Sumário

α-solanine, um esteróide de glicoalcalóides em batata, verificou-se ter a proliferação de inibição e efeito promotor de apoptose em várias células de cancro, tais como clone, fígado, células cancerosas de melanoma. No entanto, a eficácia antitumoral de α-solanina sobre o câncer de pâncreas não foi totalmente avaliada. Neste estudo, nós indagado sobre o efeito anti-cancerígeno do α-solanina contra as células cancerosas pancreáticas humanas. No presente estudo, nós investigamos o efeito anti-cancerígeno do α-solanina contra as células cancerosas pancreáticas humanas. In vitro, inibiram a proliferação de α-solanine PANC-1, sw1990, células MIA PaCa-2 de um modo dependente da dose, bem como a migração celular e invasão com doses atóxicos. A expressão da MMP-2/9, indutor de metaloproteinase de matriz extracelular (EMMPRIN), CD44, eNOS e E-caderina foram suprimidos por α-solanine em células PANC-1. Além disso, diminuiu significativamente a expressão e tubo de formação vascular factor de crescimento endotelial (VEGF) de células endoteliais foram discernido após o tratamento α-solanine. Suprimida fosforilação da Akt, mTOR, e Stat3, e reforçar a fosforilação de β-catenina foi encontrado, juntamente com marcadamente diminuída Tran-nuclear de NF-kB, β-catenina e TCF-1. Após a administração de α-solanine (6 ug /g durante 2 semanas) no modelo de xenoenxerto, o volume do tumor e peso foram reduzidas em 61% e 43% (p 0,05), respectivamente, mostrando a diminuição de MMP-2/9, PCNA e VEGF expressão. Em conclusão, α-solanina mostrou efeitos benéficos sobre o câncer de pâncreas in vitro e in vivo, o que pode através de suprimir a proliferação caminho, angiogênese e metástase

Citation:. Lv C, Kong H, Dong G, Liu L, Tong K, H Sun, et ai. (2014) antitumoral Eficácia da α-Solanine contra o cancro do pâncreas in vitro e in vivo. PLoS ONE 9 (2): e87868. doi: 10.1371 /journal.pone.0087868

editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicina da Universidade, Taiwan

Recebido: 02 de outubro de 2013; Aceito: 26 de dezembro de 2013; Publicação: 05 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lv et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi patrocinado da China National Natural Science Foundation (No. 81.070.372, No. 81.370.563), Zhejiang Programa Provincial para o cultivo de alto nível talentos de saúde inovadores e uma Administração Provincial de Medicina tradicional chinesa da província de Zhejiang, China (nO. WKJ2012-2 -033, No. 2011ZA072), um Programa de Pesquisa e Desenvolvimento do Distrito de Longwan Distrital de Wenzhou, Zhejiang, China (No. 2010YS5). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas carcinoma é um dos o câncer mais agressivo e letal, devido à falta de um diagnóstico precoce, droga-resistência e mau prognóstico, e como tal é a quarta principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1], [ ,,,0],2]. Actualmente, o tratamento padrão de carcinoma pancreático é dependente de cirurgia, radiação e drogas. No entanto, apenas cerca de 25% dos pacientes com câncer pancreático diagnosticado com a forma resectable atribuindo à invasão da doença [3]. Gemcitabina, um tratamento padrão de primeira linha de câncer pancreático metastático pelo presidente, é amplamente utilizado, mas exibe pobres efeito terapêutico para a aquisição de chemoresistance e uma variedade de reações adversas [4]. Assim, em busca de novos medicamentos eficazes contrapondo para aumentar a capacidade anti-angiogénico e restringir a metástase é desesperadamente necessário para câncer de pâncreas, tendo como alvo os seus tumores mais altamente vascularizadas e invasivos.

Além da indução de apoptose de células cancerígenas e necrose , a inibição da proliferação de células, a infiltração e metástase, é de primordial importância. metástases tumorais é um processo altamente coordenada que é promovida por vários enzimas proteolíticas que degradam a matriz extracelular (ECM) e a membrana basal (BM). As metaloproteinases de matriz (MMPs) são acreditados para dominar participar na migração de células de tumor, invasão de tecidos e metástases [5]. MMP-2 e MMP-9 têm um papel chave no processo de metástase entre as MMPs. A adesão celular molécula de E-caderina, regulação da polaridade celular, diferenciação, proliferação e migração através da sua íntima associação com a rede de actina do citoesqueleto [6], mostra uma menor expressão no cancro pancreático do que no tecido de pâncreas normal, [7]. Além disso, Wnt /β-catenina cascata de sinalização tem sido pertinentes ao câncer e proliferação vascular, especificação de destino e metástase celular. Wnt ligando se liga ao seu receptor Frizzled para inactivar o complexo de destruição β-catenina, conduzindo a acumulação β-catenina fosforilada em ambos citoplasma e núcleo. No núcleo, β-catenina forma um complexo heterodimérico com a família TCF /LEF de proteínas de ligação de ADN e, assim, activa a transcrição de genes alvo Wnt, comprometer c-Myc, survivina, cyclinD1, e MMPs [8]. Estudos recentes têm demonstrado que o fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) -Akt /alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) via também está envolvido em tumores endócrinos do pâncreas (animais de estimação) tumorigénese e progressão [9], [10], a sobrevivência celular, a adesão celular e metástase [11], [12]. Através diafonia com Wnt, NF-kB e MAPK, Akt /mTOR actividade promove a proliferação de células de cancro, a inibição de metástases e Apotosis [13], [14]. Além disso, proteínas STAT activada constitutivamente são encontradas em tumores múltiplos [15], [16], [17], [18]. Além disso, de Wnt /β-catenina e Akt vias /mTOR regula a expressão de MMP por factores de transcrição, como o NF-kB [19], [20]. Há evidências de que o NF-kB desempenha um papel fundamental na proliferação, inibição da apoptose e angiogénese de cancro pancreático [21]. Assim, bloqueando Wnt /β-catenina e Akt percursos /mTOR, bem como stat e NF-kB fornecer potenciais alvos para estratégias terapêuticas do cancro.

α-Solanine, um componente bioativo dos principais glicoalcalóides esteroidais em batatas é bem estudados por seu impacto sobre as propriedades antitumorais. Vários relatórios demonstraram que exibe a-Solanina inibição do crescimento e indução da apoptose em células de cancro múltiplas [22], [23]. É igualmente evidente α-solanine possuem efeitos anti-inflamatórios in vitro através da redução da interleucina-2 e interleucina-8 produções [24]. A eficácia e os mecanismos moleculares associados devido à a-solanina contra o câncer de pâncreas ainda não foram avaliados. Portanto, foi avaliada a eficácia de α-solanina utilizando câncer pancreático tanto in vitro como in vivo no presente estudo.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Neste estudo , cuidados com os animais e experimentos foram conduzidos de acordo com um protocolo aprovado pela Inspecção Ethical Experimental animal do Centro de animais de Laboratório, Wenzhou Medical College (Permit Number: wydw2013-0001). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

1. Linha de Células e Reagentes

α-solanine, sulfóxido de dimetilo (DMSO) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, E.U.A.). Kit de ensaio de proteína foi obtida a partir de Bio-Rad Labs (Hercules, CA, E.U.A.). meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e foi adquirido a partir de Gibco /BRL (Gaithersburg, MD, E.U.A.). Matrigel foi da BD Biosciences (Bedford, MA, E.U.A.). kit de extracção de ARN total e o kit de reacção em cadeia da polimerase (PCR) foram de Viogene (Sunnyvale, CA, E.U.A.). Os anticorpos contra a MMP-2, MMP-9, E-caderina, TCF-1, STAT3 e STAT3 fosforilado foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, U.S.A.). Os anticorpos contra β-actina, o VEGF, PCNA, β-catenina, Akt, mTOR, as proteínas fosforiladas foram adquiridos a Abcam (Cambridge, MA, EUA). PANC-1, sw1990, MIA PaCa-2 e UMBILICAL HUMANA células endoteliais da veia (HUVEC) foram obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA). linhas de células do cancro do pâncreas são mantidas em DMEM com 10% de FBS e incubadas numa CO 5%

2 incubadora humidificada a 37 ° C, As HUVECs foram cultivadas em meio M199 com 10% de FBS. a-Solanina foi fundida em DMSO e diluídos com meio de cultura (a concentração final de DMSO era inferior a 0,1%).

2. Ensaio de viabilidade celular e Colony Ensaio

Sementeira 20000 células de cada linha celular de cancro em cada poço da placa de 96 poços e substituindo o meio de cultura contendo várias concentrações de α-solanine (3,6,9,12 ug /ul) após 24 h. Continuando a desenvolver durante 24 e 48 h, em seguida, o meio foi substituído com meio fresco a inclusão de 10% CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão). Após 1-4 h, os sobrenadantes foram medidos por espectrofotometria a 450 nm.

Anchorage-independente do crescimento celular é avaliada através da realização do ensaio de colónias (GENMED SCIENTIFECS INC, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1,5 ml de base de agar matriz da camada é distribuído por cada poço de uma placa de 12 poços (as amostras foram ensaiadas em triplicado). Placa foi arrefecida à temperatura ambiente até solidificar. Em seguida, camada de agar a 1,5 mL de crescimento consistindo de 2500 células foi adicionado a cada poço. Placa foi refrigerado à temperatura ambiente novamente até que a camada de crescimento congelado. Um meio de cultura de 500 ul contendo ainda várias concentrações de α-solanine foi adicionado em cima da camada de crescimento. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO

2 durante 2 semanas e as colónias foram contadas no total.

3. A migração celular e invasão Ensaios

A migração celular foi estudada através da realização de ensaios de cura de feridas. 10000 células de cada linha celular de cancro pancreático foram plaqueadas em altas de 35 mm u-pratos com inserções de cultura (Ibidi, Martinsried, Alemanha). Quando as células cresceram até à confluência, as inserções foram em seguida removidas com fórceps estéreis para criar um campo de ferida de cerca de 500 um. Depois de remover os detritos celulares com PBS, as células foram expostas a várias concentrações de α-solanine durante 24 h. A migração celular foram percebidos pelos microscópio invertido e fotografado (100 vezes). A área ferida foi escalado por Image Pro Plus. A percentagem de fechamento da ferida foi calculado pela equação: Sutura% = [1- (área das feridas após 24 h /área da ferida após 0 h) × 100%

Os ensaios de invasão celular foram implementados utilizando câmaras Transwell 6,5 mm. equipado com membranas de policarbonato de poros de tamanho de 8,0-uM. Nestes ensaios, os champers superiores foram primeiramente revestidas com 50 ul de Matrigel a uma diluição de 1:05, e incubou-se a 37 ° C durante 2 h. Depois tratou-se com α-solanine durante 24 h, as células isentas de soro (10.000 células bem /) meio de suspensão de cada linha celular de cancro pancreático foram carregados na câmara superior do Transwell. As câmaras inferiores foram cheias com 500 ul de DMEM suplementado com FBS a 10%. Após incubação a 37 ° C durante 6 h, as células não-invasivos foram fisicamente raspada a partir da membrana com os cotonetes de algodão. As células invasivas foram coradas com DAPI durante 5 minutos e observadas com um microscópio de fluorescência (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). células fluorescentes foram contadas usando o Image Pro Plus.

4. Ensaio In Vitro A angiogénese

Análise da formação capilar foi realizada utilizando ensaios de formação de tubo (Ibidi, Martinsried, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, a 15 μ bem-Apresentações foi revestida com 10 uL de Matrigel que foi deixada solidificar a 37 ° C. Para avaliar o efeito de α-solanine, células PANC-1 foram tratadas com várias concentrações de α-solanine durante 24 h, depois o meio condicionado foram colhidos. As HUVEC foram colocadas no poço μ-corrediça e incubadas com meio condicionado de células PANC-1 durante 6 h. A geração de redes celulares foram fotografadas e avaliadas quantitativamente por Image Pro Plus.

5. Quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase

O ARN total foi extraído a partir PANC-1 com Reagente TRIzol (Ambion, Carlsbad, Califórnia, EUA) seguindo as instruções do fabricante. O ARN total (1 ug) de cada amostra foi submetido a RT oligo-dT-sensibilizados com ReverTra Ás qPCR RT kit (Toyobo, Osaka, Japão). Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para uma análise quantitativa da MMP-2, MMP-9, VEGF, EMMPRIN, E-caderina e a expressão de ARNm de CD44 utilizando SYBR Green PCR em tempo real Master Mix (Toyobo) numa 7,500 Tempo real PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 1 min, 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s. As sequências dos iniciadores para GAPDH, MMP-2, MMP-9, VEGF, ENOS, EMMPRIN, E-caderina e CD44 foram sintetizados pela Invitrogen e listados na Tabela 1. A análise em tempo real de dados quantitativa por PCR foi realizada em valores ΔCt.

6. Extracção da proteína e análise de Western Blot

células PANC-1 foram lisadas em tampão de ensaio radioimune precipitação (RIPA) contendo protease e o inibidor de fosfatase (Roche, Basileia, Suíça). As proteínas nucleares e citoplasmáticos foram extraídas com o citoplasmáticas de extracção Reagentes e Nucleares (Beyotime, Jiangsu, China) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas foram fraccionadas através de dodecilo de sódio géis de poliacrilamida de electroforese e transferidas para uma membrana de PVDF (Solarbio). As membranas bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado foram incubadas com anticorpos relevantes durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes com TBST e incubaram-se com anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de se lavar três vezes com TBST, as bandas alvo foram detectadas utilizando ECL (Advansta, Menlo Park, Califórnia, EUA) e exposta em filme. A densidade de bandas de proteínas foram medidos por Quantidade One.

7. Análise de MMP-2 e MMP-9 Actividades por zimografia em gelatina

As actividades de MMP-2 e MMP-9 foram analisados ​​por zimografia em gelatina. células PANC-1 foram incubadas com meio isento de soro com várias concentrações de α-solanine durante 24 h. O meio condicionado foi então recolhido e concentrado. Cada amostra (20 ug) foi misturada com tampão de carga e submetido em 10% de gel de SDS-poliacrilamida contendo 0,1% de gelatina. A electroforese foi realizada a 100 V durante 1,5 h a 4. Os géis foram em seguida lavadas com tampão de lavagem (2,5% de Triton X-100, 50 mmol /L de Tris-HCl, 5 mmol /L de CaCl

2, pH 7. 6), seguida de incubação a 37 ° C em tampão de reacção (50 mmol /L de Tris – HCl, 5 mmol /CaCl2, 0. 02% de Brij-35, pH 7,6). Após 42 h, os géis foram corados com Comassie azul (0,05% de Comassie azul, 30% de metanol, 10% de ácido acético) durante 3 h e descorado com solução de descoloração (20% de metanol, 10% de ácido acético, 70% ddH2O) até que o bandas claras foram visualizados.

8. Animais e ratos nus masculinos Tumores

atímicos (nu /nu) foram obtidos a partir de Xangai Lab. Centro de Pesquisa Animal (Xangai, China) e alojados em condições padrão de laboratório (condições pathogenfree com 12 h de luz 12 h cronograma /escuro). Para produzir animais tumorais, 5 × 10

6 células PANC-1 foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos quatro semanas de idade atímicos nu /nu macho. Quando os tumores eram mensuráveis, os ratinhos foram divididos em dois grupos (6 /grupo) de forma aleatória. cuidados com os animais e os experimentos foram conduzidos de acordo com um protocolo aprovado pelo Experimental animal Inspecção Ético dos Animais de Laboratório Centre, Wenzhou Medical College.

9. Método de Tratamento de Tumores e de Estudo Os xenoenxertos

O grupo de controlo, no qual 1 ml /g (peso dos ratos) de DMSO foi injectado na cavidade abdominal de cada ratinho; o grupo solanine, em que 1 ul /g (peso dos ratos) solanine foi injectada na mesma maneira. A concentração de solanine é de 5 ug /uL. Solanina tinha uma notável segurança na dose de 5 ug /g (peso dos ratos), e não houve diferenças clínicas e histológicas entre os grupos de controlo [25] e o tratamento. Cada grupo foi tratado com a droga uma vez por dia durante duas semanas. O peso corporal dos ratinhos e os seus tamanhos de tumor foram medidos todos os dias. Os ratinhos foram sacrificados 2 semanas após a administração da droga e os tumores foram cuidadosamente separadas e pesadas. O volume do tumor foi calculado pela fórmula: 0,5236 L1 (L2)

2, em que L1 é o diâmetro de comprimento, e diâmetro L2 é curto. Parte do tumor foi usado para transferência de Western e armazenado em paraformaldeído a 4% para imuno-histoquímica, e o restante foi congelada em azoto líquido.

10. Western Blot para a MMP-2 e MMP-9 e imuno-histoquímica para PCNA e Coloração de VEGF

O procedimento de extracção de proteína de xenoenxerto de tumor e processos de tratamento é o mesmo que o mencionado acima. seções 4 mícrons contíguos foram cortadas de parafina tecidos tumorais para imuno-histoquímica. As secções foram bloqueadas com soro de cabra e imunocoradas após desparafinização e reidratação. As secções foram então incubadas com uma diluição 1/200 de anticorpo primário contra PCNA ou VEGF durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com anticorpos secundários durante 60 min à temperatura ambiente. As lâminas foram desenvolvidos com diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina. O índice de proliferação (por 400 x campo microscópico) foi determinada como o número de células PCNA positivas /número total de células × 100. A densidade óptica integrada (IOD) foi analisada por quantificação do VEGF. 6 campos foram selecionados aleatoriamente a partir de cada seção. Os níveis médios IOD entre dois grupos foram então comparadas. Imagem-Pro Plus 6.0 software foi utilizado para análise.

11. Análise Estatística

Todas as análises foram realizadas por software SPSS17.0. Os dados apresentados são imagens representativas ou expressos em média ± S.E.M. de cada grupo. A diferença entre os grupos de células foram analisados ​​utilizando ANOVA e teste t para amostras independentes foi utilizado para análise entre os grupos in vivo. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados de

1.. α-solanine afectar a viabilidade celular e inibe a formação de colónia

Verificou-se que o tratamento de α-solanine (3,6,9 ng /mL) durante 24 h ou 48 h, não alterou a viabilidade de PANC-1 , sw1990 e células MIA PaCa-2 significativamente (Fig. 1A). A viabilidade celular foi diminuído significativamente após tratamento de α-solanine a 12 ug /ul. Os resultados revelaram que a citotoxicidade das células de cada linha celular não foram causados ​​por α-solanine aos 3, 6, 9 mg /mL durante 24 h e 48 h. Utilizou-se doses não-tóxicas de α-solanine por experiências in vitro.

(A) células de cada linha celular de cancro foram tratadas com várias concentrações de α-solanine para 24 h e 48 h. (B) Fotografias de crescimento celular independente de ancoragem de PANC-1 (100 x de ampliação). (C) O número de colónias foram quantificados e os dados foram calculados a partir de três experiências independentes. Cada barra representa a média ± S.E.M. (N = 3). ** P . 0,01, em comparação com o controlo

Para elucidar as funções de α-solanine no crescimento independente de ancoragem de células de cancro do pâncreas, utilizou-se um ensaio em agar mole. As células sem α-solanine tratada formada mais e maiores colónias de ácido a-solanina células tratadas (Fig. 1B, C), indicando que o crescimento independente de ancoragem de células de cancro do pâncreas foi inibida por α-solanine de uma forma dependente da dose.

2. α-Solanine inibe a migração celular e invasão

ensaio de cicatrização de feridas e transpoço ensaio de invasão foi realizada para observar o efeito de α-solanina em maigratoin celular e invasão. Os resultados mostraram que α-solanine suprimida a migração e a invasão de células de cancro do pâncreas de uma forma dependente da dose (Fig. 2).

As células foram tratadas com várias concentrações de α-solanine durante 24 h. (A) células foram fotografadas (ampliação x 100). (B) A área da ferida foram quantificados em quatro campos em cada tratamento, e os dados foram calculados a partir de três experiências independentes. (C) As células foram fotografadas (100 × maginfication). (D) As células invadidas foram quantificados por contagem fo as células marcadas com DAPI. Cada barra representa a média ± S.E.M. (N = 3) * p . 0,05, ** p 0,01, comparado com o controlo

3.. α-Solanine formação do tubo inibido de PANC-1 induzida ECs e Expressão de VEGF

Nós descobrimos que meios condicionados de células PANC-1 induzida a formação do tubo de HUVEC, enquanto meio condicionado de PANC-1 tratados por α-Solanine formação de tubo HUVEC do suprimida de uma forma dependente da dose (fig. 3A, 3B). VEGF, como um factor angiogénico, promove a angiogénese. Os nossos resultados também mostraram que α-Solanina (3, 6 e 9 mg /mL) reduziu marcadamente a expressão de ARNm e proteína de VEGF em células PANC-1 de um modo dependente da dose (Fig. 3C, 3D e 3E). Os dados revelaram que α-Solanina inibe a angiogénese em restringindo a expressão de VEGF.

(A) micrografias representativas (100 ×) do tubo após o tratamento do meio condicionado durante 6 h. HUVEC foram plaqueadas em poços -precoated Matrigel e cultivadas em meio condicionado a partir de células PANC-1 tratadas com durante 24 h. (B) Os comprimentos de tubo foram medidos por Imagem-ProPlus 6.0. (C) A expressão de ARNm de VEGF foi apresentada como média ± S.E.M. de três experiências independentes. (D) A análise por Western blot da expressão do VEGF. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (E) A quantificação dos resultados de Western blot foi realizada através do cálculo da razão entre o valor para o grupo de controlo. * P 0,05, ** p . 0,01, em comparação com o controle

4. α-Solanina Exerce Expressão de metástases associadas Molécula

Expressão de genes associados com a progressão e metástase do cancro foi realizada por PCR quantitativo em tempo real (Figs. 4A). A activação da MMP é um passo essencial para a degradação de ECM, a qual induz a invasão celular. Os resultados mostraram que α-Solanina suprimiu a expressão de ARNm de MMP-2, MMP-9, ENOS, EMMPRIN e CD44 num modo dependente da dose. A expressão da proteína de MMP-2 e MMP-9 também foram suprimidos de uma forma dependente da dose (Fig. 4B, 4D). ensaio de zimografia de gelatina, também mostrou que a MMP-9 e MMP-2 actividades foram marcadamente reduzidos em 6 e 9 mg /mL α-Solanina (Fig. 4E, 4F). Além disso, α-Solanina regulamentada da expressão de E-caderina (Fig. 4C, 4D), o que pode aumentar a adesão entre as células. Assim, α-Solanina poderia inibir a metástase afectando a activação proteolítica e capacidade adesiva.

(A) A expressão de ARNm de MMP-2/9, EMMPRIN, CD44, ENOS foi Ecadherin e apresentados como médias ± S.E.M. de três experiências independentes. (B) A expressão de MMP-2 e a proteína de MMP-9 foram analisados ​​por Western blot. (C) A expressão da proteína Ecadherin foi realizada por Western blot. (D) A quantificação dos resultados de Western blot foram realizadas através do cálculo da razão entre o valor para o grupo de controlo. (e) a actividade de MMP-2 e MMP-9 foram analisados ​​por zimografia em gelatina. (F) A quantificação dos resultados zimografia em gelatina foram realizados através do cálculo da razão entre o valor para o grupo de controlo. * P 0,05, ** p 0,01, comparado com o controlo. GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

5. α-Solanina regulado associados proteínas sinalizadoras

A pesquisa indicou que Wnt /β-catenina, Akt /mTOR e de JAK /STAT vias estão envolvidas na expressão das MMPs e indução de metástases. α-Solanina induzida a expressão da fosforilação de β-catenina e inibiu a fosforilação da STAT3 de uma forma dependente da dose e do tempo (Fig. 5). Os dados também mostraram que α-Solanina reduziu a fosforilação de Akt e mTOR de uma forma dependente da dose e do tempo (Fig. 6). Além disso, α-Solanina regulada para baixo o nível de β-catenina e TCF-1 no núcleo (Fig. 7). Assim, α-Solanina poderia suprimir a invasão de células e de MMP-2/9 expressão, em parte, por inibição de Wnt /β-catenina, Akt /mTOR e de JAK /STAT vias.

células PANC-1 foram tratadas com várias doses de α-solanine durante 24 h, ou 9 ug /ul de α-solanine para 6,12,18,24 h. O nível de fosforilação de β-catenina (A, B), Stat3 (C, D) foram determinados por Western blot. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (E, F, G, H) A quantificação dos resultados de Western blot foram realizados através do cálculo da razão entre o valor para o grupo de controlo. * P 0,05, ** p . 0,01, em comparação com o controlo

células PANC-1 foram tratadas com várias doses de α-solanine durante 24 h, ou 9 ug /ul de α- solanina para 6,12,18,24 h. (A, C) O nível de fosforilação de Akt e mTOR foram determinados por Western blot. GAPDH foi usada como um controlo de carga. (B, D) Quantificação dos resultados de Western blot foram realizados através do cálculo da razão entre o valor para o grupo de controlo. * P 0,05, ** p . 0,01, em comparação com o controlo

células PANC-1 foram tratadas com várias doses de α-solanine durante 24 h. (A, C) O nível de NF-kB /p65, β-catenina e TCF-1 no núcleo foram determinados por Western blot. Laminb1 foi utilizado como um controlo de carga proteína nuclear. (B, D) Quantificação dos resultados densitométricos foram realizados através do cálculo da razão entre o valor para o grupo de controlo. * P 0,05, ** p . 0,01, em comparação com o controle

6. α-Solanine Diminuiu a expressão de NF-kB /p65 no Núcleo de PANC-1 Células

O nível nuclear relativa de NF-kB /p65 em células PANC-1 foi determinada utilizando o ensaio de Western blot. Nós descobrimos que o tratamento com α-Solanina decreasd significativamente a expressão de NF-kB /p65 em células PANC-1 (Figs. 7A, 7B). A activação constitutiva de NF-kB pode promover a proliferação de células, inibem a apoptose das células, e regular a expressão de genes associados com a angiogénese. Assim α-Solanina poderia melhorar a inibição do crescimento e proliferação celular e promovem a apoptose de células de cancro pancreático, inibindo a expressão de NF-kB.

7. a-solanina Suprime no crescimento in vivo de cancro do pâncreas celular PANC-1 xenoenxertos de tumores

A administração de solanina para ratos pelados inibiu o crescimento de xenotransplante de PANC-1 tumor (Fig. 8). No final de 14 dias do estudo em PANC-1 xenotransplante, solanina diminuiu tumor de volume /mouse de 701.97 ± 157,86 milímetros

3 no grupo controle para 273.54 ± 57,27 milímetros

3, correspondente a um 61% (P 0,05) a redução no volume do tumor. Da mesma forma, o peso do tumor no grupo tratado solanine também diminuiu de 250 ± 37,42 mg no grupo de controlo para 143,33 ± 26,29 mg, correspondendo a um 43% (p 0,05) redução no peso do tumor. Observou-se que havia uma pequena gota no peso corporal tanto no grupo controle e no grupo solanina tratada. A razão de que não foi ainda claro.

PANC-1 foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus. Quando os tumores eram mensuráveis, os ratinhos receberam DMSO ou α-solanine durante 2 semanas. (A) O volume do tumor /rato como uma função do tempo. (B) O rato de cada grupo foi monitorizada para o peso corporal, uma vez por dia. foram analisados ​​A média de peso corporal /rato como uma função do tempo. (C) O volume do tumor /ratinho e (D) o peso do tumor /ratinho no final do estudo. * P . 0,05, em comparação com o controle

8. α-Solanine Suprime Metástase, proliferação celular e angiogênese em xenoenxertos modelo

MMP-2 e MMP-9 desempenham papéis fundamentais no processo de metástase entre as MMPs. Examinámos xenoenxerto de tumor de pâncreas por Western blot e encontrou-α Solanina pode diminuir significativamente a expressão de MMP-2 e MMP-9 (Figs. 9A, 9B). A proliferação e a angiogénese são os dois biomarcadores extensivamente utilizados, que foram empregues para medir a agressividade de tumores sólidos. Assim, os tumores foram analisadas para anti-proliferação e anti-angiogênese de α-Solanine por PCNA e coloração VEGF através de métodos imuno-histoquímica. A coloração PCNA e coloração VEGF de tumores mostraram fraca imunorreactividade no grupo solanina tratados em relação ao grupo (Fig. 9B, 9C) controlar. A quantificação mostrou 78 ± 4% de células PCNA positivas no grupo de controlo, versus 29 ± 3% no grupo tratado solanine responsável por 63% de diminuição (p 0,01), e a DOI média de coloração de VEGF realizadas decréscimo de 70% (p 0,01) no grupo solanina tratado em comparação com o grupo controle. Este estudo confirmou no mecanismo antitumor in vivo de eficácia solanina contra o crescimento do tumor PANC-1.

Quando xenotransplantes tumorais foram separadas, foram utilizadas peças de tumor de Western blot e imunohistoquímica. (A) As expressões de MMP-2 e MMP-9 de proteína foram analyzede por Western blot. (B, C) Tissus de tumor foram analisados ​​por innunohistochemically células PCNA positivas e densidade de coloração de VEGF. fotografias representativas de IHC coloração de PCNA e VEGF são mostrados em 400 × ampliações. Barra de escala: 50 ^ m. Os dados são apresentados como a média ± SE. * P 0,05, ** p . 0,01, em comparação com o controle

Discussão

α-Solanine é uma espécie de alcalóides esteróides que produzidos pelas plantas da família sloanaceae . A alta concentração de α-Solanina pode gerar efeitos citotóxicos que induzem danos rápida da membrana plasmática fazendo com que o distúrbio letal de metabolismo [26]. Vários estudos mostram que α-Solanina inibe o desenvolvimento pré-implantação do embrião [27], [28], as células hepáticas humanas normais [22]. Além disso, α-Solanina foi mostrado para reduzir citoquinas e produções de óxido nítrico em células Jurkat de Con A-induzida e estimulada por LPS de macrófagos RAW [24], inibir o Factor de Necrose Tumoral-α (TNF-α) e interleucina (IL) -6 no rato macrófagos peritoneais devido à supressão de p38, JNK e ERK1 /2 [29]. Estudos recentes têm demonstrado que α-Solanina executa eficácia anti-tumor, tais como restringindo a proliferação de linhas celulares de cancro e de induzir a apoptose e diminuição da mutação de p53 de linhas celulares de cancro gástrico [22], [23], [30]. No presente estudo, utilizou-se a concentração não tóxica de α-Solanina (3, 6 e 9 mg /mL) e descobriram que α-Solanina inibe a metástase in vitro, tais como invasão, migração e a angiogénese, o que indica que o efeito inibitório de α-Solanine em metástase não foi pela sua função citotóxica. O primeiro avaliou a eficácia da α-Solanina in vivo e encontraram-α Solanina pode inibir a proliferação, a angiogénese e metástase em xenoenxerto de tumor em ratinhos nus atímicos.

Metástase

O cancro é um processo multifacetado que as células cancerosas geneticamente instáveis ​​desenvolver adaptação e ecesis a um microambiente tecido que é a distância do tumor primário [31], que envolve a perda de adesão celular, o aumento da migração e invasão, a circulação através dos sistemas vasculares /linfáticos e germinação de tumores coloniais em locais distantes [32], [33] . Degradação da ECM e BM de enzimas proteolíticas e invasão abrigo são indispensáveis ​​para a metástase [34]. As MMPs são importantes as enzimas proteolíticas que degradam a ECM e a BM. Entre eles, a MMP-2 e MMP-9 são altamente expressos no cancro pancreático [35]. A inibição da metástase de células do cancro do pâncreas mediada por regulação negativa da expressão de MMP-2 e MMP-9 [36], [37]. EMMPRIN, estimulando fibroblastos peritumorais para produzir MMPs, realizada com uma alta expressão particular na célula de câncer pancreático [38]. invasão de células do câncer de pâncreas e metástase poderiam ser suprimidos através da terapia-EMMPRIN anti [39]. CD44, uma glicoproteína transmembrana com domínios de ligação para o ácido hialurônico, que é componente crucial da ECM, é altamente expressa em câncer pancreático [40].