Abstract

Neste estudo nós investigamos a correlação entre a expressão RhoC e células-tronco cancerosas (CSCs ) formação em cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP). A inibição da função RhoC foi conseguida utilizando shRNA. A expressão dos marcadores de superfície de células estaminais, de ALDH e CD44 foram significativamente baixo em duas linhas de células de carcinoma de células esgotadas CECP RhoC. Além disso, uma redução marcante na formação tumorsphere foi conseguida em linhas knockdown RhoC. A expressão de ARNm de RhoC em RhoC knockdown aderente e tumorspheres são dramaticamente regulada negativamente, em comparação com o controlo scrambled. A expressão de mRNA de factores de transcrição de células estaminais; NANOG, OCT3 /4 (Pouf1) e sox2 foram significativamente empobrecido em clones knockdown RhoC. Além disso, a fosforilação de STAT3

ser727 e STAT3

tyr705 foram significativamente para baixo regulamentada em clones RhoC knockdown. A superexpressão de STAT3 em RhoC knockdown não mostraram qualquer mudança nos padrões de um ou-STAT3 expressão

tyr705 ou tronco fatores de transcrição celular, significando o papel de RhoC na ativação STAT3 e, assim, a expressão de NANOG, OCT3 /4 e sox2 em HNSCC. A expressão de inter leucina-6 (IL-6) em linhas de células de carcinoma epidermóide knockdown RhoC foi dramaticamente reduzida em relação ao controlo scrambled. Além disso, temos mostrado um resgate em STAT3 fosforilação por estimulação de IL-6 em linhas knockdown RhoC. Este estudo é o primeiro de seu tipo para estabelecer o envolvimento de RhoC na fosforilação STAT3 e, consequentemente, na promoção da ativação de células-tronco do câncer de núcleo (CSCs) fatores de transcrição. Estes achados sugerem que RhoC pode ser um novo alvo para terapia HNSCC

Citação:. Islam M, Sharma S, Teknos TN (2014) células-tronco cancerosas RhoC regulamenta de Cabeça e Pescoço carcinoma espinocelular por superexpressão de IL-6 e fosforilação da STAT3. PLoS ONE 9 (2): e88527. doi: 10.1371 /journal.pone.0088527

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Outubro, 2013; Aceito: 07 de janeiro de 2014; Publicação: 12 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Islam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela The Ohio State University Comprehensive Cancer Center e da Fundação Família Slomin (Florida, EUA) para Ted Teknos. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) está entre os dez principais cancros fatais em todo o mundo [1], [2]. Além disso, conforme relatado pela American Cancer Society, cerca de 41.380 novos casos serão diagnosticados no ano de 2013, dos quais cerca de 19% dos pacientes são propensos a morrer devido à doença no mesmo ano [3]. Os sobreviventes enfrentam manifestações secundários da doença, resultando em um tratamento prolongado e extensa. Isto é exacerbado pelo facto de a doença apresenta uma frequência elevada de re-ocorrência. Como resultado, pacientes com CECP enfrentar uma longa batalha contra a doença causando grande fardo econômico e emocional [4]. Consequentemente, um relatório por Brown

et al

(2002) cita HNSCC entre os oito tipos de câncer mais caras do programa Medicare [5].

O invulgarmente elevada morbidade e mortalidade deve-se ao natureza maligna de CECP e sua ocorrência generalizada na maioria dos cânceres de cabeça e pescoço. Portanto, não é raro encontrar metástases para os nódulos linfáticos do pescoço da região que conduz à falha loco-regional (mais frequente) seguido de metástase pulmonar e osso [6], [7]. Como resultado, os pacientes com CECP mostrar prognóstico pobre e uma taxa de sobrevivência de cinco anos de apenas 50-60% [3]. Assim, há uma grande necessidade de compreender os mecanismos genéticos que regulam a malignidade do CECP e usá-los para projetar melhores estratégias de tratamento que podem impedir a metástase e re-ocorrência.

RhoC é um membro da família Rho bem caracterizados de GTPases que estão envolvidas numa ampla variedade de actividades celulares incluindo a sinalização intracelular, organização do citoesqueleto, a proliferação celular e a regulação da expressão do gene [8]. Curiosamente, os genes Rho pertencem aos superfamília Ras, muitas das quais foram identificadas como oncogenes [9], [10]. Embora muito poucas mutações genéticas são observadas no gene RhoC, é relatado a ser sobre-expressa em muitas formas de carcinomas invasivos incluindo HNSCC [11], [12]. Especificamente, os estudos em todos os tipos de cancros, onde foi analisada a expressão RhoC revelou uma correlação muito forte entre a expressão muito aumentada e metástase. Além disso, quando a função RhoC é inibida

In vitro

, que resulta em uma forte redução da invasão celular e motilidade [13]. Curiosamente,

in vivo

estudos de tumorigênese em camundongos knockout RhoC mostrar tumores com uma capacidade muito reduzida de metástase para os pulmões [10]. No seu conjunto, estes estudos sugerem fortemente RhoC é um pró-oncogene metástase que desempenha um papel importante na transformação de células de tumores não invasivos para um fenótipo invasivo.

O estudo da função RhoC centra-se principalmente sobre o seu papel na reorganização do o citoesqueleto por indução da formação de fibras de stress e de adesão focal, que são passos críticos em relação a células alteradas em formas com motilidade e invasivos [14]. No entanto, o processo de metástases por células cancerosas é um processo complexo de múltiplos passos e que é acompanhado com o aumento da expressão de genes que aumentam a motilidade e invasividade e uma diminuição da regulação de genes selectiva que inibem este processo. A prevalência de RhoC em uma ampla gama de carcinomas invasivos e à sua função como uma GTPase de sinalização sugere que pode regular a outras vias que são envolvidas na transformação de células de tumor em um fenótipo metastático.

cancro de células estaminais (CCC) são uma subpopulação de células tumorais indiferenciadas dentro de uma massa de tumor, que são capazes de auto-renovação. Eles também exibem forte resistência à terapia quimio-radiação. Além disso, os CSCs pode persistir em tumores como uma sub-população discreta que pode recaída e metastizar através da formação de novos tumores [15], [16]. Estas propriedades únicas desempenhar um papel significativo na sobrevivência de células de cancro que conduz à recidiva. Importante, eles também podem ser uma fonte de células com um fenótipo invasivo, desempenhando assim um papel chave em metástase.

Um número considerável de estudos foram realizados na presença e o papel das CSCs no cancro da cabeça e pescoço, que foi revisto de forma abrangente por Minnelli e Gallo (2012) [17]. Um estudo de tumores primários no carcinoma da cabeça e do pescoço, utilizando a CD44 marcadores e de ALDH identificado um subconjunto de células tumorais que CSCs únicas propriedades, incluindo a auto-renovação, a capacidade para formar novos tumores em ratinhos e exibiu elevado potencial metastático (príncipe

et ai

de 2007, Davis

et al

de 2010, Clay

et al

2010) [16], [18], [19]. Interessantemente, as células de tumor positivas ALDH exibiu potencial tumorigénico mais quando comparado com as células positivas de CD44 [19]. Além disso, Chen

et al

(2010) [20] relatou tumores primários com uma maior expressão de CD44 e ALDH, que atribui bem com o mau prognóstico em pacientes com CECP. Com base nestes estudos, pode concluir-se que os CSCs pode desempenhar um papel significativo nas metástases de carcinoma epidermóide; sugerindo, assim, uma necessidade de compreender os mecanismos moleculares que regulam a eles.

CSCs foram também identificados e caracterizados em linhas de células de carcinoma epidermóide, onde eles têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na transição epitelial-mesenquimal (EMT) [ ,,,0],21]. Em nosso estudo, analisamos o efeito da inibição RhoC sobre as características funcionais de células cancerosas que exibem características CSC-como em linhas de células de carcinoma epidermóide. Mostra-se que a inibição da actividade RhoC em linhas de células de carcinoma epidermóide resulta numa redução significativa na população de células que expressam CD44 e de ALDH, marcadores de CSCs em tumores da cabeça e pescoço.

Além disso, também caracterizou o mecanismo molecular pelo qual RhoC regula o crescimento e auto-renovação das CSCs. Nossos resultados mostram que RhoC pode reduzir significativamente os níveis de fatores de transcrição de células-tronco do núcleo, NANOG, Sox2 e OCT3 /4 expressão. Mostramos ainda que isto é conseguido através da redução dos níveis de STAT3 fosforilado através da via de sinalização de IL-6 /JAK. Este estudo é o primeiro de seu tipo que tenta dissecar o papel da via de sinalização RhoC GTPase na regulação e ativação de fatores de transcrição em células estaminais. (Esses fatores promover e manter as células tumorais com propriedades semelhantes a células-tronco no câncer de cabeça e pescoço).

Portanto, com base em nossos resultados, concluímos que RhoC é um oncogene importante que é necessário para a manutenção e propagação da CSCs em CECP.

Materiais e Métodos

cultura celular

Cabeça e pescoço células escamosas linhas celulares de carcinoma UM-SCC-1 e -47 (Cell carcinoma espinocelular Universidade de Michigan ) foram adquiridos pela Universidade de Michigan. Estes são bem caracterizadas linhas derivadas de pacientes com T2N0 de chão da boca e T3N1 de base da língua, respectivamente [22], [23]. As linhas celulares foram cultivadas como descrito anteriormente [13].

transdução Lentivírus, infecção e seleção de clones RhoC knockdown positivos

A fim de obter clones RhoC knockdown estáveis ​​a partir das linhas celulares acima mencionadas que usamos RhoC construções de controle sequência knockdown e mexidos com GFP marcados e locais de resistência puromicina como descrito em nosso trabalho publicado anteriormente [13]. Seleção de clones RhoC knockdown estáveis ​​foi realizada com 2,0 e 1,6 mg /ml de puromicina para o UM-SCC-1 e -47, respectivamente. Estes clones foram ainda classificadas por citometria de fluxo para obter o número máximo de células positivas para GFP, que também foram utilizadas em estudos posteriores.

transfecção transiente de RhoC siRNA

Como os espectros de emissão de GFP marcado com RhoC shRNA era o mesmo que o espectro de emissão de fluorescência o anticorpo usado para identificar ALDH células positivas, as /GFP knockdown clones RhoC-shRNA transfectadas gerados a partir de UM-SCC-1 linhas celulares e -47 não poderia ser utilizado para identificar e ordenar a sub-população CSC. Em vez disso, knockdown de RhoC foi conseguida de forma transiente em ambos UM-SCC-1 e -47 usando RhoC-siARN (Ambion tecnologias /Life, EUA) e lipofactAMIN 2000 como o transportador. A transfecção bem sucedida e a inibição da RhoC foi demonstrada pela falta da sua expressão com a análise Western blot utilizando anticorpo anti RhoC.

reacções reversíveis quantitativas de cadeia de polimerase transcriptase (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado por o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). reações em cadeia quantitativos transcriptase reversa da polimerase (qRT-PCR) foram realizadas pelo sistema de sonda Taqman da Applied Bio Sistemas (Foster City, CA) usando o seguinte produtos RhoC: Hs00733980_m1, Sox2: Hs01053049_s1, Nanog: Hs02387400_g1 e OCT3 /4 (POUF1 ) Hs01895061_u1. OZ1 G3PDH e foram utilizados como os normalizadores de dados. mudanças relativas de expressão dos genes foram calculados utilizando a 2

– (- Δ). C

método de T [24]

análise de Western blot

análises de Western blot foram realizados de acordo com a o protocolo padrão. Os anticorpos primários usados ​​foram anticorpos policlonais RhoC, e p-STAT3

727 Ser, p-STAT3

tyr705 (1:1000 diluições) e αβ tubulina (como um controlo de carga) (1:2000 diluições). Estes anticorpos foram o produto de Cell Signaling (Cell Signaling Technologies, Inc., Boston, EUA). Após incubação com anticorpos primários as membranas foram transferidas durante uma hora com o anticorpo secundário conjugado com HRP anti-coelho (1:2500) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, EUA). ECL-super sistema de sinal (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) foi utilizado para visualização de proteínas.

Determinação da RhoC ativa ou [RhoC-GTP]

[RhoC- GTP] na UM SCC-1 e -47 mexidos controlo e RhoC knockdown clones foram determinados por G-lisa como descrito anteriormente [25], utilizando o kit de L-LISA (Cytoskeleton Inc., Denver, CO, EUA) e seguindo o protocolo do fabricante, utilizando RhoC anticorpo primário de Sinalização celular Inc.

imunoenzimático (ELISA)

sobrenadantes livres de soro de controle mexidos e linhas de células knockdown RhoC obtido após 48 horas de incubação foram enviados para ELISA para o core University Laboratório de citocinas de Maryland, Baltimore, MD. Os valores médios de IL-6 (após normalização com o número de células a partir de onde foram recolhidos os sobrenadantes) em termos de pg /ml foram representados num gráfico de barras.

análises de citometria de fluxo

Fluxo citometria de análise para classificação GFP, as células ALDH e CD44 positivos foi realizada utilizando fluxo BD FACS Aria IIU citômetro equipado com um 488 nm, 15 mW, Argon a laser refrigerado a ar. Um kit ALDEFLOUR (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) foi utilizado para a coloração ALDH. A análise FACS foi realizada nas instalações do núcleo laboratório fluxo no The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Tumorspheres formação

Para tumorsphere ensaios de formação de nós resolvido as células GFP positivas e usou-os para todos os experimentos subsequentes . Tumorspheres do controlo mexidos e linhas de knockdown RhoC foram obtidos pelo desenvolvimento de um número igual de células (1 x 10

6) em pratos de fixação ultra baixa no soro de queratinócitos suplemento de meios isentos com EGF 20 ng /ml, bFGF 20 ng /mL , insulina de 100 ng /ml, hidrocortisona e 400 ng /ml. Para as esferas de propagação para a próxima geração, as esferas foram filtradas em um filtro celular de 40 uM e tripsinizadas brevemente num banho de água a 37 ° C. Após centrifugação a 300 x g paletes de células foram re-suspensas em meios tumorsphere e plaqueadas em placas frescas de fixação de baixo. Para determinar a eficiência de formação tumorsphere, 500 células de controlo e mexidos RhoC knockdown foram plaqueadas em placas de 96 poços de baixo de fixação. Os números de esferas foram contadas após duas semanas de semeadura. As placas ultra-baixas de fixação foram o produto de Corning Incorporated, Corning, NY, EUA.

Análise Estatística

A análise estatística (teste t de Student) foram realizadas utilizando gráfico Sigma pad prisma 4 software . A média foi relatado com o desvio padrão (± DP). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando

p

valores foram inferiores a 0,05.

Resultados

expressão RhoC é significativamente reduzido em linhas de células de carcinoma epidermóide knockdown RhoC

a inibição da expressão RhoC foi levada a cabo usando RNA pequeno hairpin (shRNA) e a transdução e infecção metodologia de lentivírus, como descrito na secção de métodos. Após infecção por lentivírus, os clones foram seleccionados RhoC knockdown utilizando puromicina (1,6 ug /mL) do antibiótico. O número de células que foram infectadas com sucesso foi analisada por citometria de fluxo. Isto revelou uma notavelmente baixo número de células não-infectadas (Fig. 1A-C do painel de topo). Além disso, a microscopia de fluorescência dos clones estáveis ​​mostra uma forte fluorescência verde na maioria das células, o que significa uma elevada eficiência de transdução e lentivírus infecção (painel de baixo Fig. 1A-C). Estas células GFP positivas foram ainda classificados e re-cultivadas para experimentos posteriores. A Figura 1C é o controlo negativo que mostra a linha parental, sem a infecção por lentivírus. Isso representa a diferença entre expressando GFP (infectados) e células que expressam não-GFP.

células infectadas Lentivírus mostrando a expressão GFP em UM-SCC-47. (A) Os histogramas do controlo scrambled (controlo SR) e (B) RhoC knockdown (KD RhoC) obtido por citometria de fluxo. (C) Controlo negativo. Representação da expressão da GFP em fluorescência e luz brilhante são mostrados nos painéis de fundo. Cerca de 90% das células eram positivas GFP significando a transdução de sucesso de shRNA usando lentivírus recombinante.

, em seguida, testada a eficácia de shRNA em empobrecimento RhoC expressão de ARNm por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em nossas linhas de células selecionadas. Como mostrado na Figura 2, os níveis do gene RhoC nos clones de knockdown de expressão de ARNm foram significativamente baixo (Fig 2A . D), enquanto que a expressão da proteína não era detectável no Western blot (Fig 2B . E). Em contraste, a expressão RhoC suficiente foi observada em clones com a sequência de controle shRNA-mexidos. A expressão relativa de ARNm RhoC no controlo shRNA-mexidos e os clones RhoC knockdown foi avaliada por RT-PCR quantitativo e o C

T valores obtidos foram normalizados utilizando dois genes de manutenção, tal como descrito na secção de materiais e métodos. Uma redução de cerca de 80% da expressão de ARNm foi observada em RhoC UM-SCC-1 e- 47 clones de knockdown, em comparação com o controlo scrambled (Fig 2A . D). Em nosso estudo anterior, confirmou que apenas a expressão do mRNA RhoC foi inibida quando usamos construções RhoC shRNA feitas com sequências específicas de mRNA RhoC; Além disso, os níveis de expressão de outras proteínas Rho não foram afectados nas linhas celulares de UM-SCC [13]. Assim, foi utilizada a mesma RhoC shRNA constrói para o nosso estudo atual

(A e D) A expressão do mRNA de RhoC obtido por tempo real RT-PCR.; (B e E). A análise Western blot mostrando a expressão RhoC no controlo mexidos e clones RhoC knockdown (C e F). gráfico de barras mostrando a expressão de RhoC ativa [RhoC-GTP] no controle mexidos e RhoC knockdown UM-SCC-1 e-47, respectivamente. Uma diminuição significativa no RhoC mRNA, proteínas e [RhoC-GTP] níveis foram obtidos nas linhas de células knockdown RhoC.

Em seguida, analisamos a expressão da proteína RhoC utilizando Western blot e observou uma diminuição dramática de a proteína RhoC em clones de knockdown RhoC (Fig 2B . e). Além disso, a expressão de RhoC activa [RhoC-GTP] foi determinada por G-lisa e uma forma semelhante a baixa expressão de RhoC activo foi detectado nos clones RhoC knockdown da UM-SCC-1 e-47 (Fig 2C . F). Estes estudos forneceram uma visão clara sobre a “desligar” da atividade de sinalização RhoC, diminuindo os níveis totais de expressão de mRNA RhoC. Mais estudos detalhados sobre seus papéis funcionais em metástase de câncer poderia ser perseguido em pesquisas futuras. Uma das questões clínicas mais básicas que nós abordados neste ponto é como a função derrubando de RhoC afeta as células tumorais com propriedades semelhantes a células-tronco no câncer de cabeça e pescoço. Para resolver esta questão, investigamos várias características biológicas dos CSCs que incluem análise de biomarcador celular e a capacidade de formar tumorspheres-tronco. Em seguida, examinamos as moléculas de sinalização que mantêm as propriedades auto-renovação das CSCs.

A inibição da expressão RhoC leva a reduzida população de células ALDH e CD44 positivas em linhas de células de carcinoma epidermóide

A fim de identificar a população CSC em linhas celulares de UM-SCC, utilizou-se o CD44 e os marcadores de células estaminais da ALDH em conjunto com células de fluorescência activador (FACS) para separar e contar o número de células que expressam eles. Além disso, é importante notar que os clones RhoC-siRNA de UM-SCC-1 e -47 foram usadas para análise por FACS para determinar as populações de células positivas para ALDH em vez de lentivírus infectados clones GFP-RhoC-shRNA. Este foi para evitar a sobreposição de GFP fluorescência ao longo do anticorpo ALDH fluorescente marcado, desde a sua sobreposição espectros de emissão.

Nós comparamos o número de células positivas ALDH no controle mexidos e correspondentes linhas knockdown RhoC. Nas linhas de células de controlo, observou-se células positivas de 18% e 10% da ALDH na população total de UM-SCC-1 e de UM-SCC-47, respectivamente. Em contraste, as células positivas apenas 13% (UM-SCC-1) e 4% (UM-SCC-47) ALDH foram detectados nas correspondentes linhas de knockdown RhoC (Fig. 3a). Um padrão similar foi observado com CD44, mas a percentagem de células positivas para CD44 era muito alta. Curiosamente, os clones com a sequência de controle mexidos da UM-SCC-1 e -47 mostrou cerca de 98 células positivas CD44%. Nos correspondentes clones de knockdown RhoC, houve 60% e 41% de células positivas CD44, respectivamente (figura S1). É importante notar que este foi um número anormalmente elevado de células positivas para CD44 em ambas as linhas de UM-SCC-1 e-47 de células ( 95%) e, portanto, CD44 não poderia ser utilizado como um marcador de células estaminais para estas linhas celulares. Além disso, os nossos resultados são semelhantes aos relatados estudos anteriores que CD44 encontrado para ser expresso abundantemente em células tumorais de carcinoma epidermóide [26].

análise de FACS mostrando a expressão de (A) ALDH no controlo mexidos e o RhoC clones knockdown. (B) A formação tumorspheres no controle mexidos eo knockdown RhoC linhas -47cell UM-SCC-1 e. (C) A representação da eficiência de formação tumorspheres no controle mexidos e RhoC knockdown de UM-SCC-1 obtido em placas de 96 poços. Uma diminuição significativa na expressão ALDH foi visto. formação Tumorsphere foi dramaticamente baixa em RhoC knockdown UM-SCC-1 e -47, respectivamente. (D) Uma diminuição significativa na expressão de ARNm RhoC foi obtido na célula aderente RhoC knockdown e nas tumorspheres. (E) Stem fatores de transcrição celular, Sox2, OCT3 /4 e NANOG mostrando regulamentação significativa para baixo em seu mRNA como revelado pelo tempo real RT-PCR no controle mexidos e as esferas knockdown RhoC obtidos a partir UM-SCC-1.

linhas CECP RhoC knockdown são muito reduzidas na sua capacidade para formar tumorspheres

As células tumorais com propriedades semelhantes a células-tronco são capazes de formar esferas flutuantes, quando cultivada sob meios de comunicação livres não soro aderente. Portanto, para estabelecer ainda mais o papel da RhoC no crescimento e manutenção CSC, investigaram-se as capacidades de formação tumorsphere nestas linhas celulares. Em primeiro lugar, um número igual de células (1 x 10

6) a partir do controlo mexidos e linhas celulares de knockdown RhoC foram semeadas em placas ultra-baixas de fixação para observação. Foram selecionados cinco campos diferentes de visualizar o número de tumorspheres que haviam formado. No controlo scrambled, houve um número elevado de tumorspheres com um menor número de agregados de células. Em contraste, uma diminuição clara tumorsphere formação foi detectada em clones de knockdown RhoC gerados a partir de ambas as linhas celulares de UM-SCC-1 e-47. Além disso, deve notar-se que os limites bem, uma característica da tumorspheres definidos, estão presentes apenas os derivados a partir das células de controlo, mas são mexidos evidentemente ausente quando derivadas das células RhoC knockdown (Fig. 3B). Em vez disso, o que é visto são agrupamentos de células pequenas ou agregados que são desprovidas de qualquer limite exterior bem definida. Além disso, estes grupos de células não propagar ou formar esferas depois que eles foram tripsinizadas e re-banhado. Em contraste, esferas foram facilmente gerados a partir das linhas celulares de controlo (sequência mexidos) mesmo depois de re-plaqueamento até à quinta geração. Foram também analisadas tumorsphere eficiência de formação de uma placa de 96 poços utilizando 500 células por poço e a placa observada por esferas após duas semanas de tempo. Observou-se uma diminuição notável do número de esferas (85%) para as células RhoC knockdown em comparação com as células de controlo (Fig. 3C). Semelhante ao ensaio de tumorsphere anterior, os agregados celulares foram observados a partir de células derivadas das linhas celulares de knockdown RhoC que eram bastante diferentes das esferas bem definidas derivadas dos clones de controlo. Foi obtido um padrão semelhante de eficácia tumorsphere formação quando o UM-SCC-47 codificado de controlo e as suas correspondentes linhas de knockdown RhoC foram testadas (dados não mostrados). Estes dados sugerem que RhoC é importante para o crescimento e manutenção das células cancerosas com características semelhantes a células-tronco no câncer de cabeça e pescoço.

Análise de RhoC e células-tronco fatores de transcrição expressão em aderente e tumorspheres em HNSCC

expressão diferencial de mRNA RhoC em células aderentes e tumorspheres

: em seguida, analisamos a expressão de mRNA RhoC nas tumorspheres gerados a partir da linha de células UM-SCC-1 e comparou-o com o seu células aderentes correspondente utilizando em tempo real RT-PCR. Deve notar-se que as células aderentes usadas para as experiências referem-se a células em monocamada knockdown RhoC controlo codificado ou que são cultivadas em substrato de cultura de células padrão. O nosso resultado mostra que há uma expressão elevada de ARNm RhoC no UM-SCC-1 mexidos controlo quando comparado com os homólogos de knockdown RhoC (Fig. 3D). Curiosamente, a expressão RhoC é muito maior nas tumorspheres controlo mexidos quando comparados com os seus homólogos de células aderentes. Isto pode ser devido à presença de uma concentração mais elevada de RhoC em tumorspheres onde os números mais elevados de CSCs são localizadas, em comparação com a população de células aderentes de controlo, que exibem uma mistura de células estaminais com ambos e de células não-haste como características. Isto apoia ainda mais a nossa hipótese de que RhoC é necessário para a manutenção de características como CSC. Nossos resultados estão de acordo com um estudo semelhante sobre a expressão RhoC em linhas celulares de cancro da mama, onde as células positivas ALDH exibiu uma expressão RhoC maior em comparação com células não-ALDH expressando [27].

Stem fatores de transcrição celular estão para baixo regulamentada em RhoC tumorspheres knockdown.

o crescimento e auto-renovação das células-tronco, incluindo propagação dependem expressão adequada da transcrição de células-tronco do núcleo fatores NANOG, OCT3 /4 e sox2. Portanto, foram analisados ​​os níveis destes factores de transcrições de células estaminais no knockdown RhoC expressão e mexidos tumorspheres de controlo gerados a partir da linha celular de UM-SCC-1 por em tempo real de RT-PCR. Interessantemente, os níveis de todos os três factores de transcrição núcleo de expressão foram dramaticamente reduzidos nas células knockdown RhoC quando comparados com os de controlo tumorspheres mexidos (Fig. 3E). Sox2 foi mais fortemente expressa nas tumorspheres controle mexidos, enquanto NANOG e OCT3 /4 foram menos fortemente expressa, mas teve níveis de expressão semelhantes. No entanto, no homólogos RhoC knockdown, sox2 e nanog mostraram os níveis maior reduzida seguida por OCT3 /4. Além disso, também olhou para seus níveis de expressão nas linhas aderentes células CECP (mexidos controle e knockdown RhoC) a partir do qual os tumorspheres foram derivados. No UM-SCC-1 mexidos de controlo e linhas celulares RhoC knockdown, os três factores de transcrição apresentaram níveis semelhantes de expressão como observado nos tumorspheres que foram derivadas a partir delas (Fig. 4a). No UM-SCC-47 mexidos controle, OCT3 /4 teve a mais alta expressão seguida por sox2 e NANOG. Semelhante à linha de knockdown de UM-SCC-1 RhoC, nanog mostrou a maior redução quando a expressão RhoC foi inibida seguido por Sox2 (Fig. 4B). Em ambas as linhas de UM-SCC-1 e -47 RhoC knockdown, OCT3 /4 apresentou a menor quantidade de expressão reduzida. Em conjunto, os nossos resultados demonstram que RhoC medeia a propagação e auto-renovação das CSCs através da regulação do nível dos factores de transcrição do núcleo de células estaminais expressão

em tempo real de RT-PCR que mostra a expressão de ARNm de sox2, OCT3 /4. e nanog em células aderentes de UM-SCC-1 (a) e-UM-SCC-47 (B). Uma diminuição significativa na expressão de mRNA foi observada em fatores de transcrição de células-tronco nas linhas de células de carcinoma epidermóide knockdown RhoC.

A inibição da expressão RhoC induz baixo regulação da via de sinalização STAT3

Em seguida, que investigaram o possível mecanismo através do qual RhoC regula a expressão dos factores de transcrição de células-tronco do núcleo. A activação de factores de transcrição de células estaminais, nanog, sox2, e OCT3 /4 mediadas através de transdutores de sinal e activadores de Transcription3 (STAT3) via de sinalização está bem estabelecida [28], [29]. No entanto, o envolvimento de RhoC na activação destes factores de transcrição não é conhecido. Por isso, analisou-se a expressão da STAT3 total e fosforilada (p-STAT3), no controlo de ovos mexidos e RhoC knockdown linhas de células de carcinoma epidermóide. Surpreendentemente, observou-se que enquanto que os níveis totais de STAT3 permaneceu aproximadamente o mesmo no controle mexidos e linhas celulares RhoC knockdown, os níveis de p-STAT3 foi significativamente reduzido apenas nos clones RhoC knockdown. Especificamente, a análise de mancha de Western revelou reduzida fosforilação da proteína STAT3 a Ser-727 e Tir-705 resíduos (Fig. 5A e B). É de interesse notar que é necessária a fosforilação no último resíduo de STAT3 se difunda para dentro do núcleo para se ligar a elementos promotores de genes responsivos a STAT3 [30], [31]. Estes resultados suportam a idéia de que a via de sinalização RhoC é necessária para a ativação da STAT3 em linhas CECP.

(A e B) Análise de Western blot que mostra a fosforilação de STAT3

ser727 e STAT3

tyr705 nos controles mexidos eo RhoC knockdown UM-SCC-1 e -47, respectivamente. valor normalizado no que diz respeito a STAT3 total é dada como os valores numéricos. diminuições notáveis ​​na fosforilação da STAT3 foram vistos na RhoC knock-down UM-SCC-1 e -47, respectivamente, linhas de células. Análise (C) Protein mostra o p-STAT3

tyr705 na ectopicamente superexpresso (OE) mexidos controle eo RhoC knockdown UM-SCC-1. forma fosforilada foi detectada apenas no controle mexidos quando STAT3 foi mais expresso. Uma banda de espessura de STAT3 total pode ser visto no painel inferior, confirmando a transfecção bem sucedida de STAT3 nestes clones. (D) em tempo real de RT-PCR que mostra a expressão de STAT3, sox2, OCT3 /4 e nanog antes e depois da STAT3 sobre-expressão no clone knockdown RhoC. A expressão do mRNA da STAT3 foi drasticamente alta depois que acabou expressão, enquanto nenhuma mudança significativa na expressão foi observada em sox2, OCT3 /4 e NANOG no clone knockdown RhoC.

Para confirmar que a fosforilação de STAT3 ocorre através da via de sinalização RhoC, que ectopicamente STAT3 sobre-expressa numa linha de knockdown RhoC (uM-SCC-1). Os níveis totais de STAT3 no controle mexidos e RhoC knockdown clones quando STAT3 foi sobre-expresso bandas robustos expostas, significando uma transfecção bem sucedida de STAT3. Apreciavelmente, o p-STAT3

tyr705 só pode ser visto claramente na STAT3 sobre-expressando linha celular de controlo scrambled. Mais especificamente, no knockdown RhoC sobre-expressa o clone STAT3, houve uma fosforilação digna de STAT3 a Tyr-705 que poderia ser observado, e era muito semelhante aos níveis de expressão observado nos clones RhoC knockdown originais (Fig. 5C).

Além disso, foram analisados ​​os níveis de expressão de mRNA de NANOG, Sox2 e OCT3 /4 do STAT3 mais expressa RhoC clone knockdown (UM-SCC-1). Como se mostra na figura 5D, um notável aumento de expressão de ARNm de STAT3 foi observado nesta linha de células, mas a expressão do factores de transcrição de células-tronco do núcleo, nanog, sox2, e OCT3 /4 são-inalterada e semelhante à observada no RhoC linhas knockdown.