Abstract

Apesar dos benefícios comprovados da anti-EGFR /VEGF terapias direcionadas em câncer colorretal metastático (CCRm ), muitos pacientes respondem inicialmente, mas depois mostram evidências de progressão da doença. Novas estratégias terapêuticas são necessárias para tornar a ação de medicamentos disponíveis mais eficiente. Nosso estudo teve como objetivo investigar se segmentação simultânea de EGFR /VEGF e ciclo-oxigenase-2 (COX-2) pode ajudar o tratamento e gestão de pacientes com CCRm. O AEE788 inibidor da quinase de tirosina e celecoxib dupla foram utilizados para inibir respostas de EGFR /VEGFR e COX-2, respectivamente, em células de cancro colorrectal. Inibição de COX-2 com o celecoxib aumentou a eficácia anti-tumoral e anti-angiogénico de AEE788, como indicado pela inibição da proliferação celular, indução de apoptose e G1 paragem do ciclo celular, sub-regulação da produção de VEGF pelas células cancerosas e redução da migração de células. Estes efeitos estavam relacionados com um bloqueio no eixo sinalização EGFR /VEGFR. Notavelmente, o tratamento /celecoxib AEE788 combinada impedido acumulação nuclear β-catenina em células de tumor. Este efeito foi associado a uma regulação negativa significativa dos níveis de proteína FOXM1 e uma deficiência na interacção deste factor de transcrição com β-catenina, o que é necessário para a sua localização nuclear. Além disso, o tratamento combinado também reduziu a expressão dos marcadores de células estaminais outubro 3/4, Nanog, Sox-2 e Snail em células cancerosas, e contribui para a diminuição da subpopulação CSC, como indicado por ensaios de formação de colonosphere. Em conclusão, o tratamento combinado de AEE788 e celecoxib não só demonstrou eficácia anti-tumoral melhorada em células de câncer colorretal, mas também reduziu cólon CSCs subpopulação, visando vias relacionadas-stemness. Por conseguinte, a orientação simultânea de EGFR /VEGF e COX-2 pode auxiliar no bloqueio da progressão CCRm e melhorar a eficácia das terapias existentes para o cancro colorectal

citação:. Um Valverde, Peñarando J, Canas A, Lopez-Sánchez LM, Conde M, Hernández V, et al. (2015) Simultânea A inibição da EGFR /VEGFR e ciclooxigenase-2 Metas Pathways stemness-relacionados em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 10 (6): e0131363. doi: 10.1371 /journal.pone.0131363

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, United States |

Recebido: 15 de dezembro de 2014; Aceito: 01 de junho de 2015; Publicação: 24 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Valverde et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. eA foi apoiado pela Rede Espanhola Câncer (RTICC), Instituto de Salud Carlos III (RD12 /0036/0038) (www.isciii.es). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro colorectal (CRC) é um dos mais comumente diagnosticado cancro e causa de mortalidade por cancro nos países desenvolvidos [1]. Na Europa, o CRC é o terceiro câncer mais comum e depois do câncer de pulmão foi a segunda causa mais frequente de mortalidade em 2012, com quase 215.000 mortes [2]. Embora a mortalidade por CRC diminuiu ligeiramente durante as últimas duas décadas, e apesar dos avanços na detecção e tratamento cirúrgico, metastático CRC (mCRC) está associada a um mau prognóstico, com taxas de sobrevida em 5 anos na faixa de 5% a 8%. A segmentação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) tem sido provado ser uma terapia eficaz na CRC. Particularmente, o tratamento com anticorpos monoclonais (cetuximab ou panitumumab) dirigidos contra o domínio extracelular do receptor tornou-se principais estratégias terapêuticas para tratar CCRm. No entanto, as respostas a anticorpos alvo EGFR são relativamente baixos, com melhorias na sobrevivência normalmente dura apenas alguns meses, e eficácia limitada a certos subtipos de pacientes [3]. De facto, os pacientes de CRC definido como “negativa quádruplo”, com tumores sem mutações de EGFR em efectores a jusante KRAS, BRAF, PIK3CA, e PTEN, tem a maior probabilidade de resposta a terapias anti-EGFR [4]. Por outro lado, diferentes estratégias de bloqueio destina-se a factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e os seus receptores têm sido desenvolvidos para inibir a angiogénese em pacientes com CCR [5,6]. Apesar dos benefícios demonstrados destas terapias anti-angiogénicas na gestão de CRC, muitos pacientes com doença avançada, inicialmente respondem à terapia anti-VEGF, mas em seguida, mostram evidência de progressão da doença, o que sugere a resistência à terapêutica [7]. Por conseguinte, há uma clara necessidade para uma melhor caracterização dos processos envolvidos na ineficácia de anti-EGFR /VEGF alvo terapias e encontrar novas estratégias terapêuticas para fazer a acção de drogas disponíveis mais eficientes.

Durante a última década , tem sido demonstrado que nos tumores existe uma população de células, comumente referidas como cancro de células estaminais (CSCs), com capacidade de proliferar e gerar o restante da massa do tumor [8,9]. A capacidade de auto-renovação das CSCs permite a homeostase e manutenção do tumor, de um modo semelhante como células estaminais fazer em tecidos normais. CSCs são muito mais resistentes do que as células tumorais diferenciadas para terapias utilizadas em clínica [8]. Assim, tem sido mostrado que o risco de recorrência do cancro colo-rectal é proporcional à expressão no tumor primário de uma série de genes específicos de células estaminais e intestinais que também identificar uma população de células com propriedades de CSC no tumor [10]. Importante, estudos recentes demonstraram que os CSCs estão envolvidos nos mecanismos pelos quais os tumores escapam ambas as terapias específicas anti-EGFR e anti-VEGF [11,12]

O celecoxib é uma ciclooxigenase-2 selectivo (COX-2) inibidor, que é utilizado para prevenir a formação de pólipos em pacientes com polipose adenomatosa familiar (FAP), uma população de alto risco para o desenvolvimento do cancro colo-rectal [13]. No entanto, estudos sugerem que o celecoxib pode ter propriedades eficazes anti-tumorais e anti-metastáticos contra CRC fase tardia. Assim, a eficácia de um inibidor de tirosina-quinase anti-angiogénico (Axitinib) tem sido mostrado para ser significativamente aumentada quando combinado com o celecoxib em um modelo pré-clínico da CRC [14]. Além disso, o desenvolvimento de vários inibidores da quinase, permitiu a inibição simultânea de EGFR e VEGF vias. Este é o caso de AEE788, um inibidor oral com uma actividade potente contra várias tirosina-cinases incluindo o EGFR, e VEGFR [15], que tem sido demonstrado que exerce efeitos anti-tumorais em vários modelos de cancro humano [16-18]. Por conseguinte, a orientação simultânea de EGFR /VEGF e COX-2 pode também ajudar no bloqueio progressão CCRm. O presente estudo mostra que a combinação de AEE788 com o celecoxib específico inibidor da COX-2 não só demonstrou eficácia anti-tumoral melhorada em células de câncer colorretal, mas cólon também reduziu CSCs subpopulação, visando vias relacionadas-stemness.

Material e Métodos

cultura celular

Caco-2 células (ECACC, Salisbury, Reino Unido) foram cultivadas em MEM com sais de Earle (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) contendo soro fetal bovino a 15%. HCT-116 células (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Biowest, Nuaillé, França) contendo 10% de soro bovino fetal (PAA Laboratories). As células HCT-116 abrigar uma mutação ativando no KRAS (G13D), enquanto as células Caco-2 são KRAS tipo selvagem. Os meios de cultura foram suplementados com glutamina 2 mM, aminoácidos não essenciais a 1%, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml) e anfotericina B (2,5 ug /ml). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO2. Depois tornou-se culturas 80% confluentes (geralmente após 3 dias), as células foram tripsinizadas, centrifugadas e suspensas em meio fresco. Todas as células utilizadas para as experiências exibida 95% de viabilidade e foram semeadas em placas de 96 poços, placas de cultura de 6 poços, placas de cultura de 60 mm ou placas de fixação ultra-baixo (Corning Inc., Lowell, MA, EUA). Todos os experimentos foram realizados em duplicata e repetido pelo menos três vezes.

Reagentes

AEE788 (Novartis Pharma AG, Basel, Suíça), NS-398 e celecoxib (Sigma-Aldrich, Madrid, Espanha) foram dissolvidos em DMSO para produzir concentrações de estoque de 10 mM, 10 mM e 20 mM, respectivamente, e armazenadas a -20 ° C. As soluções de trabalho foram preparadas por diluição de existências descongeladas em meio de cultura celular. A concentração de DMSO na solução final não excede 0,1% v /v. EGF humano foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA) e dissolvido em glicerol para produzir concentrações de estoque de 10% v /v. VEGF recombinante humano foi adquirido de Sigma-Aldrich e dissolvida em água para produzir concentrações estoque de 10 jig /mL. Para a análise de Western Blot, foram utilizados os seguintes anticorpos: fosfo-receptor de EGF (Tyr1068) Rabbit pAb, fosfo-VEGF Receptor 2 (Tyr1175) (19A10) de coelho mAb, VEGF Receptor 2 (55B11) de coelho mAb, fosfo-p44 /42 MAPK (1/2 Erk) (/Tyr204 Thr202) mAb (D13.14E) coelho, fosfo-Akt (Thr308) (C31E5E) coelho mAb, fosfo-Akt (Ser473) (587F11) do rato mAb, Akt coelho pAb e β-catenina rabbit pAb foram adquiridos de sinalização celular Technologies (Danvers, MA, EUA). EGFR mAb de ratinho (0.N.268), actina (C-2) de mAb de rato, de cabra anti-coelho, de cabra anti-murganho, anticorpos secundários de burro anti-cabra, e FOXM1 (K-19): sc-500 foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. Quinase MAP ERK1 /coelho ERK2 pAb foi de Calbiochem-Merck (Billerica, MA, EUA), COX-2 mAb de ratinho (Clone CX229) era da Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, EUA) e Ep-CAM mAb de ratinho foi de Chemicon International (Billerica, MA, EUA). O iodeto de propídio foi obtido a partir de Sigma-Aldrich, e foi preparado através da dissolução de 1 mg em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato. Esta solução foi protegida da luz e armazenados a 4 ° C. ARNase, isento de ADNase foi obtido a partir de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EUA). Foram preparadas concentrações stock de 500 ug /ml de RNase e mantido em- 20 ° C.

A proliferação celular ensaio

A proliferação celular e a viabilidade foi avaliada através de um ensaio colorimétrico de XTT (Roche Applied Science). As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 4000 células /poço e deixar a aderir durante 24 horas. As células foram então tratadas com AEE788 (0-20 uM) como um agente único ou em combinação com celecoxib (10 uM) na presença ou na ausência do EGF (100 ng /mL). células controlos foram tratados com a mesma concentração do veículo DMSO. Após o tratamento, nos tempos indicados e doses, o ensaio XTT foi realizado seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante, utilizando um leitor de microplacas de absorvância.

Colonosphere formação ensaio

Para o ensaio de formação de colonosphere, após as células tratamentos foram tripsinized, contadas e re-semeadas a uma densidade clonal (1 célula /ul) em 96 poços da placa com a superfície de ultra-baixo de fixação (Costar, Corning, NY, EUA) com soro livre de Dulbecco MEM Nutrient Mixture meio F + 12 Ham suplementado com B27 (01:50; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), factor de 10 ng /mL de crescimento básico de fibroblastos (PeproTech, Londres, Reino Unido)), 20 ng /ml de EGF (Santa Cruz Biotechnology) e 1% v /v de metilcelulose (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) para impedir a agregação de células. Os suplementos foram recentemente adicionados a cada 2-3 dias e o número e tamanho dos colonospheres formados foram avaliadas por microscopia óptica no dia 7 após a semeadura.

Western análise de transferência

Depois de célula tratamentos foram colhidas com PBS arrefecido e centrifugado a 300 x g, durante 5 minutos a 4 ° C. O sedimento de células foi incubada durante 15 minutos em gelo com 1 ml de tampão de lise (Tris-HCl a 50 (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1 mM etilenoglicol ácido tetraacético (EGTA), 1,5 mM MgCl2, 10% de glicerol, 1% de NP40, 0,1 M de ditiotreitol (DTT), 0,1 M de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1% v /v de cocktail inibidor de protease (serva, Heidelberg, Alemanha) e 1% de cocktail de inibidor de v /v de fosfatase 2 e 3 (Sigma-Aldrich) e centrifugado a 10000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. a concentração total de proteína foi quantificado por um ensaio de Bradford padrão usando o reagente colorimétrico de BioRad Laboratories (Hercules, CA, USA).

Proteínas (12,5 ug) foram separadas em géis de poliacrilamida com SDS, utilizando um gradiente de 4-12% de gel de Bis-Tris no Sistema Critério BioRad e transferidos para membranas de nitrocelulose, que foram bloqueados com BSA a 3%, e sondados com os anticorpos apropriados. os imunocomplexos foram detectados com anticorpos secundários apropriados peroxidase de rábano conjugada e detectado por quimiluminescência reforçada com o Sistema ECL Além disso Western Blotting Detection ou ECL Avanço Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare Life Sciences, Little Chal-font, UK). As imagens foram capturadas num XRS ChemiDoc Imaging System (BioRad Hercules, CA, EUA).

Combinado anexina-V /iodeto de propídio coloração

A fracção de células apoptóticas foi estimada após 48 horas de tratamento de células cultivadas na ausência ou na presença de EGF (100 ng /mL) com diferentes doses de AEE788 e /ou o celecoxib em placas de 6 poços a uma densidade de 3 x 10

6 células /poço. A viabilidade foi avaliada utilizando um kit de coloração com anexina-V /iodeto de propídio (PI) (Bender MedSystems, Viena, Áustria), de acordo com as recomendações MANUFACTURER’S. A ligação de f luoresceína-conjugado anexina-V e PI foi medida por citometria de fluxo. (FACSCalibur; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) para quantificar a percentagem de células apoptóticas

Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) para análises de VEGF e a produção de prostaglandina E2

a produção de VEGF pelas células foi estimado através de ensaios de ELISA (VEGF-a humano platina ELISA e-Bioscience), realizada em células de cultura de sobrenadantes de 48 h após os diferentes tratamentos e seguindo o protocolo fornecido pela fabricante. Em resumo, as culturas foram centrifugadas a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C e os sobrenadantes foram recolhidos, aliquotados, e armazenados a -80 ° C até ao ensaio. A densidade óptica foi medida a 450 nm com o comprimento de onda de correcção ajustado a 650 nm, utilizando um leitor de microplacas. Prostaglandina E2 (PGE2) pelas células foi estimada utilizando o kit de PGE2 EIA, (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, EUA). Este ensaio foi realizado em lisados ​​celulares 12 horas após os tratamentos com AEE788 e /ou celecoxib e seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. A densidade óptica foi medida a 450 nm com o comprimento de onda de correcção fixado em 570-590 nm, utilizando um leitor de microplacas.

ciclo celular análise

Células (0,5-1 x 10

6 células ) foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS. Arrefecida com gelo de 100% de etanol foi adicionada de um modo gota a gota, enquanto suavemente vórtex e incubou-se durante 20 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 300 x g durante 5 minutos, ressuspendidas em PBS contendo /ml de iodeto de propídio 50 ug, mais 100 ug /ml de RNase A e incubou-se durante 20 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Análise e medição de fluorescência de iodeto de propidio foram realizadas num FACSCalibur (BD Biosciences) de fluxo FACSCalibur. (FACS; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA)

ensaio de angiogénese

A angiogénese foi medida como a capacidade das células endoteliais para formar estruturas tridimensionais em matriz de matrigel membrana basal (BD Biosciences)

in vitro

. Para o ensaio de angiogese, as células HUVEC (CC-2519 Lonza Vendas AG, Basileia, Suíça) foram cultivadas em cima do Matrigel a uma densidade de 20000 células /poço em meio de células Caco-2-condicionado após diferentes tratamentos. meios de Caco-2-condicionado após diferentes tratamentos foi concentrado em Amicon Ultra-0,5 dispositivos centrífugos de filtro (Merck), com a capacidade para a obtenção de elevados factores de concentração e remoção de resíduos de droga. Como controlo, as células HUVEC foram cultivadas em meio EBM (Lonza Walkersville, MD EUA) na presença ou na ausência de VEGF (10 ng /ml). HUVEC foram incubadas durante 24 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 ambiente e após coloração com o corante de fluorescência de calceína AM (Biolabs, Inc celular), a formação do tubo foi examinado e fotografadas utilizando um microscópio de fluorescência. A extensão da formação do tubo (comprimento médio tubo e pontos de ramificação) foi quantificada através de software de imagem (software J Imagem).

matrizes de anticorpos

matrizes de anticorpos específicos foram utilizados para determinar a expressão do receptor intracelular tirosina-quinase (RTK) relacionados com vias e a expressão de proteínas relacionadas com a pluripotência em extractos de células inteiras seguindo os protocolos fornecidos pelos fabricantes de sinalização. Resumidamente, os extractos celulares foram diluídas e incubadas durante a noite a 4 ° C com o PathScan RTK Sinalização Anticorpo Kit matriz Cell Signaling Technology) ou do proteoma Profiler pluripotentes estaminais humanas matriz celular (Cat # ARY010, R D Systems), seguido por uma detecção biotinilada cocktail de anticorpos. Estreptavidina-HRP conjugado e LumiGLO Reagente foram então usados ​​para visualizar o anticorpo ligado a detecção por quimioluminescência. Uma imagem do slide foi capturado com um sistema de imagem digital (ImageQuant LAS 4000, a GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, EUA) e foram analisados ​​utilizando o software de análise fornecida para medir as intensidades relativas spot.

Risco -wound cura ensaio

As células foram cultivadas em 6 multi-poços placas para uma monocamada quase confluentes. Após incubação durante 24 h as monocamadas confluentes foram riscado para formar uma “ferida” utilizando uma agulha estéril. Os detritos celulares foram removidos por lavagem com PBS. As células foram então cultivadas sob diferentes tratamentos na mídia apropriada para 24 h. As imagens foram registadas ao tempo 0 e 24 h, para se controlar a migração de células para a área ferida utilizando um fotomicroscópio luz. Para quantificar (programa Image-J) a percentagem de ferida (área de rascunho) a 0 h (controle) foi atribuído arbitrariamente como 100% ea porcentagem de cicatrização de feridas, às 24h (de controlo não tratado e tratado) foi comparado ao controle. Cada ensaio foi realizado em triplicado.

quantitativo em tempo real inverter reacção em cadeia com transcriptase-polimerase

O ARN total foi extraído por RNeasy Mini Kit Além disso (Quiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. A concentração de RNA foi determinada espectrofotometricamente a 260 e 280 nm, e as amostras de ARN foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. Um passo de reacção da cadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR) foi realizada utilizando o kit de QuantiTect SYBR Green RT-PCR (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante. Os níveis de expressão do gene de VEGF foram medidos por quantitativo em tempo real de RT-PCR utilizando o sistema termociclador LightCycler (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usado como gene de manutenção. tamanho teórico de produtos de PCR, sequência de primers utilizados para o estudo e eficiência foram: VEGF: (254 pb), primer Forward: 5′-CCCTGATGAGATCGAGTACATCTT -3 ‘; iniciador inverso: 5′-AGCAAGGCCCACAGGGATTT-3, Eficiência: 2; GAPDH: (240 pb), Iniciador directo: 5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 ‘;

Iniciador inverso: 5′-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3′, Eficiência: 2; Os resultados foram normalizados para que de GAPDH e quantificação da expressão relativa foi determinada pela 2

-ΔΔCt método.

A expressão transiente do gene K-ras mutante em células Caco-2

Caco -2 células foram transf ectadas transitoriamente com o plasmídeo pBabe K-Ras 12V ou o vector vazio (pBABE-puro), fornecida por Addgene (plasmídeos # 12544 e # 1764). PureYield plasmídeo Midiprep System (Promega) foi utilizado seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. As células foram semeadas a 90% de confluência em placas de 6 poços e depois de 24 h as células foram transfectadas utilizando Lipofectamine 3000 (Life Technologies) como reagente de transfecção, seguindo as instruções do fabricante. Análise de activação independente de EGF de ERK1 /2 por Western blot e proliferação celular foram realizadas em células transfectadas.

Microscopia

imunofluorescência confocal

As células foram cultivadas sobre lamelas tratadas com poli-L-lisina para formar uma monocamada quase confluente e, após 6h dos diferentes tratamentos. Em seguida, o meio de cultura foi rejeitado, as células foram lavadas três vezes em PBS e permeabilizadas em metanol. Após lavagem com PBS, lamelas foram incubadas com anti-β-catenina (1/250) de mAb de ratinho (BD) e FOXM1 (1/250) pAb de coelho (Santa Cruz Biotechnology), durante 1 h à temperatura ambiente, lavou-se três vezes em PBS e marcado com um anticorpo anti-IgG de ratinho-Alexa Fluor 488 marcado (1/500) (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) e com IgG anti-coelho (H + L) Alexa Fluor 594 anticorpo marcado (1/500) (Santa Cruz Biotechnology), durante 1 h à temperatura ambiente. Finalmente, as células foram incubadas com 300 nM de 4 ‘, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Lamela foram montados usando do Aqua Poly /Mount (Polysciences, Warrington, PA, EUA) e visualizados em uma Zeis LSM 5 Exciter microscópio confocal de varredura a laser (Zeiss, Alemanha). As imagens foram analisadas usando o software de imagem-J (National Institutes of Health).

Ensaios

Co-imunoprecipitação

As células foram lisadas em tampão de co-IP (HEPES 10 mM, KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl

2, 0,5 mM DTT, 0,5 mM de PMSF, 0,075% de NP40 e 1% v /v de proteases /fosfatases inibidor cocktails), centrifugou-se e limpou-se incubação com 22,5 ul de proteína por gel /g durante 1 h a 4 ° C. O sobrenadante pré-clarificado foi submetido a IP usando os anticorpos indicados primeiros a 4 ° C durante 1 h. Em seguida, os complexos de proteínas foram recolhidos por incubação com 22,5 ul de proteína por gel /g a 4 ° C durante a noite. Os complexos de proteína recolhidos foram lavados três vezes com tampão de PBS, centrifugou-se a 14000 xg, a 4 ° C durante 10 min, e analisados ​​por transferência de Western.

A análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± erro padrão da média. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism 5. Antes de comparar dois grupos de dados, um teste de normalidade e um teste de variância igual foram realizados. Se os grupos de dados passou ambos os testes, a comparação foi feita por uma abordagem paramétrica (teste t de Student não pareado). Se o teste de normalidade e /ou igual variância foi violada, a comparação foi feita por um método não paramétrico (teste U de Mann-Whitney). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p 0,05.

Resultados

AEE788 inibe a proliferação celular, induz a apoptose e altera ciclo celular em células de câncer colorretal

AEE788 exerceu um efeito antiproliferativa no HCT-116 e células Caco-2 com um maior efeito antitumoral no caso de células Caco-2 (Fig 1A). A diferente sensibilidade para AE788 entre as duas linhas celulares foi mais evidente no caso da proliferação das células-driven EGF, em que a proliferação de células Caco-2 2,5 uM AE788 reduzida em 60%, ao passo que o K-Ras mutada células HCT-116 não eram significativamente afetada (Fig 1B). Em concordância com estes resultados, AEE788 exercida uma morte celular por apoptose dependente da dose em células Caco-2 mas não em células HCT-116 (Fig 1C). Além disso, o tratamento de CaCO 2-células com diferentes doses de AEE788 resultou num aumento da percentagem de células em fase G1 numa forma dependente da dose, em comparação com células não tratadas, enquanto que estas alterações no ciclo celular não foram observadas no-tratados AE788 K Ras mutado HCT-116 células (Figura 1D).

Um proliferação) das células foi avaliada após 72 horas de tratamento com diferentes doses de AEE788. B) Inibição da proliferação das células foi testada por AEE788 em células cultivadas na presença de EGF (100 ng /ml). C) A fracção de células apoptóticas foi estimada após 48 horas de tratamento com diferentes doses de AEE788 de células cultivadas na presença de EGF (100 ng /mL). D) Análise de ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo após 48 h de tratamento com diferentes doses de AEE788 de células cultivadas na presença de EGF (100 ng /mL). Os dados são médias ± SEM de três experiências independentes (* p 0,05, em comparação com o controlo).

AEE788 inibe a sinalização EGFR nas células de câncer colorretal

A seguir, analisadas a activação de EGFR, e ERK quinases AKT para avaliar a significância do bloqueio do sinal de EGFR nos efeitos anti-tumorais de AEE788 (Figura 2). O tratamento com AEE788 inibiu a fosforilação do EGFR em ambos HCT-116 e células Caco-2. No entanto AEE788 eixo EGF sinalização eficazmente inibida apenas em células Caco-2, tal como indicado pela inibição da fosforilação induzida por EGF de ERK 1/2 (figura 2). Além disso, foi observada uma inibição da fosforilação induzida por EGF de Akt Thr em Caco-2-tratada AEE788 mas não em células HCT-116. Portanto, a atividade anti-EGFR observado de AEE788 em células de cancro do cólon é fortemente dependente de status do tipo selvagem K-Ras.

Foram detectados As formas fosforiladas e não fosforiladas de EGFR, ERK 1/2 e Akt por Western-blot utilizando anticorpos específicos. As células foram cultivadas na ausência ou na presença de EGF (100 ng /mL) e tratou-se com AEE788 (2.5 uM) durante 5, 10 ou 15 min. O nível de actina expressão foi incluída como controlo de carga.

AEE788 inibe a proliferação impulsionado-VEGF em células Caco-2

Além da atividade anti-EGFR, AEE788 também tem como alvo sinalização VEGFR. A este respeito, a função do VEGF não está limitada a angiogénese e da permeabilidade vascular, e sabe-se que tanto a sinalização de VEGF autócrina e parácrina ocorrer em células tumorais [19]. Portanto, o próximo investigou se AEE788 prejudicar a sinalização de VEGF em células de câncer de cólon. Como mostrado na Fig S1, o tratamento com AEE788 inibiu a proliferação de células conduzida por VEGF em células Caco-2, mas não em células HCT-116.

COX-2 aumenta a eficácia antitumoral de AEE788

sabe-se que o VEGF estimula a síntese de prostaglandina e a expressão de COX-2, que por sua vez induz a produção de VEGF [20,21]. Portanto, a combinação com inibidores de COX-2 pode ser um meio eficaz para aumentar a actividade de AEE788. Tal como mostrado na Fig 3, a adição de ambos NS-398 e celecoxib, dois bem conhecidos inibidores COX-2 selectivos, aumentou o efeito anti-tumoral da AEE788, tal como indicado pela inibição da proliferação das células (Figura 3A). Além disso, o tratamento combinado com AEE788 e celecoxib aumentou a percentagem de células Caco-2 presos em G1 (Figura 3B). Em particular, observou-se uma percentagem significativamente mais elevada de células em fase G1 na sequência do tratamento combinado do que com somente uma das drogas. Pelo contrário, nenhum destes efeitos foram observados em células HCT-116, que podem ser relacionadas com os níveis de expressão muito mais baixos da COX-2 nestas células em comparação com células Caco-2 (Fig 3C) e o seu mutante de estado K-Ras. Assim, a transfecção de células Caco-2 com um mutante de plasmídeo expressando K-Ras confirmou que a activação a jusante da via EGFR-Ras-ERK, como mostrado pela ERK1 2 fosforilação independente de EGF /, aboliu a actividade antiproliferativa de AEE788 e /ou celecoxib (Figura S2). Além disso, o celecoxib inibida em mais de 70% de produção de PGE2 em células Caco-2 (S3) Fig. Além disso, verificou-se que o tratamento AEE788 diminuição da expressão da proteína COX-2 em células Caco-2, explicar a redução de 40% na produção de PGE2, enquanto que a inibição de actividade enzimática de COX-2 com o celecoxib não afectou COX-2 (S3 Fig ). Assim, o tratamento combinado de AE788 e celecoxib inibida EGFR, ERK 1/2, e fosforilação de AKT (Ser /Thr) em células Caco-2 (Fig 3D). A análise quantitativa utilizando um painel de anticorpos contra quinases de sinalização mostraram que o tratamento combinado de células Caco-2 de células com AEE788 e celecoxib causou uma inibição significativamente maior de VEGFR, Akt (Ser /Thr) e fosforilação de Stat3 do que com o mesmo fármaco sozinho (S4 figura).

a) a proliferação celular orientada-EGF foi ensaiada em células cultivadas na presença de EGF (100 ng /ml) e na presença ou ausência de AEE788 (2,5 uM), celecoxib (10 uM) e NS- 398 (10 uM). B) Análise de ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo após 48 h de tratamento com AEE788 (2,5 uM) e /ou o celecoxib (10 uM) de células cultivadas na presença de EGF (100 ng /mL). C) Os níveis de expressão de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) foram analisados ​​por Western-blot em extractos de células inteiras formar Caco-2 e HCT-116 células. Expressão de β-actina é incluída como controlo de carga. D) As formas fosforiladas e não fosforiladas de EGFR, Akt e ERK 1/2 foram detectadas por Western-Blot, utilizando anticorpos específicos. As células foram cultivadas na presença de EGF (100 ng /mL) e tratou-se com AEE788 (2,5 uM) e /ou o celecoxib (10 | iM) durante 6 h. O nível de expressão -actina foi incluída como controlo de carga. A análise densitométrica correspondente também é mostrada. Os dados são médias ± SEM de três experiências independentes (* p 0,05, comparado com o controlo; # p 0,05, comparado com células tratadas com AEE788).

COX-2 inibição intensifica a anti -angiogenic actividade de AEE788

a inibição da COX-2 em combinação com a actividade anti-EGFR /VEGFR de AEE788, causou uma redução significativa na expressão de VEGF-a ARNm (Figura 4A) e os níveis de secreção de proteínas VEGF165 (Figura 4B) em células Caco-2, mas não em células HCT-116. Além disso, os ensaios de formação de tubos endoteliais mostraram que a actividade angiogénica de Caco-2 de meio condicionado foi significativamente menor quando as células foram tratadas com AEE788 e celecoxib do que com qualquer um dos fármacos sozinhos. (Fig 4C e 4D).

) níveis de uma expressão de VEGF-A de mRNA foram ensaiadas pelo tempo real de RT-PCR em células de cancro colorrectal que crescem na presença de EGF (100 ng /ml) e exposto ao indicado tratamentos durante 48 h. B) VEGFA165 níveis foram quantificados por ELISA nos meios condicionados recolhidos de células cultivadas na presença de EGF (100 ng /mL) e tratado com AEE788 (2,5 uM) e /ou o celecoxib (10 uM) durante 48 h. Os dados são médias ± SEM de três experiências independentes (* p 0,05, comparado com o controlo). C) A atividade angiogênica de meios condicionados por 2-Caco células expostas durante 24 h para os tratamentos indicados foi avaliada utilizando o ensaio de tubo endotelial como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são o comprimento total de tubos formados em pixels (px), mostrando médias ± SEM de três experiências independentes (* p 0,05, comparado com o controlo). D) Imagens representativas das redes interconectadas formada após o tratamento de células endoteliais com células Caco-2 indicadas meios condicionados. A extensão da formação do tubo foi quantificada tal como indicado na secção de Materiais e Métodos. (Ampliação final: X40, barra de escala corresponde a 100 microns)

Além das funções do VEGF na angiogese e nas células endoteliais, a promoção da migração de células de cancro foi mostrada para estar entre o. funções autócrina de VEGF em células tumorais [22,23]. Portanto, o próximo investigados os efeitos de AEE788 e /ou celecoxib sobre células Caco-2 e migração de células HCT-116 utilizando o ensaio de zero-ferida cura.