Abstract

actividades RNase potentes foram encontrados no soro de mamíferos, mas a função fisiológica das RNases nunca foi bem ilustrado, em grande parte devido às advertências em métodos de medição da actividade RNase. Nenhum dos métodos existentes podem distinguir entre RNases com diferentes especificidades alvo. Um estudo sistemático foi realizado recentemente no nosso laboratório para investigar a especificidade do local de RNases soro em substratos de cadeia dupla de RNA, e descobriu que RNases soro clivar RNAs de fita dupla predominantemente no 5′-U /A-3 ‘e 5’ sites de dinucleótido -C /a-3 ‘, de uma maneira muito semelhantes RNase A. com base nesta constatação, um ensaio de FRET foi desenvolvido no presente estudo para medir esta actividade RNase soro específico do local, em amostras humanas, utilizando um substrato de ARN de cadeia dupla . Demonstrou-se que o método tem uma gama dinâmica de 10

-5 mg /ml- 10

-1 mg /ml usando diluição em série da RNase A. Os soros de 303 doentes com cancro foram sujeitas a comparação com 128 controlos saudáveis e verificou-se que as atividades de RNase soro visualizadas com esta sonda de cadeia dupla específico do local foram encontrados para ser significativamente reduzida em doentes com cancro gástrico, cancro do fígado, cancro pancreático, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer de colo do útero, cancro da bexiga, cancro do rim e câncer de pulmão, enquanto que apenas pequenas alterações foram encontrados em pacientes da mama e cancro do cólon. Este é o primeiro relatório usando RNA de cadeia dupla como sonda para quantificar as atividades específicas do local de RNase A em soro. Os resultados ilustraram que a RNase A poderá ser ainda avaliados para determinar se ele pode servir como uma nova classe de biomarcadores para certos tipos de cancro

citação:. Huang W, Zhao M, Wei N, Wang X, Cao H, Q du, et al. (2014) Site-Specific RNase A atividade foi drasticamente reduzido no soro de vários tipos de pacientes com câncer. PLoS ONE 9 (5): e96490. doi: 10.1371 /journal.pone.0096490

editor: Chandravanu Dash, Meharry Medical College, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de novembro de 2013; Aceito: 08 de abril de 2014; Publicado em: 07 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Pequim Natural Science Foundation (5132015), Programa de Pesquisa básica Nacional da China (2011CBA01102), National High-tech R D Programa da China (2012AA022501), o fundo de Guangdong Ciência e Tecnologia Departamento (2011B090400478) e do Departamento de Educação da China (20090001110052 e 200.800.010.019). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

RNase A é um endoribonuclease com funções no metabolismo do RNA e regulação da expressão gênica. Verificou-se que desempenham um papel em doenças tais como doenças auto-imunes, insuficiências renais e pâncreas desordem [1], [2], [3], [4]. Mais recentemente, uma actividade anti-tumoral também foi relatado por uma RNase A com propriedades citotóxicas e citostáticos [5], [6].

Nas últimas décadas, as propriedades bioquímicas de ARNase A foram bem investigada [7]. Como uma família de proteínas evolutivamente conservadas única, os membros da RNase A superfamília são normalmente composta por 124 aminoácidos [8]. Os membros da RNase A superfamília são amplamente expressos e presente no soro e tecidos de mamíferos [9]. Cinco RNases, isto é, uma RNase, RNase 2, RNase 3, 4 e RNase RNase 5, foram identificados no soro humano tão cedo como 1976 [10], [11]. RNase 1 foi encontrado mais tarde para ser o homólogo humano da RNase A e, assim, também é referido como RNase A. humana com RNase A é o componente predominante endorribonuclease em órgãos e tecidos humanos [9]. RNase 2 e 3 RNase comportar-se com uma função semelhante ribonucleolítica [2]. Para além de funcionar em ARNm e ARNr 18S degradação, RNase 4 e 5 ARNase foram também referidos como tendo uma função da angiogénese, ao passo que a RNase 5, em particular, pode promover o crescimento dos vasos sanguíneos [1].

é um Ranpirnase RNase a membro da superfamília identificado em frog (Rana pipiens) oócitos [12]. Como o menor membro da RNase A superfamília, Ranpirnase é um fio único poli-peptídeo composto por 104 aminoácidos [12]. Actualmente, é Ranpirnase num ensaio clínico de fase III-B, em que, Ranpirnase foi testado para o tratamento de pacientes com mesotelioma maligno não operável, cancro do pulmão e leucemia, e foi demonstrado para aumentar o tempo de sobrevivência em pacientes tratados [13], [14]. A descoberta inesperada de actividade anti-cancro de Ranpirnase deu a entender que outras funções novos pode ser ainda mais explorado por membros da RNase A superfamília.

Alguns métodos têm sido testados para a medição dos níveis de RNase soro. Marcada radioactivamente t-RNA e substrato ARNcd foram usadas por Saxena e Ben-Artzi para determinar a actividade de RNase de angiogenina e RNase III [15], [16]. ARN hibridado composta de um 17-mero anti-sentido cadeia de ARN e ARN da linha de células T24 foi utilizado num estudo para caracterizar a actividade ribonucleolítica RNase de cadeia dupla [17]. Num estudo de angiogenina, um método de FRET foi usada por Kelemen

et ai.

Para investigar a eficiência catalítica da RNase. Este método, no entanto, só funciona sob níveis de RNase extremamente baixas [18]. Surpreendentemente, apesar de estes métodos são semelhantes em princípio, os resultados obtidos a partir destes ensaios não foram consistentes. Reddi

et ai.

Utilizado poli-C como o substrato para determinar o nível de RNase através da medição do substrato remanescente após tratamento com RNase [19]. O método foi usado por Funakoshi e outros grupos em 1976 e relações significativas foram obtidas entre os níveis de RNase e doenças do pâncreas, incluindo câncer de pâncreas e pancreatite [20], [21], [22]. Em aproximadamente ao mesmo tempo, Marabella demonstrou um método para realizar ensaio de ARNase, utilizando ARN de levedura como substrato [23]. Mais tarde, um método de iodação foi utilizado para marcar o RNA ribossomal. Usando um substrato marcado radioactivo, o substrato remanescente foi determinada quantitativamente, utilizando um espectrómetro de cintilação auto-gama [24]. Por meio deste protocolo, Kurihara

et al.

Mediram a atividade RNase no soro, e descobriu que os níveis de RNase soro não se correlacionaram com a histologia do câncer, em vez mostrando uma correlação com algum índice fisiológico [25]. Além disso, químicos sintetizados de poli-C, assim como t-RNA extraído a partir de

E. coli

, foram utilizados como substratos em ensaio RNase por Kemmer

et al.

[26]. Mesmo que as medições de nível de RNase soro foram realizadas nesses estudos, capacidade insuficiente para diferenciar RNase indivíduo em uma mistura poderia ter sido o obstáculo técnico que impediu os pesquisadores de alcançar resultados de consenso em diferentes estudos RNase soro.

Em 2003 , Czauderna

et ai. investigaram a estabilidade

soro de siRNA e descobriram que a degradação foi resultou principalmente de clivagem endorribonuclease. Eles também descobriram que, quando alguns locais críticos foram modificados, a estabilidade do soro dos siRNAs foi significativamente melhorada [27]. Mais tarde, Turner e estudos de Haupenthal indicou que a RNase A desempenhou um papel fundamental na degradação de soro de siRNA em mamíferos [28], [29]. padrões de clivagem específicos do local, seguidamente, na C-A-A sítios L, L-L e foram identificados por Volkov [30]. Em um estudo prévio realizado com 125I siRNAs, que ainda ilustrado que a clivagem do ARN de cadeia dupla ocorreu principalmente em dois locais, 5′-C /A-3 ‘(5′-L /G-3’ na cadeia complementar) e 5 sites dos -U /a-3 ‘dinucleótido [31].

no presente estudo, foi elaborado um fluorescente etiquetado duplex dupla RNA que continha local de corte a 5′-C /a-3′ como o específico substrato para RNase soro A. Nós empregamos método de fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET), uma tecnologia óptica altamente sensível, para estudar a dinâmica da reação entre substratos marcados com fluorescência e RNase a, para construir uma curva padrão para correlacionar os níveis de RNase com a quantidade de produtos catalíticos a fim de deduzir a RNase a nível do soro. Utilizando este ensaio, que foram capazes de controlar a RNase A actividade no soro de pacientes com cancro. Comparou-se a RNase A nível de pacientes com 11 tipos de cânceres com a de controles saudáveis, e encontrou o soro RNase A nível em pacientes com câncer cervical, câncer de esôfago, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer de ovário, cancro do fígado e cancro gástrico são significativamente regulada para baixo, quando comparado com a de controlos saudáveis ​​(p 0,001), enquanto que o nível de RNase soro de cancro da mama e doentes com cancro do cólon não foi muito significativamente diferente da dos indivíduos saudáveis ​​

resultados

projeto e Caracterização de uma sonda FRET para Serum RNase Medição

um fato bem conhecido em biologia molecular é que RNAs de cadeia simples são muito instáveis ​​na maioria das circunstâncias, particularmente no presença de ribonucleases. Os processos de degradação rápida torná-lo muito difícil de monitorar o processo de degradação em tempo real. Ainda mais esta situação leva a dificuldades no estabelecimento de medidas quantitativas de actividade RNase.

Diferente de RNAs de cadeia simples, RNAs de cadeia dupla são geralmente muito mais estável. Num recente estudo do perfil da degradação do soro de ARNic em cadeia dupla, observou-se que ambos os longos e curtos ARN de cadeia dupla são degradados predominantemente em dois sítios sensíveis, ou seja, 5′-L /A-3 ‘e 5’-C /A -3 ‘locais dinucleótido [31]. Com base nesta constatação, especulamos que os ARN de cadeia dupla pode ser utilizado como um substrato para medir a actividade de RNase de soro. Para este fim, uma sequência de ARN de cadeia dupla foi concebido para transportar um único /A-3 sítio susceptível 5’-C ‘, a qual foi confirmada no ensaio de degradação (Figura 1A). RNase A é a RNase predominante no soro humano que medeia o processo de degradação de tais ARNcd (Figura 1B). Para facilitar o controlo do processo de degradação desta sonda em tempo real, um sistema de FRET foi desenhado por integrar um FAM fluorescência do dador e um aceitador de fluorescência TAMRA na extremidade 5 ‘de cada componente cadeias de ARN. Contanto que o duplex de ARN mantém intacta, os dois corantes fluorescentes marcados nas extremidades estão próximas o suficiente para mediar a transferência de energia a partir do dador para o aceitador (Figura 2A), que conduz a um pico de emissão a 575 nm quando excitado a 480 nm (Figura 2B ). Quando o duplex é degradada, a transferência de energia de FAM para TAMRA será interrompida, e o pico de emissão vai passar de 575 nm a 515 nm, sob as mesmas condições de excitação (Figura 2B). Portanto, medindo a alteração do pico de emissão a 515 nm pode ser usado para monitorizar o processo de degradação do ARN duplex e reflecte a actividade da ARNase no sistema (Figura 2C).

A) a degradação de um 1860 pb de comprimento duplex de ARN foi realizada em RNase A. fragmentos de degradação foram extraídos e sequenciado. Ao alinhar os fragmentos de degradação com a sequência de RNA original, locais de clivagem foram identificados e apresentados em termos da razão para cada local dinucleótido possível [31]. B) Ensaio de degradação duplex de ARN. ARN duplex duplamente marcada foi incubada separadamente com ARNase A, a mistura de ARNase A e ARNase Um inibidor, soro humano, a mistura de soro humano e de RNase A inibidor. As amostras foram coletadas e executado em um gel PAGE desnaturado.

A) Ilustração esquemática do ensaio RNase base FRET. O RNA duplex (13 pb) foi duplamente marcada com um fluoresceína (FAM) como dador e tetrametilrodamina (TAMRA) como aceitador em cada extremidade. B) espectro de fluorescência normalizada de RNA duplex (13 pb) incubadas com (linha verde) ou sem (linha vermelha) RNase /soro a 25 ° C durante 15 minutos. C) duplex de ARN ensaio de degradação de medição em tempo real. Duplex de ARN foi hibridado e incubadas em tampão de hibridação a 25 ° C. RNase ou soro foi adicionado à hora indicada. A fluorescência do dador (FAM) foi registado em tempo real (pontos a cheio). Amostras em horários diferentes (da esquerda para a direita: 0 s, 10 s, 60 s, 180 s, 480 s) foram recolhidas e executado em um gel PAGE desnaturado (Inset). A fluorescência foi digitalizada na Typhoon mostrando a quantidade restante de comprimento total dsRNA.

Está bem estabelecido que a eficácia de transferência de energia depende principalmente da distância e da orientação relativa do doador e do receptor de fluorescência na sonda [32]. Por um lado, uma sonda curta aumenta a eficiência de transferência de energia em FRET, enquanto, por outro lado, uma sonda mais longa tem uma temperatura de fusão mais elevado e é mais estável. duplexes de ARN de 8 e de 13 pb foram estudados para optimizar o comprimento do substrato. Os resultados mostraram que o substrato 13 pb, com as sequências 5′-AUGAGCCUGAUUU-3 ‘/3′-UACUCGGACUAAA-5’, era óptima para a detecção de FRET. Este duplex de ARN foi então utilizado como o substrato da reacção no estudo.

optimização do sistema de Ensaio

Para medir a actividade de RNase no sistema, quatro microlitros de 5 uM de substrato de RNA duplamente marcada eram adicionaram-se 2 ml de tampão FRET, sob agitação constante. Antes de adicionar ARNase ou de amostras de ensaio, uma curva da linha de base foi registada a 480 nm de excitação de cerca de 30 segundos, utilizando um espectrofluorómetro QuantaMaster 30 (Photon Technology International, Birmingham). Em seguida, amostras de teste ou solução de ARNase foram adicionados ao sistema de reacção, e a fluorescência foi registada a 515 nm com um intervalo de 3 segundos durante 15 minutos. Para análise de dados, a fluorescência de fundo foi subtraído da fluorescência da amostra para se obter uma curva-tempo real, de modo a controlar o processo de degradação em tempo real durante o tratamento (Figura 2C). Um método de regressão não linear (equação exponencial simples) foi usada para ajustar os dados e obter a constante K

obs da reacção de degradação (Figura 3A).

A) A quantificação da degradação no ensaio de FRET. A intensidade fluorescente FAM é convertido como proporção degradação definindo parte inferior e superior de intensidade fluorescente como 0% e 100%. Inferior é a intensidade fluorescente de comprimento completo duplamente marcada ARNcd; topo é a intensidade de fluorescência de FAM marcado de ARN de cadeia única. A Af

max foi definida como 100%. A leitura de fluorescência da amostra foi ajustada à equação exponencial simples (linha vermelha) para obter a taxa constante k

obs. degradação por cento em um determinado momento foi calculada como 100 x Af /Af

máx. B) A degradação do ARNdc duplamente marcada em várias concentrações da RNase A, monitorizada pelo ensaio de FRET (de baixo para cima: 10

-7 mg /ml, 10

-6 mg /ml, 10

– 5 mg /ml, 0,001 mg /ml, 0,003 mg /ml, 0,006 mg /ml, 0,01 mg /ml). C) curva padrão de concentração de RNase A e K

obs. K

obs foram obtidos como descrito na figura 3A. D) K

obs alterando o padrão em tratamento de congelamento-descongelamento. K

obs é determinada a partir de amostras de soro humano congelado em -80 ° C e descongeladas à temperatura ambiente de 0 a 6 vezes.

Numa tal forma, a curva padrão foi estabelecida medindo RNase a actividade em soluções diluídas em série RNase a, numa gama de concentrações between10

-7 a 10

-1 mg /mL (Figura 3C). Para cada concentração, uma curva cinética foi registada (Figura 3A), e uma curva de referência foi feita de acordo com o calculado K

obs para descrever a relação entre a actividade e a concentração de RNase A. A curva simulado mostrou que a degradação actividade subiu rapidamente quando a concentração de RNase foi aumentada (Figura 3C). Os resultados mostraram que uma relação linear numa gama larga de concentrações de RNase A a partir de 10

-7 a 10

-3 ug /uL. Após a adição de RNase A 10

-7 mg /mL, a intensidade do sinal fluorescente aumentado 1.000 u.a., a relação sinal ruído foi de 2 vezes. O limite de detecção do ensaio de FRET foi de 10

-7 ug /uL. Quando o ensaio de ARNase foi realizada com 1 × 10

-6 ug /ul de ARNase A, a intensidade do sinal fluorescente aumentado de 41.000 A.U. para 58000 u.a., eo barulho neste ensaio foi 500. O ruído de sinal inferior a 1 × 10

-6 mg /mL é de 34 vezes. De acordo com esta relação de ruído de sinal, a gama detectável era tão baixa as1 × 10

-6 mg /mL. A regressão não linear R

2 a 1 × 10

-6 g /l de concentração foi 0,9856. De acordo com a concentração de 1 × 10

-5 ug /mL, a regressão não-linear R

2 foi 0,9945. Por outro lado, a intensidade do sinal fluorescente aumentado de 43.000 A.U. para 78000 u.a., eo ruído de sinal foi de 70 vezes. De acordo com o R

2 e a relação sinal ruído, concluiu-se que a gama de concentrações de RNases que pode ser facilmente medida por esse método devem ser de 1 × 10

-5 a 0,1 ug /ul.

para validar ainda mais este sistema de ensaio, as actividades de RNase foram medidos para amostras de soro humano que tenham sido submetidos a tratamento repetidamente congelamento-descongelamento. Ao congelar as amostras a -80 ° C e descongelamento em gelo durante várias vezes, as actividades de RNase das amostras foram medidas utilizando o método corrente de FRET. Verificou-se que RNase poderia sobreviver vários ciclos de congelamento-descongelamento, sem qualquer perda de actividade, indicando o actual método pode ser usado para amostras clínicas congelados (Figura 3D).

medição soro RNase Actividade em Doentes com Cancro

Com esta medição baseado em FRET da atividade RNase, um conjunto de amostras de soro humano foram estudados, incluindo 55 indivíduos saudáveis ​​e 34 pacientes com câncer que abrangem alguns tipos de câncer comuns. A curva padrão descrito acima foi utilizado para calcular as concentrações de soro de RNase relativas de amostras de soro humano, e, em seguida, a concentração de RNase relativa de doentes com cancro foram comparados com a dos indivíduos saudáveis ​​(média dos controlos normais foi arbitrariamente estabelecido a 100%). Os resultados mostraram que os níveis séricos de RNase foram significativamente regulada para baixo para todos os 7 tipos de tipos de câncer (Figura 4).

actividades Serum RNase foram determinadas para indivíduos saudáveis, bem como 4 pacientes com câncer gástrico, pacientes com câncer de cólon 5 , 5 pacientes do câncer pulmonar, 5 pacientes com câncer de esôfago, 5 pacientes com câncer de rim, 5 pacientes com câncer de útero e 5 pacientes com câncer pancreático. A concentração de RNase de cada amostra de soro foi calculada pela curva padrão e K

obs obtido a partir da equação exponencial simples. A atividade RNase soro relativa de cada paciente com câncer foi quantificada através da normalização da concentração sérica paciente de câncer com a concentração média de amostras de soro de indivíduos saudáveis.

Para confirmar estas observações, as amostras de soro adicionais foram coletadas de pacientes com câncer de mama, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer de colo do útero, cancro da bexiga, cancro do rim e câncer de pulmão, a um tamanho de amostra de 303 pacientes com câncer no total. A avaliação destas amostras demonstraram uma diminuição da regulação dos níveis de RNase séricos em câncer gástrico, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer de colo do útero, cancro da bexiga, cancro do rim e câncer de pulmão (Tabela S1). Não foram observadas alterações evidentes de níveis séricos RNase para pacientes com câncer de mama e pacientes com câncer de cólon. Estes resultados suportado em grande parte as nossas observações anteriores. O câncer gástrico, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer de colo do útero, cancro da bexiga, cancro do rim e câncer de pulmão grupos de pacientes diferiu do grupo saudável com um valor P inferior a 0,001. Em comparação, o valor P para o grupo de câncer de mama foi de apenas 0,0619, mostrando nenhuma diferença óbvia entre o grupo controle (Figura 5). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a sub-regulação de actividade de ARNase de soro é um fenómeno geral em muitos tipos de cancro comuns. Esta observação sugeriu um potencial para RNase específica do local como um biomarcador de câncer comum.

Os níveis séricos de RNase foram quantificados para os indivíduos saudáveis, bem como 37 pacientes com câncer cervical, 37 pacientes com câncer de esôfago, pacientes com câncer 37 de rim, 24 de pulmão pacientes com câncer, 10 pacientes do cancro de bexiga, 21 pacientes com câncer pancreático, 23 pacientes com câncer de ovário, 32 pacientes com câncer de fígado, 27 pacientes com câncer gástrico, 31 pacientes com câncer de cólon, e 24 pacientes com câncer de mama (para mais detalhes de dados, ver Tabela S1).

Houve 32 cancro do fígado testados, a atividade relativa média em comparação com o controlo normal foi de 32,9%, com P 0,0001. Fora das 32 amostras, apenas uma amostra caiu na faixa de atividade de controle. Vinte e sete soro dos pacientes com cancro gástrico foram testadas, a actividade relativa média foi de 38,8%, com P 0,001. Havia 24 pulmão soro de doentes com cancro foram testadas, a actividade relativa média foi de 29,1%, P 0,0001. ‘soro e 35 pacientes com câncer cervical “Trinta e sete pacientes com câncer de esôfago soro, soro de pacientes com câncer 37 de rim e 21 de câncer pancreático foram testadas e mostraram ter um 21,1% com P 0,0001, 20,2% com P 0,0001, 27,6% com P 0,0001, 29,4% com P 0,0001, respectivamente. Havia 23 soros dos pacientes de cancro de ovário foram medidos, a actividade relativa do cancro dos ovários foi de 28,6%, com P 0,0001, e um caso foi caído no intervalo de controlo. Para câncer de bexiga também observamos um caso excepcional que caiu para a faixa normal enquanto a atividade relativa média foi de 29,5%, com P 0,0001. O cancro da mama não compartilhar o padrão-down regulamentada semelhante RNase com todos os outros 10 tipos de cânceres, a atividade relativa de câncer de mama foi de 61,4%, ligeiramente menor do que os indivíduos normais, mas a análise estatística sugeriu que esta diferença pode não ser significativo (P = 0,0619). Uma situação semelhante foi encontrado em pacientes com câncer de cólon estudadas com a RNase relativa média Uma atividade em 54,5% e P . 0,05

Nenhuma diferença nos níveis de soro RNase entre os pacientes com cancro do cólon primários e metastáticos

os níveis de RNase foram reanalisadas em pacientes com cancro do cólon primários ou metastáticos, a fim de explorar se os valores generalizado de actividade de RNase no soro de doentes com cancro do cólon eram devidos à mistura de fases, e se as diferenças actividade de ARNase que pode ser utilizado para discriminar diferentes fases deste câncer. As amostras de soro foram coletadas de pacientes com câncer de cólon primários e metástases para quem as fases de metástase foram determinados pelo exame de biópsia de tecido. Amostras de soro de dez pacientes com metástases do nó de linfa e 10 sem metástases foram recolhidos e analisados, utilizando o ensaio FRET RNase. Os resultados não mostraram diferença entre os dois grupos (Figura 6).

Estas actividades rum RNase de 10 pacientes com câncer de cólon primários e 10 pacientes com câncer de cólon metástase foram quantificados por ensaio FRET.

Discussão

a correlação entre os níveis séricos de RNase e câncer pancreático foi primeiramente relatada por Reddi em 1976. Usando um método óptico, eles mediram o nível de RNase soro, quantificando a sua actividade na poli-C RNA, a não substrato RNase específica [19]. No final dos anos 1970 e início de 1980, radioimunoensaio foi implementado na medição RNase [24], [25] e, em alguns estudos E. coli tRNA foi utilizado para substituir poli-C como substrato de ensaio [26], estas melhorias melhorar a precisão da medição de RNase. Vários estudos têm sido realizados para investigar os níveis de RNase soro em pacientes com carcinoma maligno, tumor benigno, fumante, insuficiência renal e, em particular pacientes com pancreatite e câncer pancreático. Estes estudos no entanto revelou um quadro misto [22], [24]. Embora Funakushi e grupos Kemmer relataram aumento dos níveis de RNase soro em pacientes tanto com câncer de pâncreas e pancreatite [21], [26], grupos REDDI e Warshaw no entanto descobriu que o nível de RNase aumentou apenas em doentes com cancro pancreático [19], [22], enquanto os níveis de RNase soro de pacientes com pancreatite foram a um nível semelhante como controles saudáveis ​​[19], [22]. grupos Mitsuhashi e Kurihara, por outro lado, descobriu que os níveis de RNase soro relacionadas apenas com a idade, tabagismo, bem como algum outro índice fisiológico, incluindo uréia e conteúdo de albumina [25]. Além disso, um estudo recente relatou níveis de RNase séricos elevados em pacientes com diabetes mellitus juvenil [33]. Ainda um outro relatório mostrou que a RNase uma alterou o seu nível de expressão pelo método de micro-arranjo e western blotting durante o desenvolvimento do cancro gástrico [34].

Estas discrepâncias podem ser causados ​​pela complexidade do ensaio de Reddi, por exemplo, a reacção de terminação passo ou os passos de purificação substância. Nestes ensaios, os sistemas de reação foram deixados no gelo por um bom tempo, antes de elevada dose de HClO

4 foi adicionado para parar a digestão. No entanto, em nosso estudo, observou-se que o tratamento banho de gelo não poderia abolir completamente a atividade RNase. Adicional, a purificação de polinucleótido não digerida pode ser mais um passo de complicação para o ensaio de Reddi. Neste passo a centrifugação simples foi usada para remover nucleótidos de di-e tri-nucleótido resultou da digestão com RNase. Este processo, contudo, também pode também remover alguns polinucleótidos mais longos que não foram totalmente digeridos, portanto, leva a atividade sobre-estimado de RNase soro.

Um ensaio de FRET foi utilizado em nosso estudo para gravar a intensidade de fluorescência em tempo real, de modo a evitar o processo de terminação de reacção e o passo de purificação. Registrando as mudanças de sinais de fluorescência em tempo real, e usando uma sonda FRET que tem apenas uma RNase A sítio de clivagem, aparentemente permitiu um cálculo preciso do K

obs para a reação.

No presente estudo, um método baseado em FRET foi criado para medir os níveis de RNase séricos de forma consistente com uma alta sensibilidade para detectar tão baixa quanto 1 × 10

-7 g /RNase mL. Neste estudo, o desempenho de espectrofluorómetro foi sistematicamente optimizada utilizando espectro de Raman da água. Este foi encontrada para melhorar a qualidade da medição e reprodutibilidade entre os testes. Através da aplicação de um volume de reacção de 2 ml, estávamos realmente capaz de medir o nível de RNase soro sem diluição em série, o desvio potencial assim evitado causada por uma diluição de 1,000 vez em outros protocolos.

A re-descoberta do mundo do RNA tem desenhado mais e mais atenção para uma variedade de RNases que funcionam na modificação de ARN e metabolismo. Assim, um método fiável de RNases A detecção pode ser plausível para tais estudos. O ensaio de FRET estabelecida no presente estudo não se limita apenas a medição de RNase em amostras de soro, mas também pode ser usado em muitos outros testes clínicos e análises científicas. Com a interpretação dos resultados, tais como a diminuição observada de RNases uma atividade no soro de certo tipo de pacientes com câncer, um grão de cautela precisam ser tomadas, como não estávamos tomando medicação de pacientes diferentes em conta, e há uma necessidade de determinar se qualquer medicação pode inibir a actividade de ARNase a. O estadiamento de pacientes submetidos a medição de RNase soro é, obviamente, um dos factores mais importantes a considerar antes de se alistar RNase como um biomarcador potencial, e por isso, mais pacientes com cancro em fase inicial deve ser testada para detectar a detecção inicial de diminuição da RNase A actividade .

Materiais e Métodos

Coleta de Amostras Humanos e Declaração de Ética

Este estudo seguiu a Declaração de Helsinki, e conduzida de acordo com os princípios aprovados pela revisão Ética Conselhos de hospital do Câncer, da Academia chinesa de Ciências Médicas (Pequim, China). consentimento informado por escrito foi fornecido para a coleta de amostra e análise posterior. No total, 431 amostras de soro foram recolhidos a partir de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com cancro e analisados ​​no estudo. As características do paciente com cancro foram descritas na Tabela 1. Os soros foram armazenados a -80 ° C após a sua recolha.

Oligonucleótido Síntese e Preparação

Dois oligonucleótidos de ARN complementares e marcado com fluoróforo com sequências de 5′-FAM-AUGAGCCUGAUUU e 5′-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU foram sintetizados e purificados por Takara (Dalian, China). As concentrações do oligonucleótido de ARN foram determinadas medindo a absorção a 260 nm, utilizando um espectrofotómetro Nanodrop. O coeficiente de extinção também foi medida a 260 nm, resultando em 140.860 L /(mol * cm) para o oligonucleótido ARN marcado com FAM e 156900 L /(mol * cm) para o oligonucleótido de ARN marcado com TAMRA. Os dois oligonucleótidos complementares de RNA foram misturados num tampão de hibridação (5 mM Tris-HCl, pH = 7,6, NaCl 10 mM) a uma concentração de 5 uM. A mistura foi incubada a 95 ° C durante 5 min num termociclador, e, em seguida, a temperatura foi diminuída até 5 ° C durante a cada 5 min para permitir a formação de duplex. Os duplexes resultantes foram verificados em um gel de poliacrilamida a 20% e visualizados por coloração com ouro SYBR (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA).

Ensaio FRET

As medições de fluorescência foram realizadas em tampão de FRET (0,01 M de Tris-HCl, pH 7,4, MgCl 0,002

2), utilizando um espectrofluorómetro QuantaMaster 30 (Photon Technology International, Birmingham).

em 2 ml de tampão FRET, 10 nM de ARN duplex foi adicionado sob agitação constante. O comprimento de onda de excitação foi fixado em 480 nm, e o sinal de espectro de emissão foi medida entre 500 e 650 nm. Um aumento na emissão de fluorescência a 515 nm indica a evolução de clivagem de ARN. Um exemplo de dados obtidos é apresentada na Figura 2C.

para a normalização de dados, um siARN intacta 13 pb foi analisada como controlo duplex, e um siRNA completamente clivado foi incluída como um controlo de degradação. As intensidades fluorescentes FAM foram convertidos em relação a degradação através da definição de fundo e de topo intensidades fluorescentes como 0% e 100%. O método de normalização foi indicado na Figura 3. As leituras fluorescentes foram ajustados à equação exponencial simples (linha vermelha) para obter a taxa constante k

obs. degradação por cento em um determinado momento foi calculada como 100 x Af /Af

max (Figura 3A).

para garantir a condição livre de RNase, definimos o comprimento de onda de excitação a 480 nm, e examinaram a emissão entre 500 a 650 nm de substratos intactas. substrato intacto mostra baixo sinal a 515 nm e o sinal de alta a 575 nm, enquanto que os produtos degradados resulta em sinais elevados a 515 nm.

De acordo com a descrição acima, quando a dupla etiquetada 13-pb siARN em 2 ml de FRET tampão misturados com uma solução de soro ou amostras de RNase a, a fluorescência de FAM seria aumentada. A alteração de fluorescência foi monitorizada ao longo do tempo, com comprimento de onda de excitação fixado em 480 nm e emissão a 515 nm. Para a análise cinética de turnover único, a taxa constante k

obs e a amplitude máxima de degradação F

max foi derivada através do ajuste dos dados experimentais com a equação exponencial simples:.

Identificação de RNase locais de clivagem

Para identificar locais de clivagem RNase, produtos de degradação de dsRNA foram extraídos e clonado utilizando como kit de extracção de gel RNA shopping e kit de clonagem da Takara (Kyoto, Japão).