Abstract

Fundo

A multirresistência (MDR) é um grande problema no tratamento bem sucedido de cancros. ABCG2 humano, um membro da superfamília de ligação a ATP cassete transportador, desempenha um papel chave em MDR e um papel importante na protecção das células estaminais do cancro. KO de ABCG2 não teve qualquer efeito adverso aparente sobre os ratinhos. Assim, ABCG2 é um alvo ideal para o desenvolvimento de agentes sensibilizadores de quimioterapia para um melhor tratamento de cânceres resistentes aos medicamentos e ajudar a erradicar as células-tronco do câncer.

Métodos /resultados preliminares

Usando triagem racional de representantes de uma biblioteca de compostos químicos, encontramos um novo inibidor de ABCG2, PZ-39 (N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide), que tem dois modos de acção por inibição da actividade de ABCG2 e acelerando a sua degradação dependente de lisossoma. PZ-39 não tem efeito sobre ABCB1 e de efluxo de fármacos mediado-ABCC1, resistência, e a sua expressão, o que indica que podem ser específicos para ABCG2. As análises dos seus compostos analógicos mostrou que o farmacóforo de PZ-39 é benzotiazol ligados a um backbone anel de triazina.

Conclusão /Significado

Ao contrário de inibidores previamente conhecidos transportadores ABCG2, PZ-39 tem um novel ação de dois modos através da inibição da atividade ABCG2, um efeito agudo, e acelerando a degradação dependente do lisossoma, um efeito crônico. PZ-39 é potencialmente uma sonda valioso para estudos de estrutura-função de ABCG2 e um composto de chumbo para o desenvolvimento de terapias dirigidas MDR mediada por ABCG2 na quimioterapia do cancro de combinações

Citation:. Peng H, Dong Z, Qi J, Yang Y, Liu Y, Z Li, et ai. (2009) A Novel Two Mode-Acting inibidor da ABCG2-Mediated Multidrogaterapia Transportes e Resistência no Cancer Chemotherapy. PLoS ONE 4 (5): e5676. doi: 10.1371 /journal.pone.0005676

Autor: Paul Cobine, Universidade de Auburn, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de março de 2009; Aceito: 01 de maio de 2009; Publicado em: 24 de maio de 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede R01 CA120221 e R01 CA113384. ZD e YY foram apoiados, em parte, pela NRSA T32 DK07519 e T32 HL07910 do National Institutes of Health, respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a multirresistência (MDR) é um grande problema no sucesso do tratamento de cancros. A sobre-expressão de alguns membros da superfamília de transportador (cassete de ligação ao ATP) ABC tem sido sugerido para causar MDR. P-glicoproteína (MDR1 /ABCB1), multirresistência proteína 1 (MRP1 /ABCC1) e proteína de resistência do cancro da mama (BCRP /ABCG2) são três grandes transportadores ABC que são jogadores importantes no desenvolvimento clínico da MDR [1]. Um destes membros, ABCG2 que se pensa existir e funcionar como homo-oligómeros de 8-12 subunidades [2], [3], [4], também tem sido implicada como desempenhando papéis na protecção de células estaminais do cancro, resultando em droga resistência e falha de quimioterapia de câncer [5]. Anticancer substratos de drogas ABCG2 incluem, mas não estão limitados aos fármacos antineoplásicos normalmente utilizados, tais como a adriamicina, mitoxantrona e topotecano. Com efeito, estudos clínicos recentes têm mostrado que a sobre-expressão de ABCG2 em adultos e leucemia infância se correlaciona muito bem com prognóstico pobre (para uma revisão ver [6]). Knockout de ABCG2 não teve efeito aparente adverso sobre o desenvolvimento, bioquímica e de vida dos ratinhos [7]. Todas estas observações anteriores fazer ABCG2 um alvo ideal para o desenvolvimento de agentes sensibilizadores de quimioterapia para um melhor tratamento de cânceres resistentes aos medicamentos e sugerem que a inibição ABCG2 improvável irá causar qualquer efeito secundário se o inibidor é específico para ABCG2.

Em comparação com as bem conhecidas de drogas que causam resistência transportadores ABC tais como ABCB1 e ABCC1, ABCG2 foi descoberta relativamente recente e, assim, alguns inibidores específicos de ABCG2 têm sido relatados. Um dos inibidores conhecidos específicos ABCG2 é o potente micotoxina Fumitremorgin C (FTC) secretada de

Aspergillus fumigatus

[8], [9]. No entanto, a neurotoxicidade de FTC limita o seu potencial terapêutico. Análogos de FTC, tais como Ko132 e Ko143, têm sido desenvolvidos com uma baixa toxicidade [10], mas ainda não é conhecido se eficazes em ensaios clínicos. Além disso, outros inibidores de ABCG2 foram relatados [11], [12]. No entanto, estes agentes, tais como o GF120918, parecem não ter especificidade devido ao seu efeito sobre ABCB1 e /ou ABCC1 [13], [14]. Claramente, os inibidores ABCG2 mais específicos são necessários para o desenvolvimento futuro de potenciais quimio-sensibilizadores para melhor cânceres resistentes deleite drogas.

Neste artigo, relatamos a descoberta de um novo inibidor ABCG2 específico, PZ-39 (N- ( 4-clorofenil) -2 – [(6 – {[4,6-di (4-morfolinil) -1,3,5-triazin-2-il] amino} -1,3-benzotiazol-2-il) sulfanil ] acetamida), que é muito mais eficaz em reverter a resistência a drogas mediada por ABCG2 e menos citotóxica para células de cultura em comparação com FTC. PZ-39 parece ter dois modos de ações, causando a degradação ABCG2 (crónica), além de inibir a sua actividade (aguda). O efeito similar de três compostos PZ-39 relacionados revelou base estrutural para a concepção de inibidores específicos ABCG2 mais potentes no futuro.

Resultados

Efeito do composto PZ-39 sobre o acúmulo de mitoxantrona

Usando uma triagem racional de representantes de diferentes classes de uma pequena biblioteca de compostos molécula de Specs (www.specs.net) de potenciais inibidores de efluxo de droga mediada por ABCG2, identificamos um composto, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide) com benzotiazole ligado à espinha dorsal do anel triazina, (denominado PZ-39 depois, ver Fig. 1) que drasticamente invertida acumulação mitoxantrona em células MCF7 /AdVp3000 ABCG2 que sobre-expressa. Como mostrado na Fig. 2A, PZ-39 melhorada acumulação mitoxantrona em MCF7 /AdVp3000 mas não as células MCF7 sensíveis parentais que não produzem ABCG2, sugerindo que o efluxo de fármacos mediado-ABCG2 foi inibida. Como as células MCF7 /AdVp3000 também sobre-expressar outros transportadores ABC tais como ABCC3 além de ABCG2 [15], PZ-39 pode inibir a ABC excepto ABCG2 transportadores, levando ao aumento da acumulação de mitoxantrona. Para testar diretamente se PZ-39 inibe ABCG2, realizamos estudos semelhantes usando células transfectadas-ABCG2 HEK293 estável (HEK293 /ABCG2) [3]. Como mostrado na Fig. 2B, a pré-incubação de células com PZ-39 melhorada acumulação intracelular em células HEK293 mitoxantrona /ABCG2 mas não no controlo transfectadas com vector (HEK293 /Vec) células. Assim, PZ-39 inibe provavelmente mediada por ABCG2 efluxo mitoxantrona. As Figs. 2A e 2B mostram também que PZ-39 a 3,3 pM atingido um nível equivalente de efeito para o conhecido inibidor de FTC ABCG2 específico a 10 uM, o que sugere que PZ-39 pode ser ~ 3 vezes mais potente do que o FTC.

PZ -39, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide, e seus análogos C6, C8 e E2 todos contêm um benzotiazole ligado a um esqueleto de anel de triazina. Os três anéis intactos são rotulados como A, B e C.

A e B, a acumulação de mitoxantrona em MCF7 ou sua sublinha resistente a medicamentos MCF7 /AdVp3000 (A) e células HEK293 transfectadas com vector ou ABCG2 (B) após uma incubação de 30 minutos na ausência ou na presença de PZ-39 (3,3 uM) ou FTC (10 uM). Os dados são médias ± DP de três experiências independentes (* P 0,05; ** P 0,01 comparado com o veículo DMSO). C e D, a resposta dose de PZ-39 e FTC na restauração da acumulação mitoxantrona em células HEK293 transfectadas com ABCG2. A linha grossa mostra o nível de acumulação de mitoxantrona em células HEK293 transfectadas com vector, servindo como um controlo.

Para investigar ainda mais a potência de PZ-39 para ABCG2, o efeito de resposta à dose de PZ-39 no acúmulo de mitoxantrona em HEK293 /células ABCG2 foram determinadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 2C, o nível mitoxantrona intracelular foi aumentada em PZ-39 de uma maneira dependente da dose. A 3,3 mM, PZ-39 restaurado completamente nível mitoxantrona intracelular em células /ABCG2 HEK293. FTC, por outro lado, conseguida nível semelhante de efeito apenas com 10 uM (Fig. 2D), suportando o argumento de que PZ-39 é mais potente do que a FTC (ver acima).

A sensibilização da resistência aos medicamentos por PZ-39

Para investigar o uso potencial de PZ-39 como um quimio-sensibilizador de resistência aos medicamentos mediada por ABCG2, o efeito de PZ-39 na resposta à droga de células /ABCG2 HEK293 foi determinada na ausência ou presença de 0,1 mM mitoxantrona que por si só produziu morte celular ~ 10%. Como mostrado na Fig. 3A e 3B, PZ-39 não é citotóxica para células HEK293 /ABCG2 células e seu IC

50 não é mensurável dentro da gama de concentrações utilizada enquanto que a IC

50 de FTC é ~24 uM. O IC

50 de PZ-39 e FTC necessário sensibilizar a resistência mitoxantrona é -15 nM e ~387 nM, respectivamente. O índice de potência de PZ-39 é estimada em 1600 enquanto que a do FTC é única ~62 (Tabela 1)

A e B, o índice de potência de PZ-39 em comparação com FTC na inversão da resistência à mitoxantrona. . células HEK293 /ABCG2 foram tratados com ou sem 0,1 fiM (IC

10) mitoxantrona na ausência ou na presença de diferentes concentrações de PZ-39 (A) ou FTC (B), seguido pelo ensaio de SRB. Os dados são representativos de quatro experiências independentes. C e D, o índice de sensibilização de PZ-39 (C), em comparação com FTC (D) em células /ABCG2 HEK293. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com várias concentrações de mitoxantrona na ausência ou na presença de diferentes concentrações de PZ-39, seguido pelo ensaio de SRB. Os dados são representativos de quatro experiências independentes. E, multidroga Índice de Sensibilização de PZ-39 em células MCF7 /AdVp3000 selecionada com a droga. As células MCF7 /AdVp3000 foram tratados com várias concentrações de adriamicina (ADR), camptotecina (CPT), ou mitoxantrona (MX) na presença de DMSO (veículo), 200 nM de PZ-39, ou FTC seguido pelo ensaio de SRB. Índice de Sensibilização foi calculado usando IC

50 de mitoxantrona na ausência ou presença de PZ-39 ou FTC. Os dados apresentados são a média ± DP de três experiências independentes.

Para investigar mais a actividade inibidora de PZ-39 na ABCG2, os efeitos da PZ-39 sobre a citotoxicidade mitoxantrona em HEK293 /ABCG2 as células foram avaliadas na presença de três concentrações diferentes de PZ-39 (50, 200, e 500 nM) ou o controlo de veículo (0,1% DMSO). Como mostrado na Fig. 3C, PZ-39 a 50 nM reduziu significativamente o IC

50 de mitoxantrona com um índice de sensibilização de 0,4 (Tabela 2). A 500 nm, o índice de sensibilização de PZ-39 é de 0,04 enquanto que a FTC na mesma concentração é de 0,26 (Fig. 3D e Tabela 2). Estes resultados mostram que PZ-39 é um novo inibidor ABCG2 muito potente.

Para investigar se PZ-39 pode reverter multirresistência mediada por ABCG2 em uma linha de células de câncer resistente a medicamentos, foi utilizada a droga seleccionado células MCF7 /AdVp3000 e testados dois substratos de drogas anti-cancro adicionais de ABCG2, adriamicina e camptotecina. Como mostrado na Fig. 3E, PZ-39 a 200 nm drasticamente reduzida a resistência de células MCF7 /AdVp3000 a Adriamicina e camptotecina semelhante à mitoxantrona, enquanto que o controlo FTC mostraram muito menos efeito de sensibilização para todas as três drogas em comparação com PZ-39 com a mesma concentração.

Dois modos de ação

Para entender o mecanismo de PZ-39 ação na inibição de transporte de droga mediada por ABCG2, investigamos primeiro a cinética de PZ-39 inibição usando isolado dentro para fora vesículas de membrana [16] . Determinou-se a alteração na absorção de mitoxantrona na presença de diferentes concentrações de PZ-39. Como mostrado no gráfico de Lineweaver-Burk (Fig. 4A), a Km e Vmax de transporte mitoxantrona na ausência de PZ-39 foram estimadas como sendo de 2,3 uM e 455 pmol /mg de proteína, respectivamente. Parece que tanto o Km e Vmax de transporte mitoxantrona ter sido diminuída na presença de PZ-39 com um Ki estimado de ~0.52 pM, sugerindo que PZ-39 se comporta como um inibidor de tipo misto de transporte mitoxantrona [17]. Uma vez que também foi originalmente especulado que alguns inibidores iria competir com o sítio de ligação a ATP no transportador ABCG2, foi realizada uma outra experiência utilizando ATP como substrato variável. Como mostrado na Fig. 4B, tanto o Km e Vmax de transporte mitoxantrona também foram alterados por PZ-39. Assim, o nosso estudo mostrou que o processo de transporte mitoxantrona e ligação de ATP pode ser inibida por PZ-39 com um mecanismo de tipo misto. Provavelmente, PZ-39 se liga a um site diferente na ABCG2 tanto mitoxantrona e ATP, não inibidor competitivo de qualquer um deles.

Inside-out vesículas de membrana plasmática de HEK293 /células ABCG2 foram incubadas com 0,6, 1,2 , e 1,8 uM [

3H] mitoxantrona (a) ou com 0,1, 0,2, 0,5, 1, e 5 mM de ATP em conjunto com 0,6 ^ M [

3H] mitoxantrona (B) na ausência ou na presença de diferentes concentrações de PZ-39 a 37 ° C durante 5 minutos, seguido de determinação da absorção de mitoxantrona. Os dados apresentados são média ± D.P.. de três experiências independentes.

próximo testado se PZ-39 inibe possivelmente ABCG2 oligomerização desde ABCG2 tem sido sugerido para funcionar como um homodímero ou formas superiores de oligómeros e de oligomerização pode ser utilizado como alvo para fármaco terapêutico desenvolvimento [2], [3]. Para este efeito, a co-imunoprecipitação de dois ABCG2 diferencialmente etiquetadas foi realizada como previamente descrito [2] na sequência de um tratamento de 6 horas com PZ-39 a 3,3? M. No entanto, nenhum efeito de PZ-39 na co-imunoprecipitação ABCG2 foi encontrado (suplementar Fig. S1), sugerindo que PZ-39 não afeta oligomerização ABCG2.

Para examinar ainda mais o mecanismo de PZ-39 efeito sobre ABCG2, foi realizada uma análise western blot de expressão ABCG2 após o tratamento PZ-39. Como mostrado na Fig. 5A, o nível de estado estacionário de proteína ABCG2 diminuiu drasticamente em um dia após o tratamento PZ-39. Mas, ele tinha apenas diminuição marginal em 2 horas após o tratamento PZ-39. Como descrito acima, PZ-39 foi capaz de inibir o efluxo mediado por ABCG2 mitoxantrona de células resistentes aos medicamentos com uma HR de incubação. Estes achados sugerem que PZ-39 pode ter dois modos de acção através da inibição da atividade (efeito agudo) e expressão (efeito crônico) do ABCG2 e consistente com a nossa observação de que PZ-39 é cerca de 3 vezes melhor do que a FTC no ensaio de acumulação do fármaco ( efeito agudo), mas ~ 7 vezes mais potente no ensaio de sensibilização droga (efeito crônico).

a, efeito da PZ-39 no nível de estado estacionário ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com veículo de DMSO ou 3,3 uM PZ-39 durante vários tempos e colhidas para análise por Western blot da expressão ABCG2. B, efeito da PZ-39 sobre a estabilidade ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram primeiro tratadas com ciclo-heximida (5 ug /ml), seguido pela adição de 3,3 ^ M PZ-39 ou DMSO durante vários tempos e colhidas para análise de Western blot. C, meia-vida de ABCG2. níveis ABCG2 em western blot, conforme mostrado em B foram determinados usando Scion imagem e representados graficamente contra o tempo de tratamento. Os dados apresentados são média ± D.P. de quatro experiências. D, efeito da PZ-39 em 5D3 coloração de ABCG2. HEK293 /células ABCG2 foram tratadas sem (linha fina) ou com (espessura de linha) do veículo DMSO, 10 mM PZ-39 ou FTC seguido por coloração com anticorpo monoclonal 5D3 e citometria de fluxo. E, o efeito da FTC na expressão ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratadas com 10? M FTC durante vários tempos e colhidas para análise por Western blot da expressão ABCG2. F, efeito da bafilomicina A

1 e MG-132 sobre a degradação ABCG2 induzida por PZ-39. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com 3? M PZ-39 na ausência ou na presença de 10 nM de A bafilomicina

1 ou 2 ^ M MG-132 por várias vezes e colhidas para análise por Western blot da expressão ABCG2. GAPDH foi usada como um controlo de carga em toda a análises de Western blot.

Para determinar se o efeito crónico de PZ-39 sobre a expressão ABCG2 é ao nível do ARNm, foi realizada a análise em tempo real de RT-PCR de MCF7 /AdVp3000 e HEK293 /ABCG2 células tratadas com PZ-39 por várias vezes até 3 dias. Nenhuma mudança significativa foi encontrada no nível de mRNA ABCG2 seguinte PZ-39 tratamento em qualquer linha de células (veja suplementar Fig. S2). Assim, PZ-39 afecta improvável expressão ABCG2 em seu nível mRNA. A seguir, a hipótese de que o mecanismo de inibição mediada por PZ-39 seria um processo de pós-transcricional e examinaram a possibilidade de que PZ-39 podem acelerar a degradação da ABCG2. Para testar esta possibilidade, células HEK293 /ABCG2 foram pré-tratadas com ciclo-heximida, o qual actua através da inibição da alongamento durante a síntese de proteínas, seguido por tratamento com PZ-39 por várias vezes para determinar a taxa de degradação ABCG2. Como mostrado na Fig. 5B, a perda de ABCG2 em células tratadas com uma combinação de PZ-39 e ciclo-heximida foi muito mais rápida do que a do controle sem tratamento PZ-39. A meia-vida de ABCG2 na presença de PZ-39 é estimado para ser ~ 5 horas que é estável com uma semi-vida estimada do ~54 horas no controlo (Fig. 5C). Assim, PZ-39 provavelmente acelera a degradação da proteína ABCG2.

Efeito de PZ-39 na conformação ABCG2 e estabilidade

A degradação acelerada de ABCG2 por PZ-39 pode ser devido a que PZ -39 induz mudança conformacional e alvo ABCG2 para a degradação. Para determinar se PZ-39 potencialmente provoca alterações conformacionais de ABCG2, utilizou-se o anticorpo monoclonal 5D3 que tenha sido relatada previamente para se ligar a ABCG2 na superfície de células mais facilmente na presença de inibidores ABCG2 presumivelmente devido ao inibidor da induzida por alterações conformacionais [12] , [18]. Como mostrado na Fig. 5D, PZ-39 causou um aumento na coloração com 5D3, sugerindo uma possível alteração conformacional de ABCG2 sobre PZ-39 de ligação. FTC também aumentou coloração 5D3 como esperado. No entanto, isso não afecta o nível de ABCG2 (Fig. 5E), o que sugere que a mudança conformacional induzida por FTC e PZ-39 pode ser diferente. Foi relatado recentemente que existem duas vias distintas, para a degradação do tipo selvagem e proteínas ABCG2 mutantes [19]. Enquanto de tipo selvagem e proteína correctamente dobrada é degradada em lisossomas, a proteína mutante e misfolded está envolvida na degradação de proteínas mediado por ubiquitina em proteossomas. Para determinar ainda mais o mecanismo de degradação induzida ABCG2-PZ-39, que empregue bafilomicina

1, um inibidor da degradação de proteína nos lisossomas, e MG-132, um inibidor de proteossoma. Como mostrado na Fig. 5F, o co-tratamento de células com bafilomicina

1 e PZ-39 inibiu a degradação ABCG2-induzida por 39 PZ Considerando que o co-tratamento com MG-132 e PZ-39 não fizeram, indicando degradação ABCG2 que induziu-PZ-39 é provavelmente dependente de lisossoma-. Tomados em conjunto, podemos concluir que PZ-39 provoca alteração conformacional da ABCG2 e metas que para a degradação normal em lisossomos.

Efeito da PZ-39 na ABCB1- ou de transporte de droga mediada por ABCC1

Para determinar a especificidade de PZ-39, testou-se o efeito de PZ-39 sobre os outros dois transportadores ABC importantes bem conhecidos na MDR, ABCB1 e ABCC1. O efeito de PZ-39 em ABCB1 e diminuição mediada por ABCC1 na acumulação Adriamicina intracelular foi testado utilizando células MCF7 transfectadas com ABCB1 (bc19) [20] e as células transfectadas HEK293 com ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [16], [21 ]. Nós não encontrou nenhum efeito de PZ-39 sobre a atividade da ABCB1 e ABCC1 na diminuição da acumulação Adriamicina (veja suplementar Fig. S3A). Nós também não encontrou nenhum efeito de PZ-39 sobre o nível de proteína no estado estacionário de ABCB1 e ABCC1 após 3 dias de tratamento (Fig. S3B). Assim, provavelmente PZ-39 é específico para ABCG2 entre esses três MDR-causando transportadores ABC bem conhecidos que são acreditados para jogar um papel importante na resistência às drogas clínica.

Efeito da PZ-39 análogos em ABCG2

para entender melhor o farmacóforo de PZ-39, apreendemos 3 análogos de PZ-39 para a acumulação de drogas e os testes de resistência usando HEK293 /células ABCG2 em comparação com PZ-39. Estes análogos (C6, C8, e E2) têm todos os mesmos anéis intactos A, B e C como PZ-39, mas com diferentes grupos laterais (Fig. 1). Todos os três análogos tinha uma actividade semelhante como PZ-39 no aumento da acumulação mitoxantrona (Fig. 6A) e sensibilizar a resistência mitoxantrona em HEK293 /ABCG2 (Fig. 6B). Para determinar o efeito crônico destes análogos sobre a expressão ABCG2, foi realizada uma análise de mancha após o tratamento ocidental com C6, C8 e E2 por várias vezes até 3 dias. Como mostrado na Fig. 6C, todos os três análogos causou a expressão diminuída de ABCG2. Além disso, todos estes análogos também causou alterações conformacionais na ABCG2 semelhantes a PZ-39 (Fig. 6D). Assim, provável que o benzotiazole ligado a um esqueleto de anel de triazina pode ser a estrutura do núcleo para se ligar a e inibir a função ABCG2 e estabilidade.

A, efeitos de PZ-39 e seus compostos análogos (3 uM) sobre a acumulação de mitoxantrona em células /ABCG2 HEK293. Os dados apresentados são média ± D.P.. da triplicadas experiências. B, o índice de sensibilização das PZ-39 e compostos relacionados em células HEK293 /ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratados com várias concentrações de mitoxantrona na ausência ou na presença de 50 nM de PZ-39, C6, C8, e E2, seguido pelo ensaio de SRB. Sensibilização índice foi calculado usando IC

50 de mitoxantrona na ausência ou na presença de inibidores de compostos. Os dados são a média ± D.P.. de quatro experiências independentes. C, efeito dos compostos PZ-39 e relacionados selecionados em nível de estado estacionário ABCG2. células HEK293 /ABCG2 foram tratadas com o veículo DMSO ou 3 uM PZ-39, C6, C8, ou E2 durante vários tempos e colhidas para análise por Western blot da expressão ABCG2. D, efeito da PZ-39 e compostos relacionados, 5D3 coloração de ABCG2. HEK293 /células ABCG2 foram tratadas sem (linha fina) ou com (linha grossa) do veículo DMSO, 10 mM PZ-39 ou seus compostos relacionados C6, C8 e E2, seguido de coloração com o anticorpo monoclonal 5D3 e citometria de fluxo.

Discussão

neste estudo, nós investigamos um romance inibidor específico potente de ABCG2 humana, PZ-39, como um potencial agente terapêutico para sensibilizar a resistência aos medicamentos na quimioterapia do cancro. PZ-39 contém benzotiazole ligado a um esqueleto de anel de triazina. O seu mecanismo de acção parece ser de dois modos; inibição de tipo misto em função de transporte de drogas e acelerada degradação dependente de lisossoma de ABCG2. PZ-39 não é citotóxico em si com um IC

50 de . 24 uM, sendo muito potente na sensibilização de MDR de células cancerosas que sobre-expressam ABCG2

Muitos previamente relatados inibidores ABCG2 têm um largo espectro de metas transportadores ABC. ABCG2 GF120918 inibidor, por exemplo, de facto, inibe a função ABCB1 mais potentemente do que ABCG2. Até agora, muito poucos compostos foram identificados como inibidores específicos de ABCG2. Um tal exemplo é o derivado de FTC não-tóxico, Ko143. É mais potente do que outros análogos FTC, e não tem toxicidade em ratos a uma dose de 10-50 mg /kg por via oral [10]. Recentemente, dois dos compostos de flavona, 6-prenylchrysin e tectochrysin, têm sido mostrados para ser específico para ABCG2 e nenhuma interação foi detectado com qualquer ABCB1 ou ABCC1 [22]. Utilizando rastreio de alto rendimento, Henrich et ai. encontrados vários compostos que têm actividade inibidora semelhante ou menor em comparação com FTC [11], [12]. No entanto, nenhum destes inibidores específicos ABCG2 relatados foi testado clinicamente.

Em comparação com alguns dos inibidores conhecidos no passado ABCG2 específicos, tais como FTC, o novo composto de PZ-39 tem três vantagens distintas. Em primeiro lugar, PZ-39 é muito mais potente do que o FTC na inibição da função ABCG2. No ensaio de acumulação de droga, PZ-39 alcançada claramente o mesmo nível de inibição a 3,3 uM em comparação com FTC a 10 uM. No ensaio de sobrevivência de células, PZ-39 a 500 nm foi capaz de sensibilizar a resistência mediada por mitoxantrona ABCG2 com um índice de 0,04 ao passo que FTC na mesma concentração tem um índice de sensibilização de 0,26, ~ 7 vezes diferença. Em segundo lugar, PZ-39 tem muito baixa citotoxicidade intrínseca in vitro ( 24? M), mas o índice de potência é muito melhor do que a FTC (1600 versus 62). Assim, a janela de índice terapêutico de PZ-39 pode ser grande. Uma quimio-sensibilizador ideal é que ele não deve ser tóxico em si. Claramente, PZ-39 satisfaz este requisito in vitro em estudos. No entanto, são necessários estudos futuros para avaliar a toxicidade de PZ-39 em modelos animais. Em terceiro lugar, PZ-39 parece ter dois modos de acção. Em adição à sua capacidade para inibir a actividade ABCG2, PZ-39 também acelera a sua degradação dependente de lisossoma. Este segundo modo de ação é uma natureza distinta e claramente aumenta a potência de PZ-39 na ABCG2 possivelmente pelo uso reciclado de PZ-39. Esta natureza não tem sido relatada por quaisquer inibidores dos transportadores anteriores conhecidos ABC.

Os dois modos de ação fazer PZ-39 um muito interessante, a novela, e inibidor ABCG2 promissor para uma maior exploração. No primeiro modo de efeito agudo sobre a função ABCG2, PZ-39 parece exercer um tipo misto de inibição no ensaio de absorção de droga. PZ-39 pode interagir com ABCG2 diretamente, mas não aparecem para competir diretamente com mitoxantrona ou ATP vinculativo. Futuros estudos são necessários para identificar os locais de ligação PZ-39 em ABCG2. No segundo modo, PZ-39 parece acelerar a degradação ABCG2 nos lisossomas, um efeito crónica. É possível que a ligação de PZ-39 provoca alteração conformacional na ABCG2 que tem como alvo a para degradação nos lisossomas. É, no entanto, de salientar que a ligação do FTC também provoca ABCG2 mudança conformacional mas ele não acelerar a degradação ABCG2. Esta constatação sugere que a mudança conformacional induzida por PZ-39 e FTC pode ser diferente. Anteriormente, verificou-se que a degradação ABCG2 mutante de cisteína é através de proteossoma ao passo que a degradação normal do tipo selvagem é ABCG2 através lisossoma [19] com uma meia-vida de ~37 horas [23]. Também foi verificado que a degradação induzida por agonista do receptor de β

2-adrenérgico é a via lisossoma possivelmente reforçada por endocitose [24]. É tentador propor que a ligação de PZ-39 a ABCG2 é capaz de acelerar a endocitose e tráfico de ABCG2 superfície celular em lisossomos para degradação. esforços extensivos para avaliar melhor esta hipótese estão actualmente em curso em nosso laboratório.

Os análogos de PZ-39, C6, C8 e E2 com a mesma estrutura do núcleo todos parecem funcionar utilizando o mesmo mecanismo como PZ-39. Claramente, mais estudos serão necessários para testar mais análogos de PZ-39 com mais alterações no benzotiazol núcleo ligado a um backbone anel de triazina e elucidar relação estrutura-actividade de PZ-39 na inibição ABCG2. No entanto, as observações deste estudo indicam claramente que PZ-39 pode servir como um composto de chumbo para posterior projeto e otimização de inibidores ABCG2 mais específicas para um melhor tratamento de cancros humanos resistentes aos medicamentos em terapia combinatória.

Materiais e Métodos

Materiais

O anticorpo monoclonal BXP-21 contra ABCG2, anti-Myc e anticorpos anti-HA foram de ID Labs, sinalização celular, e Roche, respectivamente. antigody monoclonal contra Pgp, C219, foi um presente amável do Dr. Victor Ling (The Cancer Center British Columbia, Vancouver, Canadá). O anticorpo monoclonal contra MRP, MRPr1, foram adquiridos a Kamiya biomédica Companhia. anticorpo 5D3 conjugado-biotina e conjugados de ficoeritrina-estreptavidina de eBiosciences. Todos os reagentes de electroforese, kit de ensaio de concentração de proteínas, pré-moldados de géis de gradiente de poliacrilamida e membranas de difluoreto de polivinilideno foram adquiridos de Bio-Rad. FTC, adriamicina, mitoxantrona, camptotecina, DTT, Sulforrodamina B (SRB), e Triton X-100 foram de Sigma. Proteína-G PLUS-Agarose e de SYBR Verde PCR Master Mix eram de Santa Cruz Biotechnology and Applied Biosystems, respectivamente. LipofectAMINE Plus e G418 foram de Invitrogen. cultura de células meio IMEM, DMEM, e [

3H] mitoxantrona eram de Biosource International, Mídia Tech., e Moravek Biochemical, respectivamente. PZ-39 e três compostos relacionados foram adquiridos de especificações. Todos os outros produtos químicos foram de grau biologia molecular da Sigma ou Fisher Scientific.

cultura de células, preparações lisado, e de membrana

linha de mama humano de células cancerosas MCF7 (ATCC) e suas linhas de derivativos bc19 (a dom de Julie Horton no Instituto Nacional de Ciências de Saúde ambiental) e MCF7 /AdVp3000 (um presente de Susan Bates no Instituto Nacional do Câncer), HEK293 /ABCC1, HEK293 /vetor, HEK293 /ABCG2 foram cultivadas como descrito anteriormente [2], [16 ], [20], [25]. Lisado preparação foi realizada como descrito anteriormente [25]. As membranas celulares foram preparadas exactamente da mesma maneira como previamente descrito [16] e as membranas finais foram ressuspensos em STBs (sacarose 250 mM, NaCl 150 mM, Tris /HCl 10 mM, pH 7,5).

? Western blot? , imunoprecipitação e citometria de fluxo

Western blot, imunoprecipitação e análise de citometria de fluxo da acumulação de droga foram realizados exactamente como descrito anteriormente [2], [3]. Para determinar o mecanismo de degradação ABCG2, células HEK293 /ABCG2 foram primeiro tratadas com 10 nM de bafilomicina

1 ou 2 ^ M MG132 durante 24 horas seguida por tratamento adicional com 3? M PZ-39 durante vários tempos. Os lisados ​​celulares foram então recolhidas para análise por Western blot de ABCG2. Para determinar a meia-vida de ABCG2, células HEK293 /ABCG2 foram tratados com 5 ug /ml de ciclo-heximida, 3? M PZ-39, ou ambos, para várias vezes, seguido de recolha de lisados ​​de células para análises de Western blot da expressão ABCG2. Para determinar a alteração no anticorpo 5D3 coloração após o tratamento com os inibidores, as células /ABCG2 HEK293 foram incubados com 10 ^ M PZ-39, C6, C8, E2, ou FTC a 37 ° C durante 30 min antes de anticorpo 5D3 conjugado com biotina (1: 100 de diluição) foi adicionado e incubado durante 2 horas. Em seguida, as células foram lavadas 3 vezes e incubadas com ficoeritrina-estreptavidina durante 30 min seguido de lavagem por 3 vezes e analisadas por citometria de fluxo.

em tempo real de RT-PCR e Ensaio de Citotoxicidade

ARN extracção e em tempo real de RT-PCR foram realizados como descrito anteriormente [25]. As sequências dos iniciadores são ABCG2 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 ‘(directo) e 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (inverso). As sequências dos iniciadores GAPDH são 5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 ‘(directo) e 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’ (inverso). O nível de ARN ABCG2 relativo (2

ΔCT) tratados com inibidores foi expressa como percentagem do controlo (na presença de DMSO a 0,1%) onde ΔCT (ciclo limite) = (CT

ABCG2-CT

GAPDH ).

a citotoxicidade foi determinada utilizando o ensaio colorimétrico SRB tal como previamente descrito [25]. O efeito de inibidores de compostos na resistência aos medicamentos foi determinada por exposição das células a uma gama de concentrações de fármacos anticancerígenos, tais como a mitoxantrona na ausência ou na presença de diferentes concentrações do inibidor. A potência e sensibilização índice dos inibidores foram calculados como se segue: Análise cinética

ensaio de acumulação do fármaco

acumulação do fármaco e transporte foi realizado como descrito anteriormente [16], [26], com algumas modificações. Resumidamente, 10

6 células em cultura foram pré-incubadas com várias concentrações de PZ-39, FTC, ou controlo de veículo (DMSO a 0,1%) durante 1 hr a 37 ° C, seguido pela adição de 20 uM mitoxantrona e incubação durante 30 minutos. A reacção foi parada por adição de PBS gelado e centrifugação, lavadas com PBS arrefecido em gelo, e submetidas a análise de citometria de fluxo.

ensaio da droga utilizando-absorção de vesículas de membrana foi realizada como previamente descrito [16] usando [

3H] mitoxantrona como substrato ABCG2.