptótica [29]. A ativação da sinalização de NFkB contribui para carcinogênese e promove o prognóstico da doença e metástase no HCC e câncer cervical [30-34]. Assim, o genótipo GG variante de rs7248320 em lncRNA AC008392.1 pode estar associada com a activação do NFkB e de inibição da apoptose através da regulação negativa de CARD8, e consequentemente promover o desenvolvimento e progressão do cancro relacionada com infecção, incluindo carcinoma hepatocelular e cancro do colo do útero, que foi consistente com o efeito de risco de o genótipo GG variante de rs7248320 nos resultados do nosso estudo.

Existem várias limitações do estudo que precisam de ser resolvidos na pesquisa adicional. Em primeiro lugar, foi realizado o estudo de caso-controle para apenas uma etapa sem validação. Mais estudos de grande escala são necessários para validar as associações entre rs7248320 no AC008392.1 eo risco de HCC e câncer cervical. Em segundo lugar, a função biológica dos dois SNPs no AC008392.1 eQTLs não foi adicionalmente investigada neste estudo. As associações entre os SNPs eo risco de HCC e câncer cervical devem ser interpretados com cautela. Enquanto, em nosso estudo anterior [20], encontramos ZNRD1 (domínio de zinco fita contendo 1) rs3757328 eQTLs SNP em ZNRD1-AS1 (ZNRD1 antisense RNA 1) foi associado com risco aumentado de HCC, e mais eQTLs resultados das análises indicaram a associação significativamente entre os genótipos de rs3757328 e a expressão de ZNRD1 e ZNRD1-AS1. Experimentos in vitro mostraram que também ZNRD1 knockdown inibiu a expressão de ARNm de HBV e promoveu a proliferação de células HepG2.2.15. Dado que os resultados de nosso estudo anterior [20], a hipótese de que lncRNA AC008392.1 pode regular a expressão de proteína relacionada (CARD8) por si só variação e, assim, influenciar a ocorrência e desenvolvimento de tumor hepático e tumoral cervical. Em terceiro lugar, a infecção por HPV, a causa primária e necessária do cancro do colo do útero, não foi detectada nas amostras cervicais. E a interação entre o tipo de HPV e rs7248320 não puderam ser avaliadas na carcinogênese cervical.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a investigar a associação de CARD8 eQTLs SNPs na lncRNA AC008392.1 com o risco de HCC e câncer cervical. Com uma população relativamente grande, este estudo revelou que o GG genótipo variante de rs7248320 em lncRNA AC008392.1 influenciado o risco de dois tipos de câncer-HCC e cancro do colo do útero relacionadas com o vírus. O GG genótipo variante combinada com o estado pré-menopausa reforçado o efeito de risco. Estes resultados sugerem que rs7248320 AC008392.1 pode servir como um marcador de susceptibilidade para HCC e câncer cervical. Novos estudos que incorporam diversas populações e os ensaios funcionais são necessários para validar e estender nossas descobertas.